携反义二型基质金属蛋白酶基因的重组腺病毒的构建

目的　构建携带反义二型基质金属蛋白酶 (MMP2 )基因的重组腺病毒。方法　从新鲜肝癌组织中提取总RNA ,用RT PCR法合成MMP2cDNA序列中 5′端转录起始位点附近长约 5 0 0bp的基因片段 ,将此片段反义克隆到腺病毒载体 (AdEasy)系统的多克隆位点 ,经转染 2 93细胞生成携带反义MMP2基因的重组腺病毒Ad MMP2 AS。结果　成功构建并包装携带反义MMP2基因片段的重组腺病毒Ad MMP2 AS,病毒滴度达 1× 10 8/ml。结论　构建的重组腺病毒Ad MMP2 AS可望能有效地将反义MMP2基因片段导入人肝癌细胞株 ,为进一步研究肝癌浸润和转移机理以及探讨抑制肝癌浸润和转移的方法提供实验基础。     

转化生长因子-β1反义RNA腺病毒载体的构建

目的构建含转化生长因子β1(TGF-β1)反义RNA的重组腺病毒重组体。方法将TGF-β1的cDNA5＇端630bp片段反向插入穿梭载体pAdTraek-CMV,构建为TGF-β1反义RNA的重组体(pAdTrack-antiTGFβ1),将重组体pAdTrack-antiTGFβ1与包装质粒pAdEasy-1共转染BJ5183细菌。用选择培养基筛选同源重组的阳性克隆,同源重组的腺病毒载体转染293细胞,在荧光显微镜下观察细胞中的绿色荧光蛋白(GFP)及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果构建了含rGF-β1反义RNA的重组腺病毒,其滴度为2.4×10     

Lck反义RNA重组腺病毒载体的构建及其对肾小管上皮细胞Lck表达的影响

目的:观察淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)在肾小管上皮细胞中的表达及Lck反义RNA对其表达的影响.方法:采用RT-PCR方法从肾小管上皮细胞中获得Lck目的基因片段,将目的基因片段反向插入pDC 316质粒中,构建Lck反义RNA穿梭质粒(pDC 316-antisenseLck),经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将此穿梭质粒与辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre 共转染HEK 293细胞,重组产生Lck基因反义RNA腺病毒载体(Ad-antisenseLck).用此重组腺病毒感染体外培养的肾小管上皮细胞,Western blotting方法观测此重组腺病毒载体对IL-2诱导的Lck蛋白表达的影响.结果:构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此重组腺病毒载体感染培养的肾小管上皮细胞后可明显抑制IL-2诱导的Lck蛋白表达(P<0.05),抑制率可达47%.结论:成功构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此载体可在肾小管上皮细胞内发挥生物学作用,显著阻抑肾小管上皮细胞的Lck蛋白表达.     

腺病毒载体介导反义Src基因治疗胶质瘤

目的 探讨腺病毒载体介导的反义Src基因对胶质瘤生长的作用及其机制.方法 应用携带反义Src基因的重组腺病毒体外感染C6胶质瘤细胞,观察其对细胞形态、生长曲线和克隆形成率的影响.建立大鼠胶质瘤动物模型,原位注射重组腺病毒.观察其治疗作用,Western blot检测肿瘤组织Src、Ras、MAPK蛋白的表达,实时逆转录-聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)检测肿瘤组织Caspase-3、Caspase-8 mRNA的表达.结果 体外研究表明感染反义Src基因的C6胶质瘤细胞生长受到显著抑制.体内研究表明应用携带反义Src基因的腺病毒原位注射治疗大鼠胶质瘤能够抑制肿瘤生长,减少Src、Ras、MAPK蛋白的表达,增加Caspase-3、Caspase-8 mRNA的表达.结论 腺病毒载体介导的反义Src基因能够抑制大鼠胶质瘤细胞的生长.Src-Ras-MAPK信号通路参与胶质瘤的生长,抑制该信号通路可以增加凋亡通路关键蛋白Caspase-3、Caspase-8的表达.     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2基因重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2(BMP2)基因重组腺病毒并在293E细胞中扩增制备重组病毒。方法自人骨形成蛋白2真核表达载体pcDNA3-hBMP2中酶切出hBMP2基因，插入pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV—hBMP2，经酶切线性化后，采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中，挑选同源重组质粒，酶切线性化重组质粒并转染293E细胞包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清感染293细胞，荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体，为进一步研究rBMP2基因治疗奠定了基础。     

