5-氮杂-2′-脱氧胞苷对人食管癌细胞株EC1化疗敏感性的影响

目的 探讨去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5 - aza-2′-deoxycytidines,5-Aza-CdR)对食管癌细胞化疗敏感性的影响及其机制.方法 经5-Aza-CdR处理人食管癌细胞株EC1后,采用MTT检测各组细胞的化疗敏感性,流式细胞仪分析各组细胞的细胞周期变化,Western blot测定对甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)表达的影响.结果 经5 -Aza-CdR处理后,EC1细胞对顺铂的化疗敏感性提高.5-Aza-CdR可诱导EC1细胞出现明显的G0/G1期阻滞.DNMT3B在食管癌细胞EC1中表达明显增高,经5-Aza-CdR作用后,其表达水平显著降低.结论 5-Aza-CdR可提高人食管癌EC1细胞对顺铂的敏感性,将细胞阻滞于G0/G1期并下调DNMT3B表达可能是其重要的作用机制.     

人食管鳞癌EC9706细胞线粒体DNA中ND1基因突变的检测及意义

目的通过对人食管鳞癌EC9706细胞线粒体DNA（mtDNA）中ND1基因进行检测,分析其基因突变的意义。方法培养人食管鳞癌EC9706细胞,提取其mtDNA中的ND1基因,并测序。结果测序发现,人食管鳞癌EC9706细胞mtDNA中ND1基因的3971处出现点突变,由C突变为T。结论人食管鳞癌EC9706细胞中mtDNA的ND1基因的突变与食管癌发生、发展关系密切。     

抑制酰基-辅酶A去饱和酶1表达对食管鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制探讨

目的:检测酰基-辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1,SCD-1)在食管鳞癌组织和细胞中的表达,分析其表达下调对食管鳞癌EC1细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其相关的分子机制.方法:采用免疫组织化学和原位杂交法检测60例食管鳞癌组织及其相应癌旁正常食管黏膜组织中SCD-1 mRNA和蛋白的表达,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测正常食管组织(作为阴性对照)和食管鳞癌细胞株中SCD-1 mRNA和蛋白的表达.不同浓度SCD-1小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)转染食管鳞癌EC1细胞后,采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测SCD-1 mRNA和蛋白的表达,应用CCK-8法检测转染前后EC1细胞增殖的变化,FCM检测转染前后EC1细胞凋亡的改变,蛋白质印迹法检测总Akt、p-Akt、bcl-2和bax蛋白的表达.结果:食管鳞癌组织中SCD-1 mRNA和蛋白表达的阳性率显著高于正常食管黏膜组织(P＜0.05),其表达上调与肿瘤组织分级、TNM分期和淋巴结转移密切相关(P＜0.05).此外,与正常食管组织相比,食管鳞癌EC9706、Eca109和EC1细胞中SCD-1 mRNA和蛋白表达均显著上调(P＜0.05),其中EC1细胞中SCD-1的表达水平最高.50 nmol/L SCD-1 siRNA能显著下调EC1细胞中SCD-1 mRNA和蛋白的表达.SCD-1表达下调可显著抑制EC1细胞的增殖,诱导细胞凋亡;同时,显著上调bax蛋白的表达,并下调p-Akt和bcl-2蛋白的表达,但不改变总Akt的表达水平.结论:SCD-1可能在食管鳞癌的发生和发展中具有重要作用,抑制SCD-1的表达有望成为食管鳞癌重要的分子治疗策略之一.     

