HtsA表达质粒克隆和蛋白质的纯化

目的克隆HtsA重组表达质粒以获得HtsA表达蛋白。方法通过PCR方法扩增获得A组链球菌HtsA基因完整的序列,将此片段定向克隆到表达载体pET21d质粒中,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白,并运用离子交换层析和疏水层析分离纯化HtsA蛋白。结果经琼脂糖电泳证实成功克隆了重组表达质粒pET21d-HtsA,pET21d-HtsA融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表达,SDS-PAGE分析表明纯化的HtsA纯度较高。结论成功构建了A族链球菌HtsA基因重组表达质粒,并纯化获得了目的蛋白HtsA。     

人分化抑制因子3基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的:在大肠埃希菌中表达和纯化人分化抑制因子3(Id3),为进一步研究Id3的生物学活性打下基础. 方法:PCR扩增人Id3基因编码区的DNA片段,将PCR产物克隆至pGEM-T Esay载体中并测序鉴定.将Id3 cDNA片段重组入原核表达质粒pET-32a( ),转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达,表达产物经Western blot 鉴定,并通过镍亲和层析柱纯化His-Tag标记的融合蛋白. 结果:成功地构建了Id3的原核表达载体.Western blot分析证实,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了His-Tag融合蛋白,亲和层析法纯化后获相对分子质量为34 000的Id3融合蛋白. 结论:重组质粒pET32a( )-Id3能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.     

重组人中期因子的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的：表达和纯化具有生物学活性的重组人中期因子蛋白。方法：应用RT—PCR从人肝细胞癌组织总RNA中扩增中期因子cDNA,将其克隆到表达载体pET-24a,在大肠杆菌中诱导表达,经肝素-琼脂糖亲和层析柱纯化,应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹和细胞增殖试验对纯化产物进行分析鉴定。结果：构建的重组质粒pET—HMK能在大肠杆菌中高表达,诱导表达的蛋白主要存在于包涵体中,经肝素琼脂糖柱亲和层析后纯化产物呈单一条带,特异性抗体反应证实是重组人中期因子,细胞增殖试验显示其能育效促进NIH3T3细胞生长,并且具有剂量依赖性。结论：原核系统表达的重组人中期因子蛋白纯品具有刺激细胞增殖的活性。     

人可溶性CD83基因的克隆、原核表达和纯化

目的:构建人可溶性CD83基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:利用反转录PCR方法从正常人外周血单个核细胞中获得可溶性CD83基因,克隆到表达载体pET-32a载体,构成重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定.表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化.结果:经酶切鉴定及测序证实可溶性CD83蛋白基因的原核表达载体构建正确.经SDS-PAGE及Western blot显示在M,约32 000处出现融合表达条带.融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的45%.重组蛋白经Ni-NTA亲和层析进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白.结论:成功克隆人外周血单个核细胞来源的可溶性CD83基因片段,并在大肠杆菌B121(DE3)中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度融合蛋白.     

人BTC蛋白表达及生物学活性鉴定

目的 获得大量具有生物活性的人成熟β细胞素(BTC)蛋白.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,PCR扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列,并按读框克隆入原核细胞表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-hBTC.重组质粒转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导及亲和层析法纯化获得融合蛋白,运用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.以不同浓度BTC连续5 d作用于NIH3T3细胞,MTT比色法检测细胞增殖能力.结果 融合蛋白以水溶性形式分泌于大肠杆菌BL-21胞浆中,其作用于NIH3T3细胞可明显促进细胞增殖.结论 人成熟BTC蛋白在pET32a(+)表达系统中得到高效表达,所纯化蛋白具有促进NIH3T3细胞体外增殖的作用.     

