人胰腺癌细胞株放射敏感性的体外研究

目的通过体外实验探讨人胰腺癌细胞株的放射敏感性。方法培养人胰腺癌细胞株SW1990、Capan-1、AsPC-1、MIAPaCa-2、PANC-1、P3，应用集落形成实验测定胰腺癌细胞在6MVX线不同剂量照射后的存活分数，计算各株细胞的放射生物学参数。结果胰腺癌细胞株MIAPaCa-2对放射治疗最敏感，SF2为0．388，而Capan-1对放射治疗最不敏感，SF2为0．758，MIAPaCa-2与As-PC-1、AsPC-1与SW1990之间的放射敏感性无显著差异，其余各株胰腺癌细胞之间存在显著差异。结论不同胰腺癌细胞株的放射敏感性存在差异。     

肺耐药蛋白在胰腺癌细胞中的表达及意义

目的探讨肺耐药蛋白(lungresistanceprotein,LRP)在胰腺癌细胞株中的表达及意义。方法采用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法检测8株胰腺癌细胞株(SW1990、PCT-2、PCT-3、PCT-4、Aspc-1、Capan-1、Mia-PaCa-2及Panc-1)中LRP在基因水平和蛋白水平的表达。结果RT-PCR结果显示,在胰腺癌细胞株PCT-2中未检测到LRPmRNA的表达,在PCT-4、Aspc-1和Panc-1中,LRPmRNA表达条带较强;在SW1990、PCT-3、Capan-1和Mia-PaCa-2中LRPmRNA表达条带较弱;半定量平均表达水平为0.56±0.33。免疫细胞化学结果证实,在PCT-2细胞中无LRP蛋白表达,PCT-3细胞中LRP蛋白弱表达,SW1990、Aspc-1和Capan-1细胞中LRP蛋白中度表达,而在PCT-4、Mia-PaCa-2和Panc-1细胞中可见LRP蛋白的过度表达。结论在胰腺癌细胞中存在LRP的先天性表达,LRP过表达可能是介导胰腺癌细胞先天性耐药的重要机理之一。     

三苯氧胺对人胰腺癌细胞mdr1基因表达逆转作用的实验研究

目的：研究三苯氧胺（TAM）对入胰腺癌细胞mdr1基因表达的逆转作用。方法：TAM和5-Fu作用于入胰腺癌细胞株（Capan-Ⅱ、SW1990），用MTT法测定细胞增殖的情况，流式细胞仪检测mdr1基因蛋白表达的变化，RT-PCR检测mdr1基因mRNA的变化。结果：高剂量的TAM对ERa阳性的Capan-Ⅱ细胞有抑制作用，TAM可以逆转Capan-Ⅱ细胞和T47D细胞中mdr1蛋白和mRNA表达。结论：高剂量的TAM对ERa阳性的Capan-Ⅱ细胞有抑制作用，可以逆转mdr1的表达。     

白细胞介素6对人胰腺癌细胞上皮间质转换的影响及机制探讨

目的 应用白细胞介素6(IL-6)作用于人胰腺癌细胞株SW1990、Capan-2和沉默STAT3基因的SW1990细胞,观察细胞上皮间质转换相关基因的变化并探讨其机制.方法 使用IL-6作用人胰腺癌细胞株SW1990、Capan-2和沉默STAT3基因的SW1990细胞.MTT法检测细胞增殖.荧光定量PCR、Real-time PCR、Western blot检测STAT3、p-STAT3、Snail、Twist和E-cadherin基因mRNA和蛋白表达.体外侵袭实验检测细胞的侵袭能力.结果 100μg/L IL-6作用人胰腺癌细胞株后,细胞增殖能力增强(P＜0.05).Western blot显示P-STAT3的表达增加;荧光定量PCR、Real-time PCR、Western blot显示Snail mRNA和蛋白表达明显升高(P＜0.05);E-cadherinmRNA和蛋白表达明显降低(P＜0.05);细胞侵袭能力增强.而IL-6作用沉默STAT3基因的SW1990细胞,Snail和E-cadherin mRNA和蛋白表达均无明显改变.结论 IL-6可能通过激活STAT3信号转导通路,上调Snail和下调E-cadherin基因表达,促进胰腺癌细胞上皮间质转换,进而增强侵袭能力.     

