应用富血小板血浆和骨髓基质细胞构建细胞-膜片及其异位成骨的实验研究

目的：探讨应用富血小板血浆（platelet rich plasma,PRP）和骨髓基质细胞（marrow stromal cells,MSCs）构建细胞-膜片的方法并评价膜片包裹珊瑚支架后的异位成骨能力。方法：将体外培养扩增的兔MSCs悬液与PRP混合,滴加到6孔培养板上,再滴加牛凝血酶溶液,形成凝胶样MSCs／PRP混合物,置于孵箱内培养。第1周用DMEM完全培养液,后2周改用DMEM诱导培养液。用得到的细胞-膜片包裹珊瑚圆片后,植入裸鼠背部皮下,以单纯珊瑚植入作对照。术后4周和8周取材,通过组织学观察,评价其异位成骨情况。结果：细胞-膜片具有一定的韧性和可操作性。扫描电镜观察显示：膜片由大量的纺锤样成骨细胞有规律地密集在一起而形成。组织学观察显示：术后4周和8周,膜-支架复合体珊瑚支架的表面及其孔洞内有大量的软骨或骨形成,以软骨内成骨的方式成骨;单纯珊瑚植入组,珊瑚表面及其孔洞内有大量纤维结缔组织长入,未见软骨或骨形成。结论：用PRP和MSCs构建细胞-膜片的方法简便,膜片包裹珊瑚支架形成的膜一支架复合体具有良好异位成骨能力。     

鸵鸟骨转化多相钙磷陶瓷支架负载骨髓基质细胞异位成骨性能研究

目的：观察鸵鸟骨转化多相钙磷陶瓷复合骨髓基质细胞后植入裸鼠皮下的成骨性能。方法：获取兔髂骨松质骨骨髓基质细胞，体外分离、扩增、诱导后接种于多相钙磷陶瓷支架。支架／细胞复合物植入裸鼠背部皮下，单纯支架材料植入作为对照。植入后4周、8周取材，通过大体、组织学观察评价成骨活性。结果：支架／细胞复合物植入后4周，新骨主要以软骨为主，部分区域见少量成熟骨，可见软骨内成骨方式。植入后8周，材料表面和孔隙内有更多的成熟骨形成，部分区域有血管和多核巨细胞分布。结论：支架／细胞复合物显示良好的成骨活性，鸵鸟骨转化多相钙磷陶瓷可以用于骨组织工程支架材料。     

富血小板血浆对珊瑚支架上骨髓基质细胞异位成骨的影响

目的：评价富血小板血浆（platelet rich plasma,PRP）对珊瑚支架上骨髓基质细胞（marrow stromal cells,MSCs）异位成骨的影响。方法：将MSCs悬液与同一供体来源的PRP混合后滴加到珊瑚圆片上,形成珊瑚/MSCs/PRP复合物。以同样数量MSCs或PRP制备珊瑚/MSCs和珊瑚/PRP复合物。将3种复合物植入同一裸鼠的背部皮下。术后4周和8周取材,通过组织学观察和组织形态测量分析评价其异位成骨情况。结果：植入后4周或8周,珊瑚/MSCs/PRP组珊瑚表面及其孔洞内有大量的软骨或骨质形成;珊瑚/MSCs组珊瑚表面及其孔洞内也有软骨或骨质形成,并有纤维结缔组织长入;珊瑚/MSCs/PRP组形成的软骨或骨质的量明显多于珊瑚/MSCs组（P〈0.01）;珊瑚/PRP组珊瑚周围及其孔洞内有大量纤维组织,未见骨或软骨形成。结论：PRP促进了珊瑚支架上MSCs的异位成骨。     