携带融合基因CTLA4-Ig重组腺病毒载体的构建及表达

目的　为进行基因转移阻断T细胞共刺激通路诱导移植免疫耐受的研究 ,构建携带融合基因CTLA4 Ig的重组腺病毒载体。方法　构建含人CTLA4 Ig的重组腺病毒载体质粒pShuttle Tracker CMV CTLA4 Ig ,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1 △E1、△E3共转化大肠杆菌BJ5 183 ,经细菌内同源重组 ,获得重组腺病毒质粒pAd Tracker CTLA4 Ig ,转染 2 93细胞 ,制备携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,体外感染L O2细胞 72h后ELISA检测其外分泌性表达。 结果　获得携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,滴度为 6× 10 1 3 PFU L ;在其感染的L O2细胞培养上清中能检测到可溶性重组蛋白CTLA4 Ig的表达 (P N =4.6 ,阳性 )。结论　制备的重组腺病毒在体外能有效感染L O2细胞 ,受感染细胞能表达、分泌可溶性的融合蛋白CTLA4 Ig ;为进行体内移植免疫耐受的基因治疗研究奠定基础。     

MDR1启动子调控CD∷尿嘧啶磷酸核糖转移酶重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建由人MDR1启动子调控CD∷upp融合基因表达的重组腺病毒,为对耐药肿瘤体内外靶向基因治疗奠定基础。方法自行设计一对含XhoⅠ和HindⅢ酶切位点的MDR1引物,从外周血中提取人类基因组DNA,通过PCR扩增MDR1启动子并插入PGL3-enhancer载体上,获得PGL3-MDR1质粒。从PORF-CD∷upp质粒中切下CD∷upp基因,插入PGL3-MDR1中MDR1启动子下游,并从中切下目的基因MDR1-CD∷upp,克隆到腺病毒穿梭质粒中,将带目的基因的穿梭质粒pAdTrack-MDR1-CD∷upp。与含有pAdeasy-1的BJ5183菌电转化,筛选提取>30 kb的阳性克隆,经线性化后转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增出重组腺病毒中的目的基因MDR1、CD∷upp等方法加以鉴定。结果成功构建了含MDR1-CD∷upp靶向自杀基因的重组腺病毒载体Ad-MDR1-CD∷upp,病毒滴度为3.0×1010pfu/ml。结论该重组腺病毒的构建为下一步研究其对MDR1耐药细胞系的特异性杀伤作用和对耐药肿瘤模型的靶向基因治疗提供基础。     

构建携带EGFP标志人白细胞介素10基因的重组腺病毒载体

目的 构建携带EGFP标志人白细胞介素10(hIL-10)基因腺病毒载体.方法 以pSNAV2.0-hIL-10重组质粒为模板.PCR扩增hIL-10基因,获得hIL-10 cDNA片段,并酶切连接到带有含强绿色荧光蛋白基因(EGFP)标记的pDC316-IRES-EGFP-lacZalpha载体质粒上,Pmel线性化重组质粒pDC316-hIL-10-IRES-EGFP,与腺病毒包装系统AdMax转染293包装细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒,经反复感染293细胞扩增病毒后,进行离子交换法纯化病毒,并测定病毒颗粒数、滴度.结果 经PCR鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证明已正确构建重组穿梭质粒pDC316-hIL-10-IRES-EGFP和重组腺病毒质粒Ad-hIL-10-IRES-EGFP.扩增纯化后.测得重组腺病毒颗粒数为3.2×1011VP/ml,OD260/OD280值约为2.0,滴度为1.1×1010TCID50/ml.结论 成功构建了重组腺病毒质粒Ad-hIL-10-IRES-EGFP,为进一步研究hIL-10基因奠定实验基础.     

重组人内皮细胞抑制素腺病毒载体的构建及其应用

目的　构建表达人内皮细胞抑制素 (Endostatin)的重组腺病毒载体 ,并进行活性检测。方法　将含有IL3分泌肽的人Endostatin全长cDNA插入穿梭质粒pAdCMV产生重组质粒pAd IL3 Endo ,通过脂质体介导与 pBHG1 0共转染 2 93细胞 ,经同源重组产生重组腺病毒Ad IL3 Endo。体外转染人结肠癌SW62 0细胞并观察其上清对人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)生长的影响。结果　扩增到的Ad IL3 Endo的滴度为 4 .3× 1 0 1 2 空斑形成单位 (pfu) /L ,多聚酶链反应 (PCR)显示在转染的细胞中有人EndostatincDNA的存在 ,Westernblot显示转染细胞上清中有人Endostatin蛋白表达 ,台盼蓝染色显示其上清作用 72h后HUVEC的生长被抑制了 67% (P <0 .0 5)。结论　所制备的重组人Endostatin腺病毒载体能有效表达具有生物学活性的人Endostatin ,为进一步的研究奠定了基础     