RACK1对食管鳞癌细胞侵袭转移能力的抑制作用

目的:探讨RACK1表达水平与食管鳞状细胞癌不同转移潜能细胞侵袭转移能力的关系.方法:Transwell实验检测食管鳞癌EC9706-H、EC9706-L和EC109-H、EC109-L细胞的转移潜能;利用RT-PCR和Western blot方法,检测食管鳞癌高低转移细胞系EC9706-H、EC9706-L和EC109-H、EC109-L中RACK1的mRNA和蛋白表达水平.利用慢病毒转染技术上调RACK1低表达细胞中RACK1的表达后,采用Transwell实验检测其侵袭和迁移能力的变化.结果:EC9706-H细胞和EC109-H细胞的体外侵袭和迁移能力显著高于EC9706-L和EC109-L细胞系.RT-PCR和Western blot实验结果显示,RACK1在EC9706-H细胞和EC109-H细胞中呈低表达;而在EC9706-L细胞和EC109-L细胞中呈高表达.通过慢病毒转染技术上调EC9706-H和EC109-H细胞系中RACK1的表达,二者的侵袭转移能力明显降低.结论:RACK1表达水平与食管鳞癌细胞的侵袭转移能力负相关,过表达RACK1能够抑制食管鳞癌细胞的侵袭转移能力.这提示,RACK1在食管鳞癌的侵袭转移中发挥重要作用,有可能成为其诊断、治疗及预后评估的新靶点.     

Notch1基因在食管鳞癌细胞株EC9706中的表达及其对细胞凋亡的影响

背景与目的:早期的研究显示,Notch1信号途径与肿瘤的发生密切相关,在细胞的生长、增殖、分化和凋亡中起着十分重要的作用.本研究旨在研究Notch1基因在食管鳞癌EC9706细胞中的表达及其对EC9706细胞凋亡的影响.方法:通过免疫细胞化学方法检测Notch1基因在EC9706细胞中的表达.采用RT-PCR技术扩增Notch1基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-Notch1(命名为pcNICD),转染EC9706细胞,利用RT-PCR及Western blot检测稳定转染pcNICD 载体、转染pcDNA3.1空载体及未处理的EC9706细胞中Notch1的表达,另通过流式细胞仪检测未处理、转染pcDNA3.1和转染pcNICD的EC9706细胞的凋亡.结果:EC9706细胞中发现Notch1基因的表达.与未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比,转染pcNICD的EC9706细胞中Notch1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显增加,大约增加3倍(P＜0.05);但未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞中Notch1的表达差异无统计学意义(P＞0.05).流式细胞检测结果显示,在未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞中,细胞凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05);但与与未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比.转染pcNICD的EC9706细胞转染后24 h、48 h和72 h时细胞凋亡率明显增加(P＜0.01).结论:Notch信号途径的激活引起食管鳞癌EC9706 细胞的凋亡.提示Notch1基因有可能成为治疗食管鳞癌的新靶点.     

人食管鳞癌EC9706细胞线粒体DNA与凋亡的关系

目的：建立人食管鳞癌EC9706细胞的无线粒体DNA（ρ°）细胞,探讨食管癌线粒体DNA与凋亡的关系。方法：在细胞培养液中加EB 50μg/ml、尿嘧啶50μg/ml、丙酮酸100μg/ml,进行连续传代培养,获得完全缺失mtDNA的细胞（ρ°细胞）;运用实时荧光定量PCR技术,检测EB处理后不同时间的人食管鳞癌细胞EC9706 mtDNA的拷贝数,并采用琼脂糖凝胶电泳对mtDNA进行定性检测;采用TUNEL染色和流式细胞技术,检测EB处理后不同时间人食管鳞癌细胞EC9706的凋亡情况。结果：成功建立了人食管鳞癌细胞EC9706的ρ° 细胞,经实时荧光定量PCR鉴定,发现在EB存在下,随着细胞分裂,mtDNA拷贝数进行性减少,直到12天,mtDNA完全丢失;流式细胞术检测结果显示,EC9706细胞EB处理后,第4天、8天及12天细胞凋亡率（%）分别为（2.78±1.04）、（11.68±1.85）、（26.62±1.06）,与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）;TUNEL检测结果与上述一致,从第4天到第12天凋亡也逐渐增加。结论：成功建立了EC9706 ρ° 细胞。随着EC9706细胞mtDNA拷贝数量的逐渐减少,细胞凋亡率逐渐增加,表明mtDNA在诱导细胞凋亡中起着一定调控作用,提示选择性地诱导食管癌细胞mtDNA损伤,使食管癌细胞mtDNA拷贝数量明显减少,进而诱导细胞凋亡,可望成为食管癌生物治疗的一个新靶点。     