人BTC蛋白表达及生物学活性鉴定

目的获得大量具有生物活性的人成熟β细胞素(BTC)蛋白。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,PCR扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列,并按读框克隆入原核细胞表达载体pET32a( )中,构建重组质粒pET32a( )-hBTC。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导及亲和层析法纯化获得融合蛋白,运用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。以不同浓度BTC连续5 d作用于NIH3T3细胞,MTT比色法检测细胞增殖能力。结果融合蛋白以水溶性形式分泌于大肠杆菌BL-21胞浆中,其作用于NIH3T3细胞可明显促进细胞增殖。结论人成熟BTC蛋白在pET32a( )表达系统中得到高效表达,所纯化蛋白具有促进NIH3T3细胞体外增殖的作用。     

重组截短型人角质细胞生长因子-1的表达及纯化

目的：构建高效表达N端缺失的23个氨基酸重组人角质细胞生长因子1( rhKGF1_dest23)的基因工程菌,为治疗放化疗后口腔黏膜炎的新药开发提供实验数据。方法：利用PCR方法分别以pET3c-hKGF1及sumo-EGF为模板合成N端缺失的23个氨基酸rhKGF1_dest23及sumo基因片段,构建4种原核表达载体pET22b-rhKGF1_dest23﹑pET22b-sumo-rhKGF1_dest23﹑pET3c-rhKGF1_dest23和pET3c-sumo-rhKGF1_dest23,分别转化原核表达宿主菌Rosetta(DE3) plysS、BL21(DE3) 、BL21(DE3)Star plysS、origima(DE3) 和BL21AI,筛选rhKGF1_dest23蛋白表达的最佳质粒与宿主菌组合。CM离子交换和肝素亲和层析法纯化rhKGF1_dest23蛋白,Western blotting法鉴定rhKGF1_dest23蛋白。结果： pET22b-rhKGF1_dest23质粒与BL21AI 宿主菌为最佳组合表达,经IPTG与阿拉伯糖诱导, SDS-PAGE电泳后表明目的蛋白大部分以可溶性形式存在,约占菌体总蛋白的10％,经CM和肝素两步纯化后rhKGF1_dest23蛋白纯度为95%以上,Western blotting法鉴定为rhKGF1_dest23蛋白。结论：成功构建表达人KGF1_dest23重组蛋白的基因工程菌,经IPTG与阿拉伯糖诱导,CM弱阳离子与肝素亲合层析后,得到了纯化的rhKGF1_dest23蛋白。     

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1融合蛋白的构建、纯化及其功能的初步研究

目的 构建人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAEP1)原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,对其活性进行初步分析.方法 用PCR法扩增hAEP1基因,克隆入pET28a载体中,获得重组质粒pET28a-hAPE1.将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用His亲和层析技术进行蛋白纯化,得到hAPE1融合蛋白.用Western blot及电泳迁移率变动分析实验分析hAPE1融合蛋白的抗原性及活性.结果 所构建的重组质粒pET28-hAPE1经双酶切及DNA测序鉴定表明构建正确.IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带,His亲和层析纯化后得到hAPE1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.Western blot及电泳迁移率变动分析实验证明hAPE1融合蛋白具有抗原性、AP修复及氧化还原活性.结论 成功构建了人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶的原核表达载体pET28a-hAPE1,并在E. coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到有抗原性及活性的hAPE1融合蛋白.     

截断型人酸性成纤维细胞生长因子的表达及活性鉴定

目的:稳定且具有活性的截断型人酸性成纤维细胞生长因子(shaFGF)的构建、表达及纯化.方法:以含全长人酸性成纤维细胞生长因子cDNA的质粒pUC-haFGF为模板,设计一对引物,PCR扩增获得shaFGF cDNA,将其克隆到表达载体pET3c中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),0.5 mmol/L IPTG诱导表达,通过离子交换和肝素亲和层析纯化目标蛋白,MTT法检测促分裂活性.结果:shaFGF的表达量约为25%,纯化的shaFGF的促分裂活性与haFGF标准品相当.结论:BL21(DE3)/pET3c表达系统能高效表达shaFGF,纯化得到的shaFGF可供下一步的药学研究.     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