大鼠galectin-9基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的克隆大鼠galectin-9基因全长cDNA,构建含大鼠galectin-9基因的重组腺病毒载体,并予以鉴定。方法从大鼠的肝脏组织中用RT-PCR的方法克隆扩增大鼠galectin-9基因,再定向插入到带NotⅠ和HindⅢ酶切的pDC316-GFP穿梭质粒中,获得穿梭质粒pDC316-GFP-galectin-9。经PCR、NotⅠ和HindⅢ酶切及测序鉴定后,用脂质体将穿梭质粒pDC316-GFP-galectin-9与腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1.3Cre共转染HEK-293细胞。经位点特异性重组获得含目的基因的重组腺病毒Ad5-galectin-9,行PCR鉴定,经HEK-293细胞扩增及纯化制备高滴度病毒液,用细胞培养方法测定病毒TCID50滴度。结果 PCR、酶切及测序证实穿梭质粒构建正确,PCR鉴定证实大鼠galectin-9基因重组腺病毒载体构建正确,病毒的感染滴度为1.4×109U/ml。结论成功构建了含大鼠galectin-9基因的重组腺病毒表达载体,为进一步研究大鼠galectin-9基因的功能奠定了基础。     

双片段survivin短发夹RNA腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建负载双片段survivin短发夹RNA(shRNA)的腺病毒载体,为PCa的基因治疗提供实验基础。方法:分别设计2条靶向survivin基因的shRNA,克隆至穿梭质粒载体中,特异性酶切后亚克隆至腺病毒骨架,构建负载2条survivin shRNA的RNA干扰重组腺病毒载体。提取环状重组病毒质粒进行PCR、酶切双重鉴定后,大规模提取纯化正确的克隆。最后将线性化的重组腺病毒基因组转染至HEK293A包装细胞包装成病毒,并扩增到所需滴度。结果:负载双片段survivin shRNA的穿梭质粒载体pShuttle2经MluⅠ酶切鉴定,证实双片段survivinshRNA插入正确;完成目的片段至腺病毒骨架的亚克隆后,PCR及PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切鉴定均证实双片段sur-vivin shRNA插入正确。结论:负载双片段survivin shRNA腺病毒载体构建成功。     

萤火虫荧光素酶报告基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建含萤火虫荧光素酶报告基因的逆转录病毒载体,为进一步研究生物发光活体动物体内光学成像奠定基础。方法利用重组DNA技术,将荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic双酶切得到的目的基因fluc+亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(fluc)SN在脂质体介导下乒乓转染GP+E86和PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。扩大培养,测定病毒滴度,并检测荧光素酶活性。结果经限制性酶切分析鉴定,载体插入基因大小、位置均正确,并用GP+E86和PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的重组逆转录病毒fluc细胞系,该细胞可高效表达荧光素酶。结论成功构建了重组质粒pL(fluc)SN,为标识干细胞进行基础研究提供了一种检测方法和平台。     

人AWP1重组腺病毒的构建及其在人血管内皮细胞中的表达和定位

目的构建人flag-AWP1（associated with protein kinase C related kinase1）基因的重组腺病毒载体作为AWP1的转基因工具,研究AWP1在人血管内皮细胞ECV304中的表达与定位。方法将flag-AWP1基因亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,经酶切鉴定正确后PmeⅠ线性化,转化至带有骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183中进行重组;经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定、线性化后,用Lipofectamine转染293细胞进行包装、反复感染以获取高滴度重组病毒上清。再用获得的重组腺病毒Ad-flag-AWP1感染ECV304细胞,激光扫描共焦显微镜下观察AWP1在ECV304细胞中的表达与定位。结果包装病毒颗粒的PCR分析显示,成功获得了重组腺病毒Ad-flag-AWP1,该重组腺病毒能够高效感染ECV304细胞,并在激光扫描共焦显微镜下观察到AWP1在细胞内成功表达,且定位于细胞膜内侧。结论成功构建了flag-AWP1的重组腺病毒基因转染载体,AWP1在ECV304细胞中的表达与定位提示AWP1可能具有细胞信号转导因子的潜能,尚需进一步研究。     

构建携带hTERT基因的慢病毒重组载体及其包装和表达

目的构建含hTERT基因的慢病毒重组载体,进行病毒包装并检测hTERT在293T细胞中的表达。方法PCR扩增hTERT．插入慢病毒载体,并与包装质粒转染293T细胞,进行病毒包装,并测定其滴度。Western—Blot检测慢病毒液感染293T细胞后hTERT的表达。结果成功构建了含hTERT的慢病毒重组载体,滴度为2．79×10^7Tu／mL,Western-B10t检测显示慢病毒液感染的293T细胞中hTERT基因高表达。结论含hTERT的慢病毒重组载体成功构建并包装后能够顺利感染293T细胞．并阳性表达目的基因。     

白细胞介素-10腺病毒载体制备及其在血管平滑肌细胞的表达

目的构建人白细胞介素(human interleukin,hIL)-10和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)双表达腺病毒载体,观察目的基因在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的表达。方法以T载体(pUCm-T/hIL-10cDNA)为模板,PCR扩增hIL-10cDNA,连入穿梭质粒,卡那霉素抗性筛选,NotⅠ、XholⅠ酶切鉴定,测序,局部序列搜索工具(BLAST)分析序列正确,PmeⅠ酶切,电穿孔单独转化BJ5183-AD-1,转化XL10-Gold扩增,PacⅠ酶切,AD-293细胞包装,PCR鉴定,测定病毒滴度,脂质体介导转染VSMCs,荧光显微镜下观察GFP的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清液中hIL-10的含量。结果重组穿梭质粒构建正确,同源重组后PacⅠ酶切获得30kb和3kb片段,重组病毒滴度为3×1010efu/ml,PCR检测含目的基因,转染的VSMCs可见绿色荧光,hIL-10含量为25ng/106个细胞。结论构建的双表达载体于VSMCs成功表达,为血管内膜增生的基因治疗打下基础。     

人Smad4克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的：克隆人抑癌基因Homo sapiens SMAD family member 4（NM_005359 1659 bp）mRNA构建人Smad4的真核表达载体。方法：从膀胱癌患者膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到Smad4基因开放阅读框架eDNA序列,并将其定向克隆到真核表达载体pcDNA3．0,构建含目的基因的pCDNA3．0-Smad4重组质粒。结果：经基因序列测定、PCR和酶切分析,证实插入载体pCDNA3．0的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列。结论：重组质粒pCDNA3．0 Smad4构建成功,为该基因的蛋白表达及其相关功能研究奠定了基础。     

携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒的构建及其应用的初步研究

目的　构建携带反义多药耐药相关蛋白 (MRP)的重组腺病毒并转染人肝癌耐药细胞株 ,为肝癌耐药的基因治疗提供实验研究基础。方法　将MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒pAdTrack CMV上 ,与骨架质粒在细菌体内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装、扩增后得到携带反义MRP的重组腺病毒AdEasy GFP ASmrp ,再用其转染人肝癌耐药细胞株SMMC 772 1 /ADM。结果　成功地构建了携带反义MRP的重组腺病毒 ,病毒滴度为 2 .5× 1 0 9efu/ml,多重感染复数为 1 0 0时对SMMC 772 1 /ADM细胞株转导效率可达 90 %以上。结论　构建的重组腺病毒AdEasy GFP ASmrp可望有效地将反义MRP导入人肝癌耐药细胞株 ,为肝癌耐药机理及其逆转方式的研究提供实验基础。     

风疹病毒E1特异肽段的重组质粒载体构建

目的:构建风疹病毒(RV)E1特异肽段的重组质粒载体,以期表达RVE1特异肽段的重组蛋白。方法:抽提RV减毒活疫苗Wistar RA27/3株的基因组RNA后逆转录,用PCR方法扩增E1特异肽段的基因片段;扩增产物经纯化后克隆至pGEX-2T质粒载体,挑取重组质粒阳性克隆进行双酶切鉴定和测序。结果:成功克隆出330bp左右的目的片段,重组质粒经测序后与预期序列一致。结论:RVE1特异肽段的基因片段的成功克隆及重组质粒的构建为进一步表达相应重组蛋白奠定了基础。     

固醇携带蛋白2腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建携带白蛋白启动子SCP2基因腺病毒载体,研究其与胆固醇结石形成的关系。方法:(1)利用RT-PCR技术克隆小鼠SCP2基因,在其上游接入白蛋白(ALB)启动子,下游连接绿色荧光报告基因(EGFP),构建穿梭质粒pDC312-ALB-SCP2-IRES2-EGFP;(2)采用Ad Max TM Adenoviru5 Vector系统包装病毒,CsCl法纯化病毒、TCID50法测定滴度;(3)重组腺病毒感染小鼠hepa-1-6细胞,实时定量PCR检测mRNA的表达;Western印迹检测SCP2蛋白表达情况;结果:成功构建携带白蛋白启动子SCP2基因腺病毒载体;当SCP2基因过表达时,CYP7a1基因表达下调,(t=3.97,P<0.05)HMGCR基因基因表达上调,(t=3.23,P<0.05)。结论:当SCP2基因过表达时引起HMGCR、CYP7a1基因转录水平的变化,提示SCP2基因可能通过影响胆固醇和胆汁酸的代谢而参与胆固醇结石的形成。