细胞-膜片复合珊瑚支架修复兔颅骨极限缺损的实验研究

目的:评价富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)和骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)构建的细胞-膜片包裹珊瑚支架后修复兔颅骨极限缺损的能力。方法:将体外培养扩增的兔MSCs悬液与同一供体来源的PRP混合,滴加到六孔培养板上,再滴加牛凝血酶溶液,形成凝胶样MSCs/PRP混合物,置于孵箱内培养。第1周用DMEM完全培养液,第2周用DMEM诱导培养液培养,形成细胞-膜片。将细胞-膜片取下后包裹珊瑚支架,植入供体兔颅骨直径15 mm的圆形缺损内,用自体颅骨和单纯珊瑚植入作对照。术后8周和16周取材,通过大体观察、组织学观察和组织形态测量分析等,评价其骨修复效果。结果:培养的细胞-膜片厚约2 mm,呈半透明胶冻样,有较好的韧性和可操作性。细胞-膜片/珊瑚组修复兔颅骨缺损效果明显优于单纯珊瑚修复组,在16周时得到完全的骨修复,与自体骨类似。结论:用MSCs和PRP在体外培养构建的细胞-膜片具有较强的成骨活性,包裹珊瑚支架后具有良好的骨修复能力。     

磷酸钙钠/β-磷酸三钙陶瓷支架接种骨髓基质细胞成骨性能的研究

目的：观察磷酸钙钠／β-磷酸三钙(NaCaPO2/β-TCP)支架接种骨髓基质细胞后植入裸鼠皮下的成骨性能。方法：通过理化方法,将煅烧牛松质骨转化为NaCaPO2/β-TCP双相钙磷陶瓷。获取兔髂骨松质骨骨髓基质细胞,体外分离、扩增、诱导后,接种于NaCaPO2/β-TCP支架。将支架／细胞复合物植入裸鼠背部皮下,NaCaPO2/β-TCP陶瓷单纯植入作为对照。植入后4、8周取材,通过大体、组织学观察,评价成骨活性。结果：支架／细胞复合物植入后4周,材料表面见相对较成熟的骨组织,内部主要为软骨;植入后8周,大量骨小梁形成。可见骨髓腔、骨髓细胞及脂肪细胞,在支架材料和骨组织的邻接区域见成骨细胞及破骨细胞。可见软骨内成骨方式。结论：NaCaPO2/β-TCP支架接种骨髓基质细胞后显示良好的成骨活性,能够促进未成熟骨矿化,可以作为骨组织工程支架材料。     

松质骨基质-骨髓基质成骨细胞复合物的异位成骨作用

目的：观察松质骨基质－ 骨髓基质成骨细胞复合移植皮下成骨作用,以探索松质骨基质作为骨组织工程支架材料的可行性。方法：新生兔骨髓细胞体外培养、诱导后,接种于藻酸盐／松质骨基质中,形成松质骨基质／藻酸盐／骨髓基质成骨细胞复合物,并植入裸鼠背部皮下,对照组单纯植入松质骨基质。植入４、８ 周后行 Ｘ线摄片和组织学检查,观察骨形成情况。结果：松质骨基质／骨髓基质成骨细胞复合物皮下成骨效果明显优于松质骨基质。前者兼有纤维成骨和软骨成骨,以纤维成骨为主;后者仅见少量软骨成骨。结论：松质骨基质可以作为一种良好的骨组织工程支架材料。     

基于细胞膜片构建无外支架组织工程骨的实验研究

目的：探讨利用骨髓基质细胞膜片构建较大体积的无外支架组织工程骨的可行性。方法：将兔骨髓基质细胞高密度接种于普通培养皿,在成骨诱导条件下连续培养2周,用细胞刮沿培养皿底刮取,获得骨髓基质细胞膜片。然后将细胞膜片折叠成长方形多层膜片复合物,并由一端卷起,形成具有一定体积的圆柱状细胞多聚体。静置孵育2h后,将体外构建物移植到裸鼠背部皮下。在非成骨诱导条件下获得的细胞膜片为对照组。术后4周、8周分别取材,进行大体观察、三维CT扫描、组织学检查、生物力学评价。采用SPSS13.0统计软件对数据进行随机设计的两组间均数t检验。结果：通过此方法获得的骨髓基质细胞膜片具有成骨分化特征。植入体内后形成的硬质组织保持着较好外形,三维CT表现为异位矿化物,8周时的新生物密度与裸鼠椎体相似,组织学检查证实为骨组织,生物力学测试具有较高的抗压强度。结论：骨髓基质细胞膜片在体内具有良好的成骨能力,可用于构建较大体积的组织工程骨,无需外支架。本研究为骨组织工程构建提供了全新的方法。     