液体活检在食管鳞状细胞癌中的应用及展望

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,常见的病理类型包括鳞状细胞癌和腺癌,其中鳞状细胞癌占食管癌的90％.食管鳞状细胞癌(ESCC)发病率高,早期诊断困难,复发率高,预后欠佳,目前仍缺乏有效的检测方法.液体活检作为一种新兴技术,包括对循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤RNA(ctRNA)、肿瘤来源的外泌体、肿瘤相关血小板(TEP)及循环肿瘤相关微粒等进行检测,可在各类肿瘤的早期诊断、治疗及预后判断中发挥重要作用.本文围绕液体活检技术在ESCC中的最新研究进展作一综述,旨在探讨循环肿瘤标志物在ESCC诊断、治疗及预后判断中的作用及局限性.     

5-氮杂-2＇-脱氧胞苷对人食管癌细胞株EC1化疗敏感性的影响

目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-aza-2＇-deoxycytidines,5-Aza-CdR）对食管癌细胞化疗敏感性的影响及其机制。方法经5-Aza-CdR处理人食管癌细胞株EC1后,采用MTT检测各组细胞的化疗敏感性,流式细胞仪分析各组细胞的细胞周期变化,Western blot测定对甲基化转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）表达的影响。结果经5-Aza-CdR处理后,EC1细胞对顺铂的化疗敏感性提高。5-Aza-CdR可诱导EC1细胞出现明显的G0/G1期阻滞。DNMT3B在食管癌细胞EC1中表达明显增高,经5-Aza-CdR作用后,其表达水平显著降低。结论 5-Aza-CdR可提高人食管癌EC1细胞对顺铂的敏感性,将细胞阻滞于G0/G1期并下调DNMT3B表达可能是其重要的作用机制。     

下调DNMT1对食管鳞癌EC9706增殖、迁移的影响及相关机制的研究

背景与目的：已有研究显示在多种肿瘤组织或细胞中均能检测出特异性DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1,DNMT1）的高表达,提示DNMT1的高表达与肿瘤的发生发展密切相关。本研究旨在通过下调DNMT1基因的表达,研究其对食管鳞癌EC9706细胞的增殖及浸润转移能力的影响,并探讨相关的分子作用机制。方法：利用CCK-8试剂盒研检测下调DNMT1对EC9706细胞增殖能力的影响,并利用Boyden室法检测下调DNMT1对EC9706细胞浸润转移能力,进一步通过Real-time PCR和Western印迹法检测转染DNMT1 siRNA后细胞中DNMT1及MMP-2基因的转录及其蛋白表达。结果：DNMT1 siRNA转染后,能明显抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖,降低其浸润转移能力,引起MMP-2表达下调,提示DNMT1下调引起的浸润转移能力的降低可能与MMP-2表达下调密切相关。结论：DNMT1可能成为食管鳞癌治疗新的分子靶点。     

沉默锌指蛋白217基因对食管鳞癌EC9706细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨锌指蛋白217基因(ZNF217)在食管鳞癌侵袭转移中的作用.方法 合成ZENF217基因的siRNA序列并转染对数生长期食管鳞癌EC9706细胞.设置转染无义序列siRNA和未转染EC9706细胞为阴性对照和空白对照.半定量RT-PCR和Western blot方法分别检测转染48 h后3组细胞ZNF217 mRNA和蛋白的表达变化;侵袭小室检测3组细胞穿膜细胞数变化;MTT法分析3组细胞增殖能力的变化.结果 与空白对照组和阴性对照组比较,转染ZNF217 siRNA组EC9706细胞ZNF217 mRNA和蛋白表达均显著下降,差异有统计学意义(P＜0.05);转染ZNF217 siRNA组EC9706细胞穿膜细胞数显著下降,差异有统计学意义(P ＜0.05);ZNF217 siRNA能明显抑制EC9706细胞体外增殖能力(P＜0.05).结论 ZNF217基因表达下降能显著抑制EC9706细胞体外侵袭力和增殖能力,ZNF217基因有望成为食管癌基因治疗的有效靶点.     