胰腺癌细胞对5—Fu和吉西它滨获得性耐药后bcl—XL和mcl—l表达的变化

目的：探讨胰腺癌细胞对5－Fu和吉西它滨的获得性耐药后bcl-XL和mcl-l表达的变化。方法：应用SRB方法检测5－Fu和吉西它滨对胰腺癌细胞株Panc-1,Mia-Paca-2和Capan-1的细胞毒性作用，应用Western blot法来检测bcl-XL和mcl-l的蛋白表达水平。结果：5－Fu和吉西它滨对3株胰腺癌细胞均产生了细胞毒性作用，5－Fu长期作用后，Capan-1细胞IC50上升了2．1倍（P＜0．05）。吉西它滨长期作用后，Capan-1细胞IC50上升了1．5倍（P＜0．05）。5－Fu或吉西它滨长期作用后，产生了获得性耐药的胰腺癌细胞bcl-XL和mcl-1表达水平上调。结论：5－Fu或吉西它滨长期作用后，产生了获得性耐药，这种耐药与bxl-XL和mcl-l的过度表达相关。     

葡萄糖神经酰胺合成酶基因在人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株中的表达和意义

目的探讨葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase,GCS）基因在人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株中的表达和意义。方法体外培养人胰腺癌细胞SW1990和其耐药亚株SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM,以细胞活性测定（CCK-8法）检测耐药亚株的耐药指数,相对定量荧光实时PCR（RT—PCR）法检测GCS mRNA的表达,免疫印迹法检测GCS蛋白表达水平。结果与亲本株相比,SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM的耐药指数分别为339．7、11．9、56．6。RT—PCR和免疫印迹检测结果显示亲本株和耐药亚株均有GCS mRNA和蛋白的表达,GCS mRNA在3株耐药亚株中的表达均比亲本株有增高趋势,且SW1990／ADM、SW1990／GEM的GCS蛋白表达水平较亲本株升高,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论GCS基因在人胰腺癌细胞株SW1990和其3株耐药亚株中表达阳性,GCS蛋白在SW1990／ADM、SW1990／GEM中呈高表达,表明GCS可能参与胰腺癌耐药株细胞对ADM、GEM的耐药。     

三苯氧胺对人胰腺癌细胞抑制作用机制的研究

目的探讨三苯氧胺（TAM）对人胰腺癌细胞的抑制作用机制。方法分别采用MTT比色分析法、流式细胞仪及RT-PCR技术检测TAM对人胰腺癌细胞株（Capan-Ⅱ，SW14990）和乳腺癌细胞株（T47D）中的细胞增殖、p53蛋白表达及p53mRNA的影响。结果高剂量的TAM对胁阳性的Capan-Ⅱ细胞有抑制作用，引起Capan-Ⅱ细胞p53蛋白表达降低。结论高剂量的TAM对ERa阳性的Capan-Ⅱ细胞有抑制作用，可能与降低p53表达有关。     

胰腺癌细胞株耐药与凋亡相关基因的改变

目的探讨凋亡相关基因的改变与胰腺癌细胞耐药的关系。方法利用含有18000条人类基因的cDNA基因芯片对人胰腺癌细胞株SW1990及其耐药细胞亚株SW1990/FU和SW1990/ADM间的差异表达基因进行筛选。结果人胰腺癌细胞株SW1990与耐药细胞亚株SW1990/FU和SW1990/ADM间的共同差异表达基因有170条,其中6条与细胞凋亡相关。结论凋亡相关基因hSiah2、TIA1、CDC2、PDCD2、MAPK6及MAP4K3可能参与了胰腺癌耐药过程的发生,可能成为新的胰腺癌耐药相关基因。     