rhIL-2/GM-CSF融合蛋白抗体制备、鉴定及其生物学活性研究

目的：制备rhIL-2/GM-CSF融合蛋白的抗体,并观察该抗体的特异性及对融合蛋白生物学活性的影响。方法：用纯化的融合蛋白（rhIL-2/GM-CSF）作为抗原,免疫新西兰兔后制备抗血清,用ELISA和Dot-ELISA检测抗体滴度和特异性。用依赖株细胞增殖实验检测抗体对rhIL-2/GM-CSF生物学活性的影响。结果：此抗体效价高,特异性好,不仅与融合蛋白（rhIL-2/GM-CSF）、IL-2以及GM-CSF发生反应,而且能够竞争抑制rhIL-2/GM-CSF的生物学活性。结论：此抗体可用于融合蛋白（rhIL-2/GM-CSF）的结构和功能研究。     

人白介素24基因克隆表达、纯化及活性检测

目的克隆人IL-24基因,构建原核表达载体,表达纯化GST-IL-24融合蛋白,检测其活性。方法用密执毒素诱导HeLa细胞表达IL-24 mRNA,通过RT-PCR获取IL-24cDNA,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,IPTG诱导表达,经GSTrap TMF Fcolumn亲合纯化,SDS-PAGE和Westernblot检测融合蛋白的表达,MTT法检测GST-IL-24对宫颈癌CaSKi细胞的抑制作用。结果克隆得到人IL-24的cDNA,序列与GenBank公布序列完全一致,SDS-PAGE电泳可见50kD大小的融合蛋白表达。GST-IL-24以剂量依赖的方式抑制宫颈癌CasKi细胞的生长。结论成功构建人IL-24基因原核表达载体,表达纯化得到GST-IL-24,该融合蛋白对宫颈癌CasKi细胞具有抑制作用。     

黄牛朊蛋白原核表达产物的复性与活性分析

目的复性黄牛朊蛋白原核表达产物,分析复性蛋白的活性,以获得有活性的牛重组朊蛋白。方法构建并诱导表达黄牛朊蛋白基因重组菌,复性其包涵体裂解物,对GST-BoPrP（93～241）（Q234R）复性产物进行GSTrap FF柱层析纯化,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹观察其提纯和复性效果。结果重组菌可表达分子质量约为42.4 ku的目的蛋白,包涵体裂解物经过透析复性后,可获得较高纯度的复性目的蛋白。各复性产物和纯化的GST-BoPrP（93～241）（Q234R）蛋白经免疫印迹鉴定,发现仅分子质量约为42.4 ku的条带与单抗4C11结合。结论获得高纯度复性黄牛朊蛋白原核表达蛋白,具有良好的免疫反应活性。     

重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究

目的研究重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条件。方法常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得融合蛋白。结果获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。     

血管抑素3A工程蛋白的柱复性与离子交换纯化

由大肠杆菌以包涵体形式表达的一种抗内皮细胞生长工程蛋白(A nti-ang iogen ic agent,简称3A)经变性,Sephacry l S-100 HR柱复性,SP Sepharose FF离子交换吸附纯化,SephadexG-25脱盐,获得复性率为53.47%,HPLC纯度为92.52%的3A活性蛋白。以猪髋动脉内皮细胞为受检细胞,表明纯化蛋白具有抑制内皮细胞生长的特性。     

医学生一般自我效能感与心理健康、父母养育方式的相关研究

目的　探讨医学生的一般自我效能感与心理健康状况、父母养育方式之间的关系。方法　用一般效能感量表 (GSES)、症状自评量表 (SCL 90 )及父母养育方式评价量表 (EMBU )对 43 7名广东医学院本科生进行评定。结果　 (1)医学生的一般自我效能感存在着性别差异 ,男生得分显著高于女生。 (2 )医学生在SCL 90的躯体化、抑郁、恐怖、偏执和人际关系敏感等因子上的得分显著低于全国大学生常模 ;男生在SCL 90上的躯体化、强迫、敌对、偏执等因子的得分显著高于女生。 (3 )男生在父母养育方式量表的FF2、FF3、FF5、FF6、MF2、MF5等因子上的得分显著高于女生。 (4 )GSES的得分与SCL 90各因子的得分之间均呈显著的负相关 ;GSES的得分与EMBU中的FF1之间存在极其显著的正相关、与FF6、MF2、MF3、MF4之间存在显著的负相关。结论　医学生的一般自我效能感与心理健康状况、父母养育方式之间存在着一定的关系。     

