人胚胎脑海马神经前体细胞的分离培养及形态学研究

目的 :从人胚胎脑海马区分离、培养并鉴定神经前体细胞 ,观察其形态学变化。方法 :取胎龄 8～ 12周人胚胎脑海马区细胞 ,用含人表皮生长因子 (h -EGF)、人碱性成纤维细胞生长因子 (h -bFGF)以及人白细胞抑制因子 (h -LIF)的DMEM F12培养液离体培养 ,以 1%胎牛血清 (FBS)和多聚赖氨酸诱导分化 ,倒置显微镜下测量形态指标 ,免疫细胞化学反应分析其神经化学性质。结果 :原代培养中 ,可见许多悬浮生长并渐增大的细胞球 ,以及很少数贴壁生长的成簇或单个细胞。将球吹打传代后 ,又有许多新的细胞球生成。取细胞球诱导分化 ,则见细胞从球迁出、伸出突起并渐分支 ,细胞分别 β -Ⅲtubulin、NF - 2 0 0、GFAP、Galc等免疫细胞化学反应阳性。 结论 :人胚胎脑海马区有神经前体细胞存在 ,离体培养时能分裂增殖和自我更新 ,并能被诱导分化为神经元前体细胞、神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞     

胚胎干细胞源性树突状细胞对同源性神经前体细胞脑内移植耐受诱导

目的:观察脑缺血环境下胚胎干细胞源性树突状细胞(es DCs)能否诱导同源性神经前体细胞(NPCs)的移植耐受。方法:分别自129/svj p CX-e GFP ES-D3诱生NPCs及129/svj ES-D3诱生es DCs。线栓法制作MCAo模型SD大鼠并相应分为预处理组及对照组,术后1周预处理组经尾静脉注射es DCs而对照组注射PBS,两组动物在预处理1周后侧脑室注射NPCs,2周后(MCAo术后4周)免疫组化观察纹状区CD4+、CD8+、ED1+细胞的分布差异,MTT法观察颈部淋巴细胞增殖性(PI),逆转录PCR(RT-PCR)半定量局部IL-10、IFN-γmRNA表达差异,荧光显微镜观察GFP标记NPCs海马存活率。结果:预处理组大鼠,CD4+细胞浸润显著低于对照组(134.7±36.2 vs 198.8±59.6,P0.05),NPCs存活率显著高于对照组(P0.05),但预处理组对ED1+(298.8±75.9 vs 302.2±88.5)、CD8+(145.8±45.4 vs 134.3±39.0)细胞浸润、局部细胞因子mRNA IFN-γ(1.697±0.273 vs 1.829±0.250)、IL-10(1.147±0.260 vs 1.264±0.119)及外周淋巴细胞增长率(PI,1.245±0.211 vs1.331±0.235)无明显影响。结论:es DC可能通过降低局部CD4+细胞反应诱导针对同源性NPCs免疫耐受,尚无确切证据表明细胞因子途径参与该过程,确切的机理尚需更深入研究。     

正常成年大鼠神经元前体细胞的迁移

目的探讨正常成年大鼠脑中神经元前体细胞的迁移路径和迁移特征,为病理状况下的神经元迁移研究提供理论和实验基础。方法将成年大鼠脑组织按冠状位和矢状位行冰冻切片（片厚20μm）,采用免疫组织化学染色技术观察Doublecortin（DCX）免疫阳性细胞的迁移路径以及DCX阳性细胞的迁移特征。结果正常成年大鼠神经元前体细胞的迁移主要有两条路径：一条是从室下区到嗅球的吻侧迁移流,另一条是位于皮层和胼胝体之间的胼胝体周围迁移流。吻侧迁移流中的DCX免疫阳性细胞较规则的有序排列,形态上呈梭形的胞体和单个较长的前导突起,前导突起基本朝向嗅球,细胞大小基本一致：而胼胝体周围迁移流中的DCX免疫阳性细胞胞体呈类圆形,突起的大小、数目和方向多样。结论研究神经元前体细胞的迁移不仅有助于明确其迁移的具体机制,而且有助于控制神经元的迁移和设计有效的治疗策略。     

大鼠胚胎神经干细胞黑质内移植后的存活及分化

目的：观察胚胎神经于细胞脑内移植后的存活及生长分化状况。方法：从孕11d(E11d)大鼠胚胎神经管获取神经上皮细胞，经神经巢蛋白(nestin)染色鉴定干细胞；同时植入同种大鼠黑质内。于移植后7d、14d取脑，用神经元特异烯醇化酶(NSE)、酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化方法检测移植细胞的存活及分化状况。结果：E11d神经管上皮细胞多数呈nestin染色阳性，黑质内移植后增殖形成细胞团并随时间延长而增大。免疫组化染色显示移植细胞团内有NSE及TH免疫阳性细胞。结论：胚胎神经上皮细胞多数为神经干细胞，黑质内移植后可以存活并分化为多巴胺能神经元。     