多药耐药相关基因及其蛋白在介导胰腺癌细胞原发性耐药中的作用及调控

目的 检测多药耐药相关基因（MDR1）及其蛋白（P-gP）在胰腺癌细胞株的表达,初步探讨胰腺癌发生先天性耐药的机理。方法 选择8株人胰腺癌细胞株,采用RT-PCR方法检测MDR1mRNA在胰腺癌细胞中的表达;通过免疫细胞化学方法检测P-gP的表达;以流式细胞仪检测胰腺癌细胞对罗丹明的外排情况,评价P-gP泵功能;最后通过P-gP抑制物维拉帕米与化疗药物联合应用,检测其对胰腺癌细胞的杀伤作用。结果 MDR1mRNA在胰腺癌细胞株SW1990中的表达最高,除PCT-2未检测到MDR1的表达外,其余6株细胞均有MDR1的微弱表达;免疫细胞化学染色结果证实P-gP在SW1990中的表达明显高于其他细胞株。57．9％±5．4％的SW1990细胞内有罗丹明蓄积,而在P-gP阴性对照细胞中,99．5％±3．3％的细胞内存在罗丹明的积聚,两者差异有统计学意义（P〈0．05）。P-gP抑制物维拉帕米与阿霉素或表阿霉素联合应用时可以部分逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。结论 MDR1及P-gP在人胰腺癌细胞中存在一定量的表达;维拉帕米联合阿霉素可以明显抑制P-gP阳性细胞的生长。     

金属硫蛋白与人胰腺癌细胞耐放射性的关系初步探讨

目的探索金属硫蛋白（MT）表达水平与胰腺癌细胞放射敏感性的关系。方法分别采用外源性锌离子及反义寡聚核酸（AS）转染P3、Pan-1、MIA、SW1990、Cap、ASPC等6株胰腺癌细胞，调节MT表达，随后应用ELISA及集落实验检测MT表达水平及放射敏感性指标存活分数（SF2）的变化。结果与亲本株相比，经锌离子刺激后，P3、Pan-1、MIA、SW1990及Cap等5株胰腺癌细胞MT表达增高1．98-31．17倍（P〈0．05），SF2增高5．1％-26．5％（P〈0．05）；ASPC经锌离子诱导后MT表达及耐放射性增高均不明显（P〉0．1）。应用AS转染后，P3、Pan-1、MIA、SW1990、Cap、ASP（；等6株胰腺癌细胞MT表达降低1．05～26．6倍（P％0．05），SF2降低3．6％～16．7％（P〈0．05）。结论MT表达水平与胰腺癌细胞耐放射性有明显相关性。     

应用基因芯片技术筛选胰腺癌多药耐药相关基因

目的应用基因芯片技术筛选胰腺导管腺癌（PDAC）获得性多药耐药（MDR）相关基因。方法通过含人类全基因组的寡聚核苷酸基因芯片（Affymetrix HG U133 2．0plus）筛查人胰腺癌细胞株SW1990与多药耐药细胞亚株SW1990／5-FU,SW1990／ADM和SW1990／GEM之间的表达基因差异,并进行生物信息学分析。结果与亲本株SW1990相比,3株耐药细胞亚株中表达均有差异的基因共有165条;其中上调表达基因43个,下调表达基因122个。差异表达基因的功能分类包括：抗氧化还原、细胞凋亡、细胞周期、信号转导、细胞黏附相关的基因等。聚类分析发现差异基因中的PRDX4簇、TNKS2簇及CCDC5簇可能与耐药发生密切相关。结论胰腺癌对化疗的多药耐药是复杂的多基因作用的结果。本试验初步建立了胰腺癌多药耐药发生相关的总体基因表达改变图谱,为胰腺癌多药耐药发生机制的研究提供了新的靶点。     

