hTERT启动子调控的CD基因对卵巢癌细胞株的选择性杀伤作用研究

目的探讨由人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒对卵巢癌细胞的选择性杀伤作用。方法将自行构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的重组腺病毒分别感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,通过MTT法检测受染细胞的存活率,观察分析腺病毒载体对细胞的杀伤作用。结果用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P<0.01)。结论本实验构建的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力。     

重组腺病毒ADV-TK 基因的构建及其对肝癌细胞的杀伤作用

目的 探讨含胸苷激酶(TK)自杀基因的重组腺病毒(ADV-TK)对肝癌细胞的杀伤作用.方法 采用细胞内同源重组法构建出携带TK基因的ADV-TK,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定,将ADV-TK感染人肝癌细胞株SMMC-7721,MTT法检测受感染的SMMC-7721细胞被不同浓度GCV作用后的细胞存活率情况.结果 构建的重组腺病毒中带有TK基因,用相同滴度的重组腺病毒和不同浓度的GCV作用于肝癌细胞株SMMC-7721后.MTT法检测到细胞的存活率随着GCV浓度的增加而不断降低.结论 本实验构建的携带TK基因的复制缺陷型腺病毒对肝癌细胞具有明显的杀伤作用.     

双调控溶瘤腺病毒对膀胱肿瘤EJ细胞的杀伤作用

目的：构建由人端粒酶启动子（hTERT）和缺氧诱导因子启动子（HIF）双向调控的携带SEA基因的选择性增殖腺病毒,体外试验其对肿瘤的杀伤功能。方法：将hTERT和HIF分别酶切、连接在缺陷型腺病毒的穿梭质粒的E1A和E1B序列前,调控E1A和E1B蛋白的表达,共同转染人胚肾293细胞进行同源重组,获得双调控选择性复制性腺病毒,进行PCR鉴定。获取病毒转染膀胱肿瘤细胞EJ,MTT检测细胞存活和生长情况。结果：淋巴细胞与肿瘤细胞共培养12、24、48h,实验组肿瘤细胞明显少于对照组;MTT检测实验组在12、24、48h活细胞数低于对照组。结论：成功构建了携带SEA基因的选择性腺病毒,且其可表达目的基因,对膀胱肿瘤细胞有一定的杀伤作用。     

含hTERT启动子和Fcy::Fur基因重组质粒的构建及其对卵巢癌细胞的体外杀伤作用

目的 构建含人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子和融合型自杀基因Fcy::Fur的重组真核表达质粒并探讨它对卵巢癌细胞的体外杀伤作用.方法 ①从pORF5-Fcy::Fur质粒中PCR扩增Fcy::Fur片段,业克隆进p2XEB质粒,构建含hTERT肩动了和Fcy::Fur基因的重组真核表达质粒p2XEB-Fcy::Fur;同理,将Fcy::Fur亚克隆进pGL3-Promoter质粒,构建含猿猴病毒40(SV40)启动子和Fcy::Fur基因的重组质粒pGL3-Pro-Fcy::Fur,重组子经酶切鉴定、测序;②RT-PCR检测卵巢癌细胞SKOV3和人胚肺成纤维细胞MRC-5中hTERT mRNA的表达,荧光素酶活性分析检测hTERT启动子在2种细胞中活性;③用超声微泡作载体,将上述2种质粒分别转染SKOV3和MRC-5,与前药5-氟胞嘧啶(5-FC)共培养后,CCK-8测定转染细胞增殖抑制率;吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色观察细胞凋亡;RT-PCR检测Fcy::Fur mRNA的表达.结果 p2XEB-Fcy::Fur和pGL3-Pro-Fcy::Fur 2种重组质粒酶切和测序结果 与预期完全相符,hTERT启动子和Fcy::Fur片段测序与GenBank报道一致,且插入方向正确;SKOV3和MRC-5中hTERT mRNA表达分别为阳性和阴性,hTERT肩动子在SKOV3中活性为26.2%,在MRC-5中为0.65%;p2XEB-Fcy::Fur/5-FC系统对SKOV3的增殖抑制率明显高于MRC-5(P=0.036),而pGL3-Pro-Fcy::Fur/5-Fc系统对2种细胞的增殖抑制率无明显区别(P=0.87);转染pGL3-Pro-Fcy::Fur的SKOV3、MRC-5细胞以及转染p2XEB-Fcy::Fur的SKOV3细胞,均见大量凋亡细胞和Fcy::Fur mRNA表达,而转染p2XEB-Fcy::Fur的MRC-5少见凋亡细胞,也无Fcy::Fur mRNA表达,与前三者比较,差异有统计学意义(P<0.01).结论 含人端粒酶逆转录酶启动子和Fcy::Fur基因的重组质粒p2XEB-Fcy::Fur成功构建,p2XEB-Fcy::Furl/5-FC系统能靶向杀伤端粒酶逆转录酶阳性的卵巢癌细胞.     