不同生长因子对人胚胎脑海马区神经干细胞体外生长的影响

本研究比较了不同生长因子对人胚胎脑海马区神经干细胞(NSCs)体外生长的影响。取胎龄8 ~12周的人胚胎脑海马,按基础培养液中生长因子的不同将培养细胞分为:h EGF组、h -bFGF组、h- EGF+h -bFGF组、h -EGF+h LIF组、h- bFGF+h LIF组、h -EGF+h bFGF+h- LIF组,将机械分离的单细胞悬液以2×106 个细胞/ml接种到上述组别,观察各生长因子的作用。结果发现,原代细胞培养6h时,各组细胞情形区别不大;随培养时间的延长,h -EGF+h- bFGF组和h- -EGF+h -bFGF+h- LIF组先形成许多小细胞簇, 7d后,这两组的细胞球数量进一步增加;而h- bFGF+h -LIF组和h- EGF+h -LIF组有较少的细胞球,h bFGF组偶见小细胞球,h- EGF组细胞几乎全部死亡。将培养的h -EGF+h -bFGF+h -LIF组的神经干细胞用1%FBS诱导分化后,行免疫细胞化学鉴定。结果表明,诱导分化12h时,细胞呈RNA 结合蛋白(Musashi1)阳性, 7d时,细胞大部分呈βⅢ管蛋白(βⅢ- tu- bulin)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性,极少数为半乳糖脑苷脂(Galc)阳性。以上结果提示,人胚胎脑海马区NSCs的体外存活增殖必须依赖于h -EGF和h- bFGF的共同作用,而h- LIF对早期培养的人NSCs的影响不明显。     

大鼠海马内移植神经干细胞的存活和迁移

为观察成鼠神经干细胞移植入切割海马伞侧海马和正常侧海马后的存活和迁移状况 ,用无血清培养和单细胞克隆技术获取成年 SD大鼠前脑室下带组织的神经干细胞 ,并用 Brd U标记、扩增。在切割 SD大鼠右侧海马伞术后 14 d,将标记有 Brd U的神经干细胞植入双侧海马齿状回中。分别于术后 1周、2周、1个月和 2个月时取脑、冰冻切片 ,进行 Nissl染色和 Brd U免疫荧光检测。结果发现 ,1周和 2周时移植细胞主要围绕在移植点周围 ;1个月和 2个月时 ,移植细胞沿着海马齿状回颗粒下层迁移排列成条带。在所有的脑组织切片中 ,切割海马伞侧海马内移植细胞的密度均明显地大于正常侧海马内的移植细胞密度 ,且切割海马伞侧海马内 Nissl深染的大胞体神经元样细胞明显地多于正常侧。提示 ,移植至海马齿状回中的神经干细胞可存活并可沿海马齿状回颗粒下层迁移 ;切割海马伞侧海马中存活和迁移的神经干细胞密度大于正常侧者 ,可能与某种物质的表达增加有关     

胆碱能前体细胞移植入β-淀粉样前体蛋白转基因小鼠脑内的存活和迁移

目的 观察新生小鼠海马原代培养的胆碱能神经前体细胞移植人淀粉样前体蛋白(amyloid precusor protein,APP)转基因小鼠脑内以后的存活和迁移状况,以探索胆碱能神经前体细胞对阿尔茨海默病的治疗前景.方法 取新生24h以内增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转基因小鼠,以原代细胞分离培养方法获得海马胆碱能神经前体细胞,以前体细胞特异性标记抗巢蛋白(Nestin)和胆碱能细胞特异性标记胆碱乙酰基转移酶(cholineacetyltransferase, ChAT)做细胞免疫组化鉴定细胞特性.细胞培养成功后,收集细胞,在小鼠脑立体定位仪的固定下,参照小鼠脑立体定位图谱对APP转基因小鼠施行脑内注射.移植1周以后灌注取移植鼠脑组织行冰冻切片,在共聚焦显微镜下通过外源细胞的绿色自发荧光观察移植细胞的存活和迁移情况.结果 在移植位点,外源性绿色荧光细胞存活良好并以移植点为中心向外迁移,且呈继续迁移的趋势.结论 新生小鼠海马原代细胞培养以后呈现神经前体细胞的特性并且胆碱能阳性,移植入APP转基因小鼠脑内以后,这些胆碱能阳性的神经前体细胞存活良好并呈现较强迁移能力,为进一步探索该细胞对阿尔茨海默病的治疗可能性提供了依据.     