胰腺癌阿霉素耐药细胞株SW1990/ADM的建立及其耐药机理研究

目的　建立人胰腺癌阿霉素 (ADM )耐药细胞株SW 1990 /ADM ,探讨其耐药机理。方法　采用ADM体外浓度梯度倍增法诱导培养人胰腺癌细胞株SW 1990 10个月 ,获得耐药细胞株SW 1990 /ADM ,脱药培养 2个月后检测其生物学性状、药物敏感性及多药耐药基因mdr1的功能及表达情况。结果　与亲本细胞株SW 1990相比 ,SW1990 /ADM在形态学上发生了一系列变化 ;对包括ADM在内的多种化疗药物均表现出一定的耐药性 ,其对ADM、丝裂霉素、氟尿嘧啶和健择的耐药指数分别达到 4 9.6 0、7.2 5、3.80和 1.2 5 ;其mdr1mRNA的表达亦明显高于亲本细胞株SW 1990 (P<0 .0 1)。结论　体外浓度梯度倍增法可建立稳定传代的人胰腺癌耐药细胞株SW1990 /ADM。其耐药性与mdr1的表达呈正相关。     

消化道肿瘤淋巴结转移灶多药耐药性的变化及其意义

目的探讨消化道肿瘤淋巴结转移灶多药耐药性（MDR）的变化。方法对55例胃癌、大肠癌原发灶及相应淋巴结转移灶分别进行MDR相关蛋白（MRP）、P-糖蛋白（gp）、DNA拓扑异物酶（Topo）Ⅱα、谷胱甘肽S转移酶（GST）-n免疫组织化学染色，比较二病灶间诸指标表达程度的差异。结果原发灶与淋巴结转移灶比较：（1）两者的MRP、P-gp、TopⅡα、GST-n表达一致率分别为32．7％、40．0％、45．5％、50．9％；（2）P—gp、GST-n阳性表达差异均有统计学意义（P〈0．01）；（3）中高分化腺癌的MRP、TopⅡα阳性表达差异均有统计学意义（P〈0．01，P〈0．05），低分化腺癌仅GST-n阳性表达差异有统计学意义（P〈0．01）。中高分化腺癌与低分化腺癌比较：原发灶中TopⅡα阳性表达、转移灶中MRP及TopⅡα阳性表达差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论消化道肿瘤淋巴结转移灶存在MDR的异质性变化，肿瘤原发灶的耐药基因相关蛋白表达水平不能预测淋巴结转移灶的MDR。     

维拉帕米逆转胰腺癌化疗耐药的研究

目的　探讨多药耐药蛋白P 170拮抗剂维拉帕米对胰腺癌细胞株化疗耐药的逆转作用。方法　采用RT PCR法对胰腺癌细胞株SW 1990和CAPAN 1中多药耐药基因MDR1mRNA的表达进行半定量分析 ;罗丹明外排试验检测胰腺癌细胞株中P 170的功能 ;MTT比色法评估胰腺癌细胞株对化疗药物的敏感性 ,并比较单纯化疗与化疗联合维拉帕米对其的疗效差异。结果　RT PCR检测结果显示MDR1mRNA在SW 1990中的表达丰度为 0 5 75 0± 0 0 76 4 ,在CAPAN 1中的表达丰度为 0 186 4± 0 0 5 36 ,两者具有显著差异 (P <0 0 1)。罗丹明外排试验表明 :SW1990阳性细胞百分数明显低于CAPAN 1(P <0 0 1) ;维拉帕米可使SW 1990阳性细胞百分数明显增加 (P <0 0 1)。MTT结果表明 :SW1990较CAPAN 1对ADM、MMC耐药 ;维拉帕米可部分逆转其对ADM和MMC的耐药性。结论　MDR1可能参与胰腺癌细胞株化疗耐药 ;中等剂量的维拉帕米联合化疗可逆转具有MDR1表型的人胰腺癌细胞株对ADM和MMC的耐药现象。     