Beagle犬骨髓基质细胞复合A-PCPC裸鼠皮下成骨的实验研究

目的:观察支架材料活性磷酸钙骨水泥(active porous calcium phosphate cement,A-PCPC)及其与Beagle犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)复合体在裸鼠体内的成骨性能.方法:抽取Beagle犬骨髓,体外分离培养、成骨诱导、扩增BMSCs并通过细胞化学方法检测其成骨表型.体外构建BMSCs/A-PCPC复合体,并行扫描电镜超微结构观察.将复合体植于裸鼠背部皮下,同期植入单纯A-PCPC作为对照组.术后2、4、8周取材,HE染色,进行组织学及组织形态计量学分析.结果:ALP染色阳性,Von Kossa染色可见钙结节形成.扫描电镜可见细胞贴附于材料表面及孔隙表面生长.HE染色显示,2周时,复合体组可见少量编织骨,单纯材料组成骨较少.4周时,复合体组可见编织骨向小梁骨转化,单纯材料组可见大量骨样组织.8周时,复合体组新骨趋于成熟,单纯材料组骨成熟度较差.结论:A-PCPC支架接种BMSCs后显示良好的成骨活性,能够促进未成熟骨矿化.可以作为骨组织工程支架材料.     

内皮祖细胞对骨髓间充质干细胞－种植体复合物成骨能力的影响

目的：研究内皮祖细胞（EPCs）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）膜片－种植体复合体成骨能力的影响。方法：分离培养大鼠 BMSCs 并采用细胞膜片技术培养细胞膜片;分离培养大鼠骨髓来源 EPCs;将 EPCs 加载于 BMSCs 细胞膜片上并检测相关基因;制作细胞膜片－种植体复合体并植入裸鼠皮下,8周取材,行 Micro-CT 检查及组织学检测。结果：体外实验显示EPCs 加载于 BMSCs 细胞膜片后成骨相关 Runx-2、ALP、BMP2和成血管相关 VEGF 的基因表达提高;裸鼠体内实验取材 Mi-cro-CT 检查显示加载 EPCs 组成骨量较高,HE 切片显示加载 EPCs 组成骨面积较多,免疫组化检测显示加载 EPCs 组 Runx2、BMP2表达较高。结论：加载 EPCs 能提高 BMSCs-种植体复合物的成骨能力。     

人髁突骨髓间充质干细胞体内成骨的实验研究

目的 探讨人髁突来源骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC)体内分化成骨的能力,为构建组织工程髁突提供种子细胞.方法取切除的人髁突冲洗收集骨髓细胞,采用密度梯度离心和贴壁培养法进行培养和纯化BMSC,取第3或4代BMSC进行成骨细胞和成软骨细胞诱导分化后接种于珊瑚骨支架表面,扫描电镜观察细胞在支架表面的黏附和增殖状况.将成骨或成软骨细胞-珊瑚骨支架植入裸鼠背部皮下,6和9周后观察体内成骨和成软骨情况.结果 培养3～7d后扫描电镜显示细胞黏附于珊瑚骨支架表面,呈多层生长,并跨越微孔连成网状或片状;植入裸鼠体内9周,髁突形珊瑚骨支架均基本维持最初的形态,可见散在或片状的新生骨形成,新生软骨呈岛状分布.结论从人髁突骨髓中分离出的BMSC具有体内形成新骨和软骨组织的能力,可作为构建组织工程髁突的种子细胞.     