胚胎干细胞源性神经前体细胞移植脑缺血大鼠局部细胞的免疫反应

背景：神经前体细胞的免疫原性各家研究结果不一,尤其是体内移植后的机体免疫反应模式需要进一步研究。 目的：体外观察神经前体细胞组成型及诱导型主要组织相容性抗原表达情况;体内观察神经前体细胞移植入大鼠脑缺血组织后局部免疫细胞活化情况,探讨神经前体细胞的移植排斥可能性及模式。 方法：自pCX-hrGFP ES-D3胚胎干细胞诱导分化神经前体细胞,流式细胞术体外检测主要组织相容性抗原Ⅰ,Ⅱ类分子表达及γ-干扰素诱导前后表达变化。实验分3组,磷酸盐缓冲液组、神经前体细胞组分别于大脑中动脉缺血大鼠模型造模后经侧脑室给予磷酸盐缓冲液注射及神经前体细胞移植,假手术组不造模。免疫组化法观察纹状区ED1+、CD4+、CD8+细胞浸润情况;淋巴细胞再刺激增殖实验观测神经前体细胞诱导移植大鼠颈部淋巴细胞的增殖指数。 结果与结论：神经前体细胞组成型高表达主要组织相容性抗原Ⅰ类分子,几乎不表达主要组织相容性抗原Ⅱ类分子;经γ-干扰素诱导后,主要组织相容性抗原Ⅰ类分子进一步上调,主要组织相容性抗原Ⅱ类分子亦有轻度上调,提示神经前体细胞有可能引起机体免疫反应。移植实验表明,与假手术组相比,磷酸盐缓冲液组及神经前体细胞组均表现强烈的ED1+、CD4+、CD8+细胞浸润(P < 0.05),说明脑缺血损伤本身能导致局部免疫细胞活化;神经前体细胞组比磷酸盐缓冲液组有更强的ED1+、CD4+细胞浸润(P < 0.05),提示神经前体细胞移植可能导致局部免疫更进一步活化,且以CD4+T细胞反应为主。磷酸盐缓冲液组及神经前体细胞组神经前体细胞诱导下的增殖指数值均较假手术组升高(P < 0.01),但前两组增殖指数值比较差异无显著性意义(P > 0.05),提示脑组织局部炎症导致颈部淋巴细胞增殖性增加,而离体神经前体细胞不足以单独刺激致敏淋巴细胞增殖。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

大鼠胚胎神经上皮细胞脑内移植治疗帕金森病的实验研究

目的 观察大鼠胚胎神经上皮细胞植入帕金森病大鼠纹状体后的存活、分化情况及治疗作用。方法 孕11d大鼠剖腹取胚胎,剥离神经管,胰酶消化后获取神经管壁上的神经上皮细胞,在脑立体定位仪下植入帕金森病大鼠毁损侧纹状体内,于移植后不同时间诱发旋转实验,观察症状的改善,并灌注取脑,切片后做酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色,检测胚胎神经上皮细胞的存活及分化状况。结果 胚胎神经上皮细胞脑内移植后,帕金森病鼠的旋转行为有明显改善。移植后2、4及8周时可检测到成片或散在的TH-免疫阳性细胞。结论 胚胎神经上皮细胞移植至帕金森病大鼠纹状体后,可分化为多巴胺能神经元并能改善旋转症状。     

大鼠胚胎神经上皮细胞侧脑室移植后存活及分化的实验研究

目的：观察大鼠胚胎神经上皮细胞同种脑移植后的存活及生长分化状况。方法：孕12d大鼠剖腹取胚胎，剥离神经管，胰酶消化后获取神经管壁上的神经上皮细胞，然后植入其父体侧脑室中，分别于移植后10d,14d,21d,28d灌注取脑，肜HF染色及神经元特异烯醇化酶（NSE），胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组织化学方法检测胚胎神经上皮细胞移植后的存活及分化状况。结果：神经上皮细胞侧脑室移植后多贴附于脑室壁形成细胞团块，有的随脑脊液循环至第三脑室生长，随时间延长移植物增大，HE染色见脑室内有成团的移植细胞，免疫组织化学染色显示移植细胞团内既有NSE－免疫阳性细胞，也有GFAP－免疫阳性细胞，移植物周围多为GFAP－免疫阳性细胞。结论：胚胎神经上皮细胞侧脑室移植后能够贴附脑室壁存活，并能分化为神经元和神经胶质细胞。     