NP9蛋白的原核表达及纯化

目的构建表达人NP9融合蛋白的重组体并进行融合蛋白的原核表达及NP9蛋白的分离和纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）得到NP9基因的编码区序列，克隆到原核表达载体pGEX-6P-3上构建重组NP9原核表达质粒。转化大肠杆菌后通过SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定融合蛋白表达。使用GSTFF层析柱分离纯化NP9蛋白。结果得到序列正确的NP9基因及重组原核表达质粒pGEX-6P-3-Np9，SDS-PAGE电泳和Western blotting证实重组质粒能够在大肠杆菌内受IPTG诱导表达，层析分离得到分子量为大约14kDa单一的NP9蛋白。结论成功构建了表达NP9融合蛋白的原核表达载体，该栽体能在细菌内表达出GST—NP9融合蛋白．有效分离得到NP9蛋白．     

卵泡液中TGFβ1和性激素水平的测定及临床意义

OBJECTIVE: To investigate the role of transforming growth factor-beta1 (TGFbeta1) and the sex hormones in the follicular fluid (FF) on the day of ovum pick-up (OPU) during controlled ovarian hyperstimulation (COH) cycles. METHODS: FF and the oocytes were obtained from the follicles of 90 women undergoing ovulation stimulation in vitro fertilization (IVF) treatment. TGFbeta1, estradiol, progesterone, and lutropin concentrations in the FF samples collected during transvaginal oocyte retrieval were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The maturity and fertilization of the oocytes were observed, and ultrasonography performed to confirm clinical pregnancies 4 weeks after the embryo transfer. RESULTS: In the FF containing mature oocytes, progesterone and lutropin concentrations were significantly higher than those in the FF with immature oocytes. The mean concentrations of TGF beta1, progesterone and lutropin in the FF from fertilized subjects were obviously higher than those in the FF from non-fertilized subjects (P < 0.05), and in subjects with pregnancy, higher mean concentrations of TGFbeta1 and lutropin were detected as compared with the concentrations measured from non-pregnancy subjects (3 631.4+/-1 426.3 pg/ml and 0.74+/-0.25 mIU/ml vs 2 189.2+/-1 180.4 pg/ml and 0.52+/-0.29 mIU/ml respectively, P < 0.05). Estradiol concentrations in the FF seemed to undergo no obvious changes during the whole procedure, and evinced no significant differences between the groups. CONCLUSION: Higher lutropin and progesterone concentrations in the FF on the day of OPU may promote oocyte maturation, while TGFbeta1 and lutropin levels appear to be associated with the maturation and fertilization of the oocytes, and may be indicative of the IVF outcome.     

Purification and renaturation of recombinant human interleukin-2-pseudomonas exotoxin (IL2-PE66(4GLU)) fusion protein.]

OBJECTIVE: To evaluate the effect of a novel approach for purification and renaturation of recombinant human interleukin-2-pseudomonas exotoxin (IL2-PE66(4Glu)) fusion protein. METHODS: A novel purification method established in our laboratory was adopted for the purification of the inclusion body, and after renaturation, recombinant human IL2-PE66(4Glu) fusion protein was purified by DEAE-Sepharose FF ion-exchange chromatography. RESULTS: The purity of the fusion protein that retain its biological activity was as high as 95%, and a recovery rate over 80% of the refolded IL2-PE66(4Glu) fusion protein was achieved. CONCLUSION: The purification and refolding method for inclusion body adopted in this study is simple and practical, which lays the foundation for a large-scale production of the fusion protein.