藤黄酸逆转人结肠癌细胞株SW480奥沙利铂耐药性的作用及机制研究

目的探讨藤黄酸对多药耐药人结肠癌细胞株SW480/L—OHP的耐药逆转及其对多药耐药基因（MDR1）和P-糖蛋白（P—gP）表达的影响。方法采用逐步增加药物浓度的方法建立奥沙利铂耐药结肠癌细胞株SW480/L—OHP。噻唑蓝（MTT）法测定SW480/L-OHP细胞株的耐药指数和藤黄酸在无细胞毒浓度下对结肠癌细胞耐受奥沙利铂的逆转作用,流式细胞术检测细胞凋亡、周期变化,RT—PCR检测各组细胞MDRlmRNA表达水平,Westernblot检测各组细胞P—gP蛋白的表达水平。结果藤黄酸对结肠癌SW480及SW480/LOHP细胞增殖均具有抑制作用,且呈量效关系。奥沙利铂与低毒剂量藤黄酸共同作用SW480/L-OHP细胞,其Ic50显著降低（P〈0．05）,耐药逆转倍数为3．72。与奥沙利铂单药组相比,加入低毒剂量藤黄酸后,细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义（P〈0．05）。藤黄酸作用后MDRlmRNA转录水平降低,同时下调了P—gp蛋白表达。结论藤黄酸部分逆转SW480/L—OHP细胞对奥沙利铂的耐药性,其机制与增加细胞内奥沙利铂的蓄积,抑制MDRl基因的表达及降低P—gp的表达有关。     

胰腺癌GST—π耐药基因表达及意义

目的 检测胰腺癌组织中GST－π耐药基因的表达及其临床意义。方法 采用S－P免疫组织化学方法对150例异常和正常胰腺石蜡切片组织标本（包括原发性胰腺癌97例，胰腺炎32例和正常胰腺组织21例）进行GST－π耐药基因蛋白表达检测。结果 GST－π耐药基因在胰腺癌、胰腺炎和正常胰腺组织中阳性率分别为67％、15．6％和14．3％；胰腺癌组织中GST－π阳性率明显高于其他组织（P＜0．05）。胰腺癌高分化组织中GST－π耐药基因表达也明显高于低分化组织（P＜0．05）。GST－π耐药基因表达与胰腺癌病人的性别、年龄、肿瘤的部位、大小、侵袭性及临床分期等指标无关（P＞0．05），GST－π耐药基因表达阳性病人平均术后生存时间长于GST－π阴性病人。结论 GST－π可能参与胰腺癌的早期癌变过程，并在维护肿瘤的特性中起到一定的作用，GST-π 基因有可能成为胰腺癌的早期肿瘤酶标记物；GST－π耐药基因与胰腺癌的“天然性多药耐药”和肿瘤生物学特性有关，它是指导肿瘤化疗和预后的一个重要指标。     

耐药胰腺癌细胞株对放射敏感性影响的初步探讨

目的初步探讨耐药胰腺癌细胞株的耐药性对其放射敏感性的影响。方法选取人胰腺癌细胞株SW1990经氟尿嘧啶（5-FU）、阿霉素和吉西他滨诱导后建立三株耐药细胞亚株（SW1990／FIL1、SW1990／ADM、SW1990／GZ）,通过流式细胞仪及直线加速器照射后进行细胞周期及放射生物学相关参数检测。结果细胞周期分析显示,与亲本株SW1990相比,SW1990／FU与SW1990／Gz的Go／G。期比例增高,G2／M期比例明显降低;SW1990／ADM各细胞周期百分比变化不大。集落实验结果表明,与亲本株SW1990相比,SW1990／FU及SW1990／GZ的存活分数（sir2）分别升高26．9％（P＜0．01）和14．4％（P＜0．01）,差异有统计学意义;SW1990／ADM的sir2升高1．1％,差异不明显。结论耐药胰腺癌细胞株的耐药性对其放射敏感性具有一定影响,胰腺癌耐药细胞株放射敏感周期G2／M期比例降低,从而导致其放射敏感性降低,耐放射性增加。     