培养胚胎神经干细胞移植入纹状体后的形态学观察

本研究的目的是 :将体外培养的小鼠胚胎大脑皮层和脊髓的神经干细胞经单细胞悬液微移植后观察其在大鼠纹状体的存活、迁移和分化的状况。实验在无血清条件下将这些细胞扩增、培养再经活细胞荧光染料 Di I标记后 ,采用微移植的方法 ,通过脑立体定位仪上用微玻璃针将干细胞分别植入成年大鼠双侧纹状体的对称部位。大鼠存活 8周后 ,经灌注固定、恒冷箱切片 ,在荧光显微镜下观察标记的移植细胞的迁移状况 ;用星形胶质细胞特异性抗体观察移植区 GFAP的表达 ,以显示移植细胞分化状况。结果表明 :来源于胚胎小鼠大脑皮层和脊髓的体外培养神经干细胞经微移植后 ,均可在成年大鼠脑内纹状体区域存活 ,移植的神经干细胞可向周围的脑实质内迁移 ,迁移细胞沿特定的纹状体结构分布。神经干细胞主要分化成星形胶质细胞。本实验结果提示 ,移植的神经干细胞可在脑实质内存活、迁移和分化。     

小鼠胚胎干细胞植入大鼠脑内分化的研究

观察小鼠胚胎干细胞植入大鼠隔区和海马内之后的分化状况。以 SD大鼠为宿主 ,将胚胎干细胞移植入宿主隔区和海马内 ,移植后在 l、2、3、4和 8周取脑 ,冰冻切片 ,进行 Nissl染色和 M6、NSE、GFAP免疫组织化学反应。胚胎干细胞移植入大鼠隔区和海马之后 ,从第 2周开始表达 M6、GFAP、NSE等抗原 ,持续至第 4周 ,主要位于移植区内 ,较少迁移。小鼠胚胎干细胞移植入大鼠隔区和海马内之后 ,分化为神经元和神经胶质细胞     

离体培养的生后大鼠脑室下层神经元前体细胞免疫细胞化学和形态学研究

为了探讨生后大鼠脑室下层神经元前体细胞离体培养时的神经活性物质特征和形态学特征 ,本研究以细胞特异性的抗体进行免疫细胞化学反应并测量了这些细胞的形态学指标胞体平均直径和胞体椭圆率 (胞体最小径与最大径的比值 )。取脑室下层细胞接种于覆有多聚赖氨酸的 2 4孔培养板 ,培养液为 Neurobasal Medium( Gibco) /B2 7,培养条件为 5 % CO2 ,3 7℃。结果如下 :在培养 1d时 ,绝大多数 (大于 90 % )脑室下层源细胞呈 β-3型微管蛋白阳性 ,且这些细胞也都表达多唾液酸神经粘连分子。此时 ,大多数β-3型微管蛋白阳性细胞胞体呈椭圆形 (胞体平均直径为 8.42± 1.0 3μm;胞体椭圆率为 0 .5 7± 0 .12 ) ,且在其两极各长出一短的、无分支的突起 ;并有近 2 0 %者为球形无突起细胞 (胞体平均直径为 7.2 0± 1.0 4μm) ,且它们大多呈细胞与细胞相连接状态。随着培养时间的延长 ,这些细胞亦呈上述椭圆形有突起样细胞变化 ,但仍可见它们呈串珠样连接。培养至第 3～5 d,这些脑室下层源细胞的体积增大 (胞体平均直径为 9.0 7± 1.0 7μm)、突起较前增长但仍几无分支。免疫细胞化学反应显示 ,此时培养中的脑室下层源细胞仍大多呈β-3型微管蛋白阳性和多唾液酸神经粘连分子阳性。至培养的第 7d,这些β-3型微管蛋白阳性     