构建由缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型腺病毒

目的：构建由缺氧反应元件串联重复体修饰的人端粒酶逆转录酶（hTERT)核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶FCY1基因表达的复制缺陷型重组腺病毒。方法：人工设计缺氧反应元件串联重复序列，克隆后插入hTERT启动子上游并经测序证实。将修饰后的hTERT启动子和酵母胞嘧啶脱氨酶基因FCY1插入穿梭质粒，与辅助质粒共转染HEK293细胞，重组产生复制缺陷型腺病毒。结果：获得了由3倍和6倍缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型重组腺病毒。结论：基于Cre重组酶／loxP的腺病毒载体构建系统操作简便、重组效率高。     

Survivin启动子驱动的LRIG1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含Survivin启动子和LRIG1基因的重组复制缺陷型腺病毒并进行鉴定,为肿瘤基因治疗的研究奠定基础。方法应用分子克隆技术将Survivin启动子连接至pLRIGl-GFP上构建出pEGFP-Surp-LRIGl,将其与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbhge3通过Lipofectamine2000共转染至人胚肾293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl。Ad-Surp-LRIGl在人胚肾293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度。结果 pEGFP-Surp-LRIGl经酶切鉴定正确,扩增得到的Ad-Surp-LRIGl经PCR扩增证实为Survivin启动子驱动的LRIG1重组腺病毒,滴度为2.3×1010pfu/ml。结论成功构建出含有Sur-vivin启动子和LRIG1基因的重组复制缺陷型腺病毒并鉴定正确,可用于下一步膀胱癌基因治疗的研究中。     

腺病毒介导的靶向自杀基因对卵巢癌耐药细胞株的杀伤作用

目的研究多药耐药基因1（mdr1）调控的胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因（CD∷UPP）联合5-氟胞嘧啶（5-FC）后对卵巢癌紫杉醇耐药细胞株生长的影响。方法以复制缺陷型重组腺病毒为载体，将mdr1-CD∷UPP基因分别转染2对人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol、SKOV3/Taxol及非耐药细胞株A2780和SKOV3，加入含5-FC的培养液培养，5 d后噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率，观察旁观者效应。结果5-FC对转基因耐药细胞的生长抑制作用明显高于转基因的非耐药细胞，随着5-FC浓度增加，抑制作用增强；通过旁观者效应5-FC可杀伤周围未转基因的耐药细胞。结论mdr1-CD∷UPP靶向自杀基因联合5-FC后对紫杉醇耐药细胞具有显著的特异性杀伤作用。     

靶向性双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞的杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的前药/血管内皮生长因子受体(KDR)启动子-双自杀基因系统对血管内皮细胞的杀伤作用。方法 应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,构建pKDR-CDglyTK质粒;以Adeasy-1系统为载体,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带KDR启动子调控下的CD与TK的融合基因腺病毒重组质粒pAdKDR-CDglyTK,重组质粒在293细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,以不同的感染复数(MOI)体外感染脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),利用重组病毒携带的绿色荧光蛋白(GFP)基因,荧光显微镜下观察重组腺病毒的感染效率,并给予不同浓度的GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),比较GCV(ganciclovir)和/或5-FC联合对转基因HUVEC细胞的杀伤作用。结果 成功构建了AdKDR-CDglyTK重组病毒,并高效地转染了HUVEC,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高。被转染的HUVEC对GCV和5-FC高度敏感。另外,MOI一定时,细胞存活率随GCV和5-FC浓度增加递减;GCV和5-FC浓度一定时,细胞存活率随MOI升高而降低。不同前药组细胞存活率结果显示:联合应用GCV+5-FC较单用GCV或5-FC对感染细胞的杀伤作用更强(P<0.05)。结论 KDR启动子-双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞具有强烈的杀伤作用,其杀伤效率与GCV和5-FC的浓度及重组腺病毒的MOI相关,联?     

腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统靶向性治疗前列腺癌的实验研究

目的：观察腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,丙氧鸟苷（HSV—tk／GCV）自杀基因系统在人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控下对人前列腺癌细胞的靶向性体外杀伤效应。方法：利用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因感染前列腺癌细胞LNCaP和人成纤维细胞MRC-5,荧光显微镜下观察其感染效率：利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad—hTERT-HSV／TK以及Ad—CMV—HSV／TK感染LNCaP和MRC-5细胞,加入不同浓度GCV,MTY法观察受转染细胞的存活率。结果：重组腺病毒Ad—hTERT—EGFP能特异地转染LNCaP,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高（P〈0．01）,MOI为1时转染率为8．3％,MOI为1000时转染率达100％;应用GCV处理后,Ad—CMV—HSV／TK对LNCaP和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad—hTERTp—HSV／TK只杀伤LNCaP（P〈0．001）,随着MOI和GCV浓度的增加,LNCaP细胞存活率明显降低（P〈0．01）,MOI为1和GCV浓度为1μmol/L时存活率为95．4％。MOI为100和GCV浓度为1000μmol／L时存活率仅为6．1％,并有旁观者效应。结论：重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率;hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统对人前列腺癌细胞有靶向杀伤作用。     

hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的含有治疗基因的质粒,探讨在膀胱癌细胞株中特异性靶向转录表达及其潜在的临床意义。方法:将hTERT起始转录区上游的启动子序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因及含野生型p53基因的质粒上,分别构建成质粒phTERT-GFP及phTERT-p53。脂质体转染法瞬时转染膀胱癌细胞株T24,应用荧光显微镜、噻唑蓝(MTT)法等方法观察在转染细胞中的差异性表达及膀胱癌细胞生长的靶向性抑制作用。结果:在端粒酶阳性的膀胱细胞中观察到hTERT启动子调控的绿色荧光蛋白的靶向性稳定表达,转染hTERT启动子调控的野生型p53基因靶向性抑制膀胱癌细胞生长,但对端粒酶阴性的正常细胞无明显影响(P<0.05)。结论:成功构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因和GFP基因可在膀胱癌细胞T24中靶向性表达,hTERT启动子调控表达p53基因可靶向性抑制膀胱癌细胞生长。     

增强型自杀基因载体治疗宫颈癌的体外实验研究

目的探讨运用增强子增强hTERT启动子转录活性后，调控双自杀融合基因CDTK载体对人宫颈癌HeLa细胞的体外杀伤作用。方法将SV40增强子、CMV增强子、CMV增强子／启动子及SV40-CMV双增强子分别与hTERT启动子组合构建成报告基因载体。转染HeLa细胞后用双荧光素酶系统分析其活性差异；然后构建pHr—SCT／CDTKG治疗载体转染HeLa细胞，用流式细胞仅检测转染效率，RT-PCR检测融合自杀基因mRNA表达，HPLC检测5-Fu浓度，MTT分析载体杀瘤的效果。结果HeLa细胞中增强子能使hTERT启动子活性提高6-13倍，其中SV40-CMV双增强子／hTERT启动子的活性最高，达到CMV增强子／启动子的近3倍；体外转染pHr—SCT／CDTKG后可检测到cDTK的mRNA的表达；细胞上清中5-Fu最高浓度为50．83ug／mL；当5-FC浓度为200ug／mL、GCV浓度为10ug／mL时，HeLa细胞的相对细胞存活率为48．7％。结论SV40-CMV双增强子联合hTERT启动子能高效靶向的调控CDTK融合自杀基因杀伤宫颈癌细胞，因而是一种很有前景的基因治疗宫颈癌的策略。     

hTERT启动子调控下CD137L表达载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的研究hTERT启动子调控下CD137L表达载体的构建及其在人卵巢癌细胞系中的表达,探讨CD137L靶向基因治疗的可行性。方法采用RT-PCR法从K562细胞中克隆CD137L全长基因, 将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建的质粒为pcDNA3-hCD137L,用Hind Ⅲ和Xba Ⅰ双酶切后将CD137L再定向插入pBTdel-279中,构建成hTERT启动子调控下CD137L表达载体pBTdel-279-hCD137L,采用酶切法和测序法鉴定。用Fugene6转染试剂盒将两种重组质粒分别瞬时转染人卵巢癌细胞株OVCR3和人胚肺成纤维细胞株HELF,RT-PCR和流式细胞仪检测CD137L的表达。结果测序证实所克隆的CD137L基因序列与GENEBANK中的序列相符。经限制性内切酶酶切,电泳后显示片段插入正确,证实构建成功。pcDNA3-hCD137L转染后OVCR3细胞和HELF细胞均可检测到CD137L的表达,但pBTdel-279-hCD137L转染后仅在OVCR3细胞中检测到其表达,在HELF细胞中无表达。流式细胞显示pBTdel-279-hCD137L转染效率低于pcDNA3-hCD137L。结论hTERT启动子调控下CD137L表达载体构建正确,并可在卵巢癌细胞中较高表达,为探讨靶向基因治疗提供了实验依据,但hTERT启动子活性仍低于CMV启动子     