皂荚提取物对人食管鳞癌细胞EC9706的生长抑制作用研究

背景与目的:探讨皂荚提取物对人食管鳞癌细胞株EC9706的生长抑制作用及其作用机制.材料与方法:用皂荚提取物作用E9706细胞后,采用光学显微镜观察细胞形态学变化,用MTT法检测不同浓度皂荚提取物对EC9706细胞增殖的影响;采用TUNEL法检测皂荚提取物对EC9706细胞凋亡的影响;采用Western blotting检测皂荚提取物对EC9706细胞bcl-2表达的影响.结果:不同浓度皂荚提取物(100～200 μg/ml)对EC9706细胞的增殖有明显抑制作用(P＜0.01),并具明显的浓度依赖效应(r=0.768);皂荚提取物可诱导EC9706细胞凋亡,抑制EC9706细胞bcl-2蛋白表达.结论:皂荚提取物可抑制EC9706细胞的增殖,诱导细胞凋亡.该效应可能与皂荚提取物抑制细胞bcl-2的表达有关.     

TSLC1基因对食管癌细胞EC109增殖与侵袭能力抑制的实验研究

目的:探讨肺癌抑癌基因1(TSLC1)对食管癌细胞株EC109增殖与侵袭转移能力的影响。方法:采用RT-PCR法获得TSLC1基因全长编码区序列,构建pc DNA3.1-TSLC1真核表达载体并稳定转染食管癌细胞株EC109,以MTT法测定细胞增殖水平,以细胞黏附、侵袭与迁移实验分别检测细胞黏附、侵袭与转移能力。结果:成功构建TSLC1真核表达载体,稳定转染EC109细胞后可显著抑制肿瘤细胞的增殖、黏附、侵袭与迁移能力。结论:过表达TSLC1基因对食管癌细胞的恶性生物学特征显示明显的抑制作用,为进一步研究TSLC1在食管癌发生和进展中的作用奠定了实验基础。     

食管鳞状细胞癌患者与健康人群肠道菌群的差异研究

目的 探讨食管鳞状细胞癌患者与健康人群肠道菌群的差异，为肠道菌群作为食管鳞状细胞癌早期诊断标志物提供依据。方法 利用微生物扩增子测序法对30例已确诊食管鳞状细胞癌患者的活检组织样本（观察组）及同期收集的25例健康体检者食管活检组织样本（对照组）提取组织DNA，检测DNA完整性与DNA质量，对两组样本的肠道菌群组成及丰度进行测定，并分析其组间的统计学差异。结果 两组食管黏膜组织样本菌群Beta多样性方面有较大相似性，但存在一定差异，观察组患者变形菌门Proteobacteria、疣微菌门Verrucomicrobia的相对丰富度高于对照组（P<0.05）；观察组患者巨单胞菌Megamonas属的相对丰度低于对照组（P=0.025）。结论 加强对食管鳞状细胞癌患者肠道菌群变化研究可能对其防治具有重要意义。     

热休克蛋白 HSP27 抑制食管鳞癌细胞的侵袭转移能力简

目的：探讨HSP27分子的表达水平与食管鳞癌高、低转移潜能细胞系侵袭转移能力的关系。方法：选用EC9706-H、EC9706-L和EC109-H、EC109-L两对食管鳞癌高、低转移潜能细胞系,利用细胞划痕实验检测不同细胞侵袭转移能力的差异;利用Western blot检测HSP27在不同转移潜能细胞中的表达水平;利用慢病毒转染技术上调HSP27低表达细胞中HSP27的表达,采用细胞划痕实验检测其侵袭转移能力的变化。结果：细胞划痕实验证实,EC9706-H细胞和EC109-H细胞的体外侵袭转移能力高于EC9706-L细胞和EC109-L细胞;Western blot实验结果显示,HSP27在EC9706-H细胞和EC109-H细胞中呈低表达,在EC9706-L细胞和EC109-L细胞中呈高表达;通过慢病毒转染技术上调EC9706-H细胞和EC109-H细胞中HSP27的表达,二者的侵袭转移能力明显降低。结论：HSP27与食管鳞癌的侵袭转移能力呈负相关,即HSP27高表达的食管鳞癌细胞其侵袭转移能力受到抑制。     