bFGF基因转染的骨髓间充质干细胞在珊瑚骨表面的生长特性

目的：将转染bFGF基因的骨髓间充质干细胞（BMSCs）与珊瑚骨复合培养，观察转染bFGF基因的BMSCs在珊瑚支架材料上的生长状况。方法：穿刺抽取新西兰大白兔胫骨骨髓，采用密度梯度离心法分离BMSCs．采用贴壁筛选法对分离出的BMSCs进行纯化，利用脂质体转染bFGF—pcDNA3到BMSCs。取生长良好的转染bFGF基因的BMSCs和未转染的BMSCs，分别接种于不同珊瑚表面，利用扫描电镜观察珊瑚支架上BMSCs的生长状况：采用MTT法观察细胞一支架复合培养的BMSCs增殖情况，采用SPSS10．0软件包对数据进行t检验。结果：扫描电镜观察显示．复合培养的BMSCs贴附在珊瑚上，并在材料上完全铺展，形态多样，细胞跨越微孔表面或向孔内长人，部分区域有细胞外基质形成。MTT法检测显示，细胞-支架复合培养转染组与复合培养未转染组的BMSCs增殖状况相比有统计学差异（P〈0．05），复合培养转染组，BMSCs生长增殖强于未转染组。而复合培养的转染组与单纯培养转染组BMSCs增殖相比无统计学差异（P〉0．05）。结论：转染bFGF基因的BMSCs在珊瑚支架材料上的生长状况较未转染组好，珊瑚人工骨可以作为BMSCs支架材料，用于构建组织工程骨。     

纳米级支架材料在骨组织工程中的应用

骨组织工程研究领域中，支架材料与细胞的相互作用是主要的研究课题。支架材料表面的微观结构对细胞的生物调控作用非常重要。纳米材料因具有一些独特的效应，有利于细胞的黏附、增殖和功能的增强，因而作为骨组织工程支架有着良好的应用前景。目前用于骨组织工程的纳米支架材料主要有纳米复合材料和纳米纤维材料。作者就纳米支架材料与细胞作用的机制以及近年来其在骨组织工程中的应用研究现状作一综述。     

实时定量PCR检测Nel样Ⅰ型分子基因对大鼠骨髓基质细胞成骨相关基因表达的影响

目的：研究Nel—like 1型分子（Nell-1）基因对体外培养大鼠骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,bMSCs）成骨相关基因表达的影响。方法：取6周龄雄性Fischer 344大鼠胫骨和股骨骨髓体外培养。以腺病毒为载体。进行基因转染，绘制生长曲线并测定转染效率。以转染β-半乳糖苷酶（β—Galactosidase，LacZ）基因的bMSCs为对照组，转染Nell-1的bMSCs为试验组，用实时定量PCR（real—timePCR）测定成骨相关基因碱性磷酸酶基因（alkaline phosphatase，ALP）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、骨钙素（osteocalcin，OC）、骨桥蛋白（osteopontin，OP）和Sox9的表达。以2^-△△CT法计算基因表达的相对比值。结果：随着Nell-1基因转染滴度的增高。细胞增殖速度减慢。基因转染效率随滴度增加而增高。Nell-1基因转染大鼠bMSCs．早期下调、中期和晚期上调ALP的表达。晚期上调OC的表达,整个成骨周期中均上调OP和BSP的表达。结论：Nell-1基因可能通过影响各成骨相关基因的表达而促进大鼠bMSCs的成骨分化。     

犬骨髓基质细胞片层在构建组织工程骨中的作用

目的:探讨犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)细胞片层在构建组织工程骨中的价值.方法:制备犬同种异体脱钙骨基质(dermineralized bone matrix,DBM).将人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)复合到DBM上.抽取犬髂骨骨髓,采用密度梯度离心法分离犬骨髓基质细胞(BMSCs).将经成骨诱导的第3代细胞接种于温度反应性培养皿中,制备BMSCs细胞片层.用得到的BMSCs细胞片层包裹DBM/rhBMP-2/BMSCs复合体,植入犬背阔肌血运丰富的肌筋膜下为实验侧,以无BMSCs细胞片层包裹的DBM/rhBMP-加MSCs复合体为对照侧.术后4、8、12周取材,行组织学观察,评价体内异位成骨的情况.采用SPSS13.0软件,对数据进行两样本均数差别的t检验.结果:实验侧成骨面积大于对照侧,2组差异有显著性(P<0.05).术后12周,实验侧生成大量板层骨,有哈弗系统形成,骨髓腔内有红骨髓.对照侧有板层骨形成,无哈弗系统形成,骨髓腔内无红骨髓.结论:BMSCs细胞片层可促进具有致密板层骨和哈弗系统的组织工程骨的形成.     

骨形成蛋白2基因修饰的山羊耳软骨细胞体内异位植入研究

目的：应用AdBMP-2基因修饰体外培养的山羊耳软骨细胞，并与F127pluronic支架材料复合，进行裸鼠皮下异位植入研究，探索BMP-2基因修饰高等哺乳动物软骨细胞促进软骨组织重建的可行性。方法：体外培养山羊耳软骨细胞，转染AdBMP-2和AdLacZ基因，X-gal则染色检测基因转染效率。将基因修饰的细胞与可吸收生物材料Pluronic F127复合形成细胞-生物材料复合物，并注射到裸鼠皮下，分别在术后2周和4周取材，观察2周标本CollX染色，4周标本X—gal、阿利新蓝、BMP-2及VEGF免疫组化染色。结果：50pfu／细胞可以获得80％的转染效率．AdBMP-2组在2周时出现大量成熟的软骨组织．4周时出现较多的骨样组织，BMP-2和VEGF染色强阳性：而AdLacZ组2周时尚未形成明显的软骨样组织，4周出现小块的软骨组织，未见骨样组织及VEGF阳性表达。结论：实验条件下,BMP-2基因转染早期即促进了软骨的成熟和分化，但随后发生了骨化，提示可尝试将其应用于软骨原位缺损或筛选更为理想的生长因子,以促进软骨再生。     

无机活性元素骨组织工程支架材料止血机制的体外实验研究

目的：探讨作为骨修复材料的无机活性元素骨组织工程支架材料的止血机制。方法：体外测试无机活性元素骨组织工程支架材料的比表面积、孔隙率、吸水率和膨胀度；将无机活性元素骨组织工程支架材料置人血液浸泡后．通过血流变实验和血小板聚集实验，检测血液粘度的变化和血小板的聚集情况，并用扫描电镜观察材料对血小板的黏附情况及血小板形态的影响。所有数据采用SPSS11．0软件包进行分析，实验组与对照组两两比较采用配对t检验。结果：无机活性元素骨组织工程支架材料的比表面积为210m2／g，孔隙率90％，吸水率34％，膨胀度5．6％；置入血液后，在中、高切变率下导致血液粘度增高（P〈O．05），并对血小板有一定的聚集和黏附作用。结论：无机活性元素骨组织工程支架材料具有良好的止血特性，是一种极具潜力的骨修复材料。     

Influence of platelet-rich plasma on ectopic bone formation of bone marrow stromal cells in porous coral

This study evaluated the effect of platelet-rich plasma (PRP) on the bone formation of marrow stromal cells (MSCs) in porous coral. MSCs in 50 μl of PRP were seeded into natural coral disks (diameter 8.0 mm; thickness 2.0 mm). The composites were clotted and cultured in vitro or implanted subcutaneously into nude mice. Coral scaffolds loading MSCs or PRP alone acted as control. Alkaline phosphatase (ALP) activity of the specimens cultured in vitro for 7 and 14 days was measured, and the level of ectopic bone formation was investigated 4 and 8 weeks after operation. The samples from the coral/PRP/MSC group exhibited significantly higher ALP activity, compared with that from the coral/MSC group or the coral/PRP group (p < 0.05). New bone and/or cartilage formation could be observed in specimens from both coral/PRP/MSC and coral/MSC groups in ectopic sites, and osteogenesis followed the pattern of endochondral bone formation. Histomorphometric analyses showed enhanced cartilage and/or bone formation in the coral/PRP/MSC group, 4 and 8 weeks after implantation. No bone or cartilage formation could be observed in the coral/PRP group. The authors concluded that PRP could improve the ALP activity of MSCs on coral and increase ectopic bone formation.