hTERT启动子调控的TRAIL基因载体的构建及表达

目的：构建hTERT启动子调控的TRAIL基因载体，探讨hTERT启动子调控的转基因表达。方法：PCR法扩增膜结合型TRAIL基因，回收产物与带有hTERT启动子的载体连接，构建重组载体ph—TERT—TRAIL；瞬时转染乳腺癌细胞系MCF-7／ADR；采用RT—PCR法检测外源基因TRAILmRNA水平的表达，流式细胞术(FCM)检测蛋白水平的表达。结果：重组载体phTERT—TRAIL经PCR、酶切出现相应长度的片段；测序结果连入TRAIL基因；目的基因的序列分析结果与Genebank中的数据高度同源；RT—PCR显示细胞中外源基因TRAIL在mRNA水平明显表达；FCM显示转染了重组载体phTERT—TRAIL的细胞较未转染带有TRAIL基因载体的细胞TRAIL蛋白表达水平上调。结论：成功构建重组载体ph—TERT-TRAIL，hTERT启动子调控的TRAIL基因在乳腺癌细胞系MCF-7／ADR中明显表达。     

人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子驱动的增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法：从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上，酶切获取约1100bv的启动子片段，克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中，构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒pEGFP—N1作为阳性对照，pEGFP-1作为阴性对照，脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D，NCI—H446，A2，A549，LTEP—a-2，YTMLC和人正常细胞MRC-5，荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果；双酶切和单酶切均显示载体pEGFP—hTERTp构建成功。细胞转染结果显示：在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达，而在MRC-5中无EGFP表达；转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论：hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。     

腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对乳腺癌治疗作用.方法 用重组VEGFP-CD/TK-GFP基因的腺病毒体外感染表达VEGF的乳腺癌MCF-7细胞和对照组不表达VEGF的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,以RT-PCR检测受感染细胞CD/TK的表达,然后给子前药环氧鸟苷(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响;用流式细胞术观察细胞周期变化.建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,采用瘤内注射腺病毒载体联合腹腔内注射前药GCV和/或5-FC治疗后,观察肿瘤生长情况.结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增.RT-PCR检测发现转染Ad-VEGFP-CD/TK的MCF-7细胞有目的 基凶的表达,而乳腺上皮细胞无表达.MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,CD/TK融合基因对MCF-7的疗效优丁任一单自杀基因(P＜0.01).在感染复数为100时,用流式细胞仪分析细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少.在MCF-7裸鼠移植瘤模型中.该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的牛长.其疗效优于任一单自杀基因(P<0.01).结论 腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因联合GCV和5-FC能有效治疗乳腺癌,其效果优于单自杀基因系统.     

Inhibitory Effect of Pulmonary Carcinoma by Adenovirus-Mediated CD/UPRT Gene

The cell killing effects and bystander effects of double suicide gene on pulmonary carcinoma cells were explored. Lung adenocarcinoma cells (A549) were transfected with different liters of adenovirus vector and followed with different concentrations of 5-FC after a recombinant adenovirus vector carrying CD/UPRT gene (Ad-CD/UPRT) was constructed. The cell viability was measured by MTT assay 4 days later. The cell viability was dropped to 30.57 %-8.62 % after 10 MOI of Ad-CD/UPRT transfected and 5-FC (10-1000μg/mL) administration. Furthermore, Ad-CD/UPRT-infected A549 cells showed a profound neighbor cell killing effect in the same methods. These results suggested that Ad-CD/UPRT/5-FC system can effectively suppress growth of lung adenocarcinoma cells, which may provide a novel and powerful candidate for lung cancer gene therapy strategies.     

hTERT基因反义cDNA转染对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响

目的: 研究反义hTERT基因对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响.方法: 构建反义hTERT基因的真核表达载体,采用LIPOFCTAMINETM Reagent转染卵巢癌细胞系SKOV3,通过RT-PCR、Trap-ELASA、生长曲线、裸鼠体内致瘤能力等方法比较转染前后细胞hTERT基因表达、端粒酶活性、细胞生长、致瘤性等方面的变化.结果:转化细胞系细胞hTERT基因的表达受到抑制,端粒酶活性下调,肿瘤细胞的增殖与生长速度明显降低,细胞的克隆形成能力及裸鼠体内的成瘤能力下降,肿瘤的恶性表型部分逆转.结论:应用反义技术下调hTERT基因表达可有效降低端粒酶活性并部分逆转卵巢癌细胞的恶性表型,hTERT基因可望成为卵巢癌基因治疗的新靶点.