人食管癌相关基因4在食管癌细胞系EC9706中表达缺失的机制

目的 探讨人食管癌相关基因4(ECRG4)在食管癌中表达缺失的机制.方法 采用聚 合酶链反应-单链构象多态(PCR-SSCP)和DNA测序的方法检测80对配对食管鳞状细胞癌(ESCC)肿瘤组织和癌旁正常上皮中ECRG4的外显子突变;采用DNA亚硫酸氧盐修饰和序列特异性聚合酶链反应(ssPCR)检测EC9706细胞系ECRG4基因启动子CpG岛甲基化状态;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测去甲基化药物5-氮杂-2-脱氧胞苷或三氧化二砷(As2O3)处理后ECRG4 mRNA的重新表达.结果 80对ESCC配对标本中,ECRG4的4个外显子编码区均未发现突变.EC9706细胞系ECRG4基因核心启动子区16个CpG岛中,有11个呈高甲基化状态,ECRG4 mRNA不表达.EC9706细胞处理前ECRG4 mRNA不表达,去甲基化药物处理后,ECRG4 mRNA均重新表达.结论 甲基化表观遗传学机制是导致ECRG4基因在食管癌细胞系EC9706中表达缺失的一个机制.

Abstract：

Objective To investigate the mechanism of loss of human esophageal cancer-related gene 4 (ECRG4) expression in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC.) Methods PCR-SSCP and DNA sequencing analysis were used to detect the mutation of ECRG4 exons in esophageal cancer and matched adjacent normal tissues of 80 patients. DNA bisulfite-modifying ssPCR sequencing assay was used to examine the methylation status of ECRG4 promoter in human esophageal squamous cell carcinoma EC9706 cells. The re-expression of ECRG4 mRNA was examined by RT-PCR in EC9706 cells, after treatment with either demethylation drug 5-aza-2'-deoxycytidine or arsenic trioxide. Results No mutation in the four ECRG4 exons was found in all the ESCC and matched normal adjacent tissues. RT-PCR showed that 11 of 16 CpG islands of ECRG4 promoter were hypermethylated, while ECRG4 mRNA expression level was undetectable in the EC9706 cells. The ECRG4 mRNA was re-expressed after treatment with either demethylation drug 5-aza-2'-deoxycytidine or arsenic trioxide. Conclusion The epigenetic mechanism of methylation is a reason of loss of ECRG4 gene expression in the ESCC cell line EC9706.     

食管鳞状细胞癌线粒体DNA微卫星不稳定性分析

[目的] 研究食管鳞状细胞癌线粒体DNA微卫星不稳定性特征,探讨线粒体DNA微卫星不稳定性与食管鳞状细胞癌的关系.[方法] 用长片段PCR扩增46例食管鳞状细胞癌组织及正常对照组织线粒体DNA,并以此为模板,PCR扩增其控制区D-loop区微卫星位点(C)n序列和(CA)n序列,运用PCR-SSCP方法检测PCR产物微卫星不稳定情况,分析线粒体微卫星不稳定与食管鳞状细胞癌的相互关系.[结果] 46例食管鳞状细胞癌中,mtMSI检出率为32.6%(15/46),其中13例于D-loop区(C)n序列检出MSI,5例于D-loop区(CA)m序列检出MSI,于(C)n和(CA)n序列同时检出者3例m正常组织中未检出mtMSI,mtMSI与临床病理参数无关.[结论] 线粒体DNA D-loopK(C)n序列微卫星不稳定性在食管鳞癌中是存在的,可能是食管癌发生过程中的早期事件,并可能在食管鳞状细胞癌发生中起重要作用.     

miR-203抑制食管鳞癌细胞迁移、侵袭及其分子机制探讨

目的:探究miR-203对食管鳞癌细胞(TR146、EC109)迁移、侵袭能力的影响及其分子机制。方法:检测miR-203在食管鳞癌细胞系中的表达水平,并通过转染miR-203激动剂agomir使TR146、EC109细胞稳定高表达miR-203,miR-203 agomir阴性对照组(NC)和无处理组(Blank)作为对照。通过划痕实验、Transwell实验检测miR-203对TR146、EC109细胞迁移、侵袭能力的影响。利用生物信息学分析miR-203潜在的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验、实时定量PCR（qPCR）实验、Western blot实验验证miR-203靶基因。通过拯救实验探究miR-203是否通过抑制靶基因发挥作用。结果:与正常食管上皮细胞相比,miR-203在食管鳞癌细胞系中表达下调。在TR146、EC109细胞内将miR-203表达水平上调数倍,划痕实验证实miR-203能够抑制TR146、EC109细胞迁移能力,Transwell实验证实miR-203能够抑制TR146、EC109细胞侵袭能力。生物信息学、qPCR实验和Western blot实验表明LASP1(LIM and SH3 domain protein 1)是miR-203潜在的靶基因。拯救实验表明miR-203通过靶向抑制LASP1发挥抑制食管鳞癌细胞迁移、侵袭的作用。结论:miR-203能够抑制食管鳞癌细胞迁移、侵袭,并且该抑制作用可能通过miR-203靶向抑制LASP1介导,为食管鳞癌临床诊断和靶向治疗提供了理论依据。     

白桦酯醇对食管癌细胞EC109的抑制作用

背景与目的白桦酯醇是一种重要的三萜类生物活性分子,本文从白桦树皮中提取获得白桦酯醇纯品,然后研究该生物活性分子抑制食管癌细胞的活性。材料与方法取一定量的白桦树皮干粉,通过乙醇回流,减压浓缩和甲醇-氯仿重结晶等步骤获得白桦酯醇纯品。用不同剂量的白桦酯醇作用于EC109食管癌细胞48h,噻唑蓝(Methylthiazoletetrazolium,MTT)法检测细胞抑制率。结果白桦酯醇作用于食管癌细胞EC109后,EC109细胞形态发生明显改变,细胞抑制率随白桦酯醇浓度的增高而增高,呈现剂量依赖关系。结论白桦酯醇对食管癌细胞EC109有明显抑制活性。     

西妥昔单抗致药物性肝功能损害一例

患者 男,54岁,因胸上段食管鳞癌入院.食管镜检查提示,进镜20～22 cm处见黏膜不规则隆起,呈环状分布.活检病理为鳞状细胞癌.影像学分期为T3NOMO,II B期.患者否认有乙肝、结核等传染病史.入院后辅助检查未发现远处转移,心、肺、肝、肾功能无异常,乙肝表面抗体阳性,符合西妥昔单抗联合同步放化疗治疗局部中晚期食管鳞状细胞癌有效性和安全性的研究(EXCEL 0901)入组标准.     

辣椒素联合5-Fu抑制食管鳞癌细胞的增殖及侵袭

目的 探讨辣椒素联合5-Fu对食管鳞癌Eca109和EC9706细胞增殖、耐药的影响.方法 将EC9706和Eca109细胞分为对照组、辣椒素组、5-Fu组和联合用药组,MTT法检测72 h后细胞的增殖情况及辣椒素联合应用不同浓度5-Fu对食管鳞癌细胞增殖的影响.结果 MTT实验表明,辣椒素与5-Fu联合应用可明显抑制Eca109和EC9706细胞的增殖,与单独使用辣椒素或5-Fu组相比,细胞存活率显著降低;对照组和辣椒素组细胞的存活率均随着5-Fu浓度的增加而下降,但在同一浓度,辣椒素与5-Fu联合应用可明显提高食管鳞癌细胞对化疗药的敏感性.结论 辣椒素与5-Fu联合应用,可以增强食管鳞癌细胞对化疗药的敏感性,因此辣椒素有望成为食管癌治疗中的辅助用药.