肾上腺皮质肿瘤中PCNA p27和TOPOⅡα的表达与其生物学行为的关系

目的：探讨肾上腺皮质肿瘤中增殖相关的抗原p27、细胞增殖核抗原（PCNA）、DNA拓扑异构酶2（TOPOⅡα）的表达水平与肿瘤生物学行为间的关系。方法：免疫组化SP法。结果：与肾上腺皮质腺瘤相比，在肾上腺皮质腺癌中p27的表达减少（P〈．01），PCNA和TOPOⅡα的表达增多（P〈0．01）。在正常组和腺瘤组间三个指标的表达均无显著性差异（P〉0．05）。PCNA与TOPOⅡα的表达呈正相关，两者与p27的表达均呈负相关。结论：p27的表达减少和PCNA、TOPOⅡα的表达增多可作为判断肾上腺肿瘤的恶性程度的参考指标。三者联合检测对评价肾上腺皮质肿瘤的生物学行为有重要意义。     

Grb2在胰腺癌中的表达及其意义

目的：探讨生长因子受体结合蛋白2（Grb2）在胰腺癌中的表达及其意义。 方法：分别采用real-time PCR和Western blot方法检测6种胰腺癌细胞株中Grb2基因和蛋白表达水平;采用组织芯片检测80例胰腺癌组织及癌旁胰腺组织中Grb2的表达情况,并分析Grb2表达状态与胰腺癌患者临床病理特征的关系。 结果：Grb2的mRNA与蛋白在高侵袭力、低分化细胞株PANC-1、MIA-PaCa-2、AsPC-1中呈相对高表达,而在低侵袭力、高分化细胞株BxPC-3、SW1990、capan-2中呈相对低表达;Grb2在胰腺癌组织中均有表达,而在癌旁胰腺组织中不表达或低表达,统计分析显示,Grb2的高表达与肿瘤低分化以及淋巴结或者远处转移有关（均P<0.05）。 结论：Grb2的表达与胰腺癌的分化程度和侵袭转移力密切相关,高表达者肿瘤恶性程度高,预后差。     

胰腺癌相关免疫原性膜抗原的筛查和鉴定

目的 应用蛋白质组学技术筛查、鉴定胰腺癌相关免疫原性膜抗原.方法 培养、提取并纯化胰腺癌细胞株SW1990的膜蛋白,将膜蛋白通过双向凝胶电泳(2-DE)进行分离,平行的3块2-DE凝胶分别行考马斯亮蓝染色和免疫印迹杂交.收集并纯化临床上66例胰腺癌和24例慢性胰腺炎患者血清中的IgG,分别与膜蛋白2-DE平行凝胶进行免疫印迹杂交.应用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱分析杂交阳性蛋白位点,并经肽指纹库鉴定.应用RT-PCR、实时荧光定量PCR(real-time PCR)、Western blot方法对筛查出的膜抗原进行验证,并比较不同胰腺癌细胞株、正常胰腺组织中目的 膜抗原的基因及蛋白表达水平的差异.结果 胰腺癌细胞株SW1990膜蛋白与胰腺癌患者血清IgG免疫印迹杂交共出现9个阳性点,与同慢性胰腺炎IgG杂交所出现的2个阳性点无重复,经质谱分析鉴定出电压依赖性离子通道(VDAC)2可能是有潜力的候选膜抗原.经RT-PCR和real-time PCR验证,VDAC2基因在胰腺癌细胞株SW1990、AsPc、P3中均有表达.Western blot实验结果表明,VDAC2在胰腺癌细胞株中的蛋白表达明显高于正常胰腺组织.结论 胰腺癌细胞膜蛋白VDAC2可能是具有免疫原性的胰腺癌相关膜抗原,其基因在胰腺癌细胞株SW1990、AsPc、P3中均有表达,并且在胰腺癌细胞株中的蛋白表达水平明显高于正常胰腺组织.