成年大鼠活体嗅粘膜原代培养细胞中神经干细胞的生长特性及形态学观察

为建立成年活体嗅粘膜神经干细胞的简便、实用的体外培养方法 ,进而为神经干细胞自体移植治疗中枢神经系统损伤的研究提供更为安全的候选细胞 ,本实验自成年大鼠活体分离剪取部分嗅粘膜经胰酶消化制成细胞悬液 ,接种于玻璃培养皿 ,用含 10 %胎牛血清的 F12培养基培养 ,动态观察神经干细胞克隆球的形成及分化过程 ,并用 nestin、NSE、GFAP、vim entin及laminin等抗体作免疫细胞化学染色 ,对阳性细胞进行形态学鉴定。结果显示 ,成年大鼠经嗅粘膜活体取材后 ,可长期存活。成体嗅粘膜细胞混合体外培养时不同类型细胞的贴壁时间存在差异 ,神经干细胞呈球形 ,不直接贴附于培养皿 ,仅粘着在首先贴壁的扁平基底细胞上分裂形成克隆球 ,球内细胞 nestin免疫细胞化学染色阳性。原代培养 14 d后克隆球不再生长 ,球周细胞逐渐向外迁移分化为嗅细胞和嗅鞘细胞。提示 ,成体嗅粘膜神经干细胞可在普通培养基中形成干细胞克隆球 ,嗅粘膜中的其它细胞作为神经干细胞的基底饲养细胞有助于干细胞克隆球的形成 ;活体分离成体嗅粘膜作混合细胞体外培养获取神经干细胞的方法简便、安全、可行 ;本结果为嗅粘膜神经干细胞自体移植治疗中枢神经系统损伤的可行性研究提供了动物实验资料。     

大鼠胚胎脑和脊髓神经干细胞分化特性比较

体外分离大鼠胚胎脑和脊髓神经干细胞,经培养传代后,撤除生长因子(bFGF和EGF)并给予 1%胎牛血清促其自然分化,然后比较两者的分化规律,以及传代次数对分化的影响。结果发现:在完全相同的培养条件下,来源于脑和脊髓的神经干细胞均可分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞,但两者分化为神经元的能力均随细胞体外传代次数的增加而显著下降 (P<0. 05);此外,脑来源的神经干细胞分化为神经元的能力远高于脊髓来源的神经干细胞 (P<0. 01)。提示,来自中枢神经系统不同部位的神经干细胞在分化潜力上存在差别,体外传代会影响神经干细胞的分化能力。     

新生大鼠海马源性神经干细胞的分离培养及其向胆碱能神经元定向诱导分化研究

本研究目的是从新生SD大鼠海马分离、培养神经干细胞并诱导其向胆碱能神经元方向分化。利用含b FGF(20ng/ml)和B27的无血清DMEM/F12培养基培养新生SD大鼠海马分离的具有自我更新和多向分化能力的细胞群,用免疫细胞化学技术检测巢蛋白(nestin),并于分化后分别检查特异性成熟神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的标记抗原β微管蛋白(Tuj1 )、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(Galc)的表达;用鸡胚骨骼肌提取液,诱导神经干细胞向胆碱能神经元方向分化。结果显示:从海马分离的细胞群具有自我更新能力,表达nestin,分化成熟后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原;与对照组3. 9%相比,鸡胚骨骼肌提取液可以诱导这些细胞中的9. 6%分化成为胆碱能神经元。提示分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,是中枢神经系统的干细胞;在加有鸡胚骨骼肌提取液的培养基诱导下,能向胆碱能神经元方向分化。     

大鼠脑的神经干细胞的体外培养、增殖和分化

采用无血清培养基分离和培养大鼠脑的神经干细胞,并通过免疫荧光细胞化学技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向分化潜能的鉴定。鉴定结果表明,所分离培养的细胞为大鼠神经干细胞,具有神经干细胞的特征,并可在体外大量增殖和较长期培养,可经诱导分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞,是进行诱导分化的良好细胞模型。本文讨论了神经干细胞传代培养中应予以注意的问题和对策。     

体外诱导的皮肤源性神经干细胞在大鼠受损伤脊髓内的存活、分化和迁移

目的探讨经体外诱导的皮肤源性神经干细胞能否在大鼠脊髓半横断损伤处存活、迁移和分化.方法应用转染绿色荧光蛋白基因新生大鼠的皮肤在体外经分离细胞、培养、诱导增殖以及用免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞等过程,将诱导产生的皮肤源性神经干细胞移植入大鼠脊髓半横断损伤处,30 d和60 d后用免疫细胞化学染色法观察移植细胞的存活、迁移和分化.结果皮肤分离细胞在培养10 d时,呈悬浮生长的细胞已增殖成若干细胞球,并呈nestin免疫细胞化学阳性染色,表明是神经干细胞球.在体内可观察到脊髓损伤处有许多带有绿色荧光的移植皮肤源性神经干细胞,有些还迁移到较远的宿主脊髓组织内.存活的移植细胞有些呈现nestin阳性、MAP2阳性及GFAP阳性.结论经体外诱导的皮肤源性神经干细胞能够在受损伤的大鼠脊髓内存活、迁移并分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞.