肝细胞低温保存的实验研究

在传统的冻存剂配方的基础上,通过降低DMSO的浓度并且添加不同浓度的葡萄糖、蔗糖或海藻糖,探索一种改善人肝细胞冻存效果的新冻存保护剂配方.在传统的冻存保护剂配方中,将DMSO的浓度降低至2% v/v或5%v/v,加人葡萄糖、蔗糖或海藻糖;两周后将肝细胞快速复温,进行存活率、24 h贴壁率和形态学的检测,并与10%DMSO对照,其中5%DMSO+0.3 mol/mL海藻糖组效果最好,复温后肝细胞的存活率、24 h贴壁率均优于其它冻存液组.结果表明,葡萄糖、蔗糖、海藻糖均对人肝的低温保存有一定的保护作用,5% DMSO+0.3 mol/mL海藻糖组是其中最好的浓度配方;海藻糖与DMSO联合使用降低了冻存保护剂DMSO的浓度,表明两者有协同作用.     

一种新贴壁细胞冻存液的研发与评价

目的 评价一种新的贴壁细胞冻存液。方法 使用含7.5%二甲基亚砜(DMSO)(V/V%)、17.5%丙二醇(V/V%)、2.5%聚乙二醇(V/V%)、10%胎牛血清(FBS)(V/V%)的达氏修正依氏培养液(DMEM)作为新型冻存液,对MDCK、LLC-MK2、HEp-2等3种贴壁细胞进行冻存实验。实验分常规冻存组、贴壁细胞冻存对照组和贴壁细胞冻存组,通过观察细胞形态并以HEp-2细胞为典型绘制细胞生长曲线;利用细胞病变法及免疫荧光法检测复苏的贴壁细胞对甲型流感病毒、副流感3型病毒、呼吸道合胞病毒的敏感性变化。结果 3种贴壁细胞冻存组复温后细胞保持完整的单层贴壁状态,与常规冻存组细胞复苏培养3 d后的新鲜贴壁细胞形态一致;3种贴壁冻存对照组细胞复苏后其细胞大量死亡,数量急剧减少,细胞间隙增大,细胞呈破碎样。生长曲线结果显示HEp-2贴壁细胞冻存组一直保持5×10⁵/mL水平。对上述病毒的敏感性检测中,贴壁细胞冻存组呈现出典型的细胞病变;感染甲型流感病毒的MDCK贴壁冻存细胞荧光呈胞浆颗粒型或细胞核均质型;感染呼吸道合胞病毒的HEp-2贴壁冻存细胞荧光呈胞浆颗粒型,...     

不同直径神经干细胞球慢速低温冻存的研究

为提高神经干细胞冻存复苏后的效果及存活率,对不同尺寸与状态的神经干细胞球进行了在不同浓度DMSO(二甲基亚砜)下的慢速冻存比较.首先用CCK-8试剂盒测定神经干细胞的生长曲线,然后对处于对数生长期的3类神经干细胞(单细胞悬液,直径30～50 μm球,直径80～100 μm球)分别进行了7个不同浓度(3%,5%,7%,8%,10%,15%,20%)DMSO的冻存实验比较,并对冻后复苏的细胞进行活性检测和诱导分化.结果表明, 直径80～100 μm的神经干细胞球,DMSO浓度8%,复苏后细胞活率82.9%,且仍具有多项分化潜能.神经干细胞间的亲密联系和刻痕信号与直径尺寸共同作用,影响着神经干细胞的冻存复苏效果.     

利用普通冰箱冻存肿瘤细胞的技术研究

<正> 利用普通冰箱-18℃冷冻保存组织、细胞,迄今少见报道.本实验以人肝癌细胞株Bel_(7402)为对象,探讨-18℃冷冻保存方法.1材料与方法1.1 细胞来源及培养方法人肝癌细胞株Bel_(7402)引自中山医科大学实验动物中心,置于含100mL/L新生牛血清的RPMI1640培养液中,在37℃,50mL/LCO_2,饱湿条件下传代培养,细胞贴壁生长.1.2 试剂DMSO(AR)由北京化工厂生产;新生牛血清由杭州四季青生物工程材料研究所生产;RPMI 1640由Life Technologies Ins生产;胰蛋白酶(AR)由新疆化学研究所生产.1.3 冻存方法处于对数生长期的细胞经D-Hank’s液洗2次,后用0.25%胰蛋白酶消化,再用含100mL/L新生牛血清的1640液洗涤1次.后分别用含5%、10%、15%、20%DMSO的完全培养基(含100mL/L新生牛血清1640)重新制成细胞悬液.细胞浓度保持在1×10~6/mL左右.将细胞悬液置于2mL的硬塑料冻存管中,加盖密封,做好标记.直接迅速地放入-18℃冰箱中冻存.每份样品分装4支冻存管,每管装1mL悬液.于1周,1个月,2个月,3个月后分别进行融冻.     

经冻存的APA微囊牛肾上腺髓质细胞功能研究

目的观察海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine-alginate,APA)微囊牛肾上腺髓质细胞经液氮冻存前后的微囊形态、细胞活性和儿茶酚胺分泌功能变化。方法APA微囊牛肾上腺髓质细胞(牛嗜铬细胞,bevine chromaffin cell,BCC)的冻存以DMSO为保护剂,冻存采取循序缓慢降温,复苏采取快速复温。通过微囊形态、细胞活性和儿茶酚胺分泌量检测观察细胞功能变化。结果与冻存前相比,冻存复苏后的APA微囊BCC形态及细胞活性无明显变化,儿茶酚胺分泌量约为冻存前的80%。结论经冻存复苏的APA微囊BCC仍然保持了较好的形态、细胞活性和儿茶酚胺分泌功能。     

深低温冻存时限对成骨细胞生物学特性影响的实验研究

探讨深低温冻存不同时限后复苏对成骨细胞生物学特性的影响。取新生SD大鼠颅骨,胶原酶消化法培养成骨细胞。采用活细胞数、成骨细胞增殖功能、碱性磷酸酶(ALP)活性的测定等对深低温冻存1、3、6个月后复苏的成骨细胞和新鲜培养的细胞进行了比较。发现各组成骨细胞在细胞增殖功能、碱性磷酸酶活性方面均无显著性差异(P>0.05)。深低温冻存6个月后复苏组成骨细胞活细胞数与冻存1、3月后复苏组及新鲜培养的细胞组相比,活细胞数降低,有显著性差异(P<0.05),深低温冻存1、3个月后复苏组的活细胞数与新鲜培养的细胞组相比无显著性差异(P>0.05)。实验结果表明:较长时间深低温冻存能减少复苏后成骨细胞的活细胞数。但经深低温冻存后复苏的细胞仍保持成骨细胞原有的生物学特性。     

海藻糖深低温保存外周血造血干细胞的可行性

背景:二甲基亚砜是目前造血干细胞深低温保存的经典保护剂,但其对细胞和患者均有一定的毒副作用。海藻糖是一种稳定的无毒副作用的非还原性双糖,已被广泛应用于红细胞、血小板和胚胎等的冷冻保存中。目的:探讨海藻糖作为低温保存造血干细胞保护剂的可行性。方法:外周血造血干细胞经重组人集落刺激因子动员后,用血细胞分离机采集连续单个核细胞,分为0.5mol/L海藻糖组、1.0mol/L海藻糖组、对照组。采用程序降温法液氮保存,冻存7d后取出,立即置于40℃水浴箱内复苏。锥虫蓝拒染法检测细胞存活率;采用甲基纤维素半固体培养体系进行集落培养,计数粒-巨噬细胞集落形成单位的回收率;采用CD34-PE/CD45-FITC双标法,流式细胞仪检测CD34+细胞回收率。结果与结论:与对照组比较,0.5,1.0mol/L海藻糖组细胞存活率、粒-巨噬细胞集落形成单位回收率、CD34+细胞回收率均明显升高(P0.001),且0.5mol/L海藻糖组升高幅度尤为显著(P0.001或P0.01)。证实海藻糖对于短期内低温冻存的外周血造血干细胞有一定保护作用,浓度为0.5mol/L的海藻糖保护冻存的造血干细胞效果较佳。     

VARI-RATEⅢ型程序性冷冻仪冻存人外周血淋巴细胞的条件

以细胞的存活率、回收率和三项免疫功能(淋巴细胞转化、IL—2产生能力和LAK活性)为指标,对人外周血淋巴细胞(PBL)在VARI-RATEⅢ型冷冻仪的冻存条件下进行了系统研究,找出了细胞冻存的适宜条件,即细胞在4℃与含10%的DMSO的1640培液平衡15分钟后,以-10C/分的速度降温至-30℃,然后立即放入液氮保存。冷冻细胞的浓度以5×10~6/ml～1×10~7/ml左右为宜。采用慢稀释法复苏细胞使其功能得到较好的恢复。并将冷冻PBL与同一供体的新鲜PBL进行比较,证明了冷冻PBL能真实反映冷冻前个体差异的真实情况。     

冻存复苏制备同体来源的细胞毒性T淋巴细胞

目的观察冻存复苏对淋巴细胞增殖及杀伤活性的影响,并探索小鼠同体CTL的制备。方法 5.0×106个/m L脾源性单个核细胞经CELLBANKER2小鼠淋巴细胞冻存液缓慢冻存,6 d后再采用39℃水浴快速复苏;分别取新鲜淋巴细胞和冻存复苏后(CP)淋巴细胞经体外100 ng/m L CD3ε单克隆抗体(m Ab)、10 ng/m L重组小鼠白细胞介素2(rm IL-2)刺激扩增7 d分别获取细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)和CP-CIK;骨髓来源的树突状细胞(DC)分别于同系异体来源和冻存复苏后自体来源的脾源性单个核细胞混合培养制备细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。台盼蓝拒染法分别计数活细胞,流式细胞术检测CD3+T及调节性T细胞(Treg)比例,ELISA检测上清中γ干扰素(IFN-γ)含量、乳酸脱氢酶(LDH)释放法分析细胞毒活性。结果淋巴细胞经冻存复苏后,细胞存活率为78%,冻存前、复苏后CD3+T淋巴细胞及Treg比例无统计学差异;CP-CIK与新鲜CIK在细胞扩增、Treg比例、上清中IFN-γ水平以及细胞毒活性均无明显差异;同体CTL和异体CTL在细胞扩增、Treg比例、上清中IFN-γ水平以及细胞毒活性方面也无显著差异。结论淋巴细胞的冻存复苏有助于获取与传统CTL同等增殖活性及杀伤活性的同体来源的CTL。     

海藻糖保护同种带瓣大动脉的最适浓度

背景：目前液氮低温保护组织和器官技术已经非常成熟,但其保护剂一直以来争论不一。 目的：观察不同冷冻保护剂对液氮深低温冻存同种带瓣大动脉组织细胞凋亡和代谢的影响,寻求最佳的冷冻保护剂及冷冻保护剂的最适浓度。 方法：取新西兰大白兔带瓣主动脉、肺动脉标本,将其在液氮中冻存12,15,18个月,冻存液分别使用0.1 mol/L二甲基亚砜,0.1 mol/L海藻糖,0.1 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜,0.2 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜,0.3 mol/L海藻      糖+0.1 mol/L二甲基亚砜。标本复温后,免疫组织化学方法检测标本的细胞凋亡情况,葡萄糖消耗量测定法检测组织细胞的代谢水平。 结果与结论：免疫组织化学和葡萄糖消耗量测定结果均显示经0.1 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜,0.2 mol/L海藻糖+  0.1 mol/L二甲基亚砜冻存液处理的标本冻存效果最好,其次是经0.3 mol/L海藻糖+0.1 mol/L二甲基亚砜处理和经0.1 mol/L海藻糖单独处理的标本,单独使用0.1 mol/L二甲基亚砜处理的标本冻存效果最差。说明海藻糖对液氮深低温保存同种带瓣大动脉活性有很好的保护作用,单独使用海藻糖优于单独使用二甲基亚砜,联合应用海藻糖和二甲基亚砜效果更好,且联合应用的海藻糖最佳浓度范围是0.10~0.20 mol/L。     

大鼠甲状旁腺细胞玻璃化冻存效果评价

目的观察玻璃化方法冻存甲状旁腺细胞的效果,探索甲状旁腺细胞经冻存复苏后移植治疗甲状旁腺功减退症的可行性。方法应用常规方法和玻璃化方法分别冷冻保存甲状旁腺细胞,冻存前后,对甲状旁腺细胞的结构和功能进行检测。随机将甲状旁腺功能减退症模型大鼠分为4组,分别移植培养液、未冻存的甲状旁腺细胞、常规方法冻存复苏后的甲状旁腺细胞和玻璃化方法冻存复苏后的甲状旁腺细胞,用血清钙水平的变化来判断移植物的存活。结果冻存前后,细胞的结构和功能没有明显变化,常规方法和玻璃化方法效果相似。移植后大鼠血清钙浓度的水平,4组分别是(1.35±0.05)mmol/L、(2.18±0.12)mmol/L、(2.22±0.09)mmol/L、(2.11±0.11)mmol/L,各实验组分别与移植前比较,血清钙水平的增高有统计学意义(P<0.05),各实验组在移植物存活时间上的差异没有统计学意义(P>0.05)。结论玻璃化方法冷冻保存甲状旁腺细胞有效,细胞复苏后,可应用于移植。     

两种冻存液中海马神经元细胞复苏后生物学特性比较

目的:建立海马神经元适宜的冻存方法.方法:将新生24 h以内的大鼠海马消化成单个细胞后分别直接冻存于血清浓度不同的冻存液中,复苏后进行台盼蓝染色观察细胞活性;培养后观察其生长状态并在第7天固定细胞,分别进行Hoechst,微管蛋白(Tubulin)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)显色后,荧光显微镜下计数海马神经元、胶质细胞的百分率,从而建立最佳冻存方法.结果:冻存于高浓度血清冻存液中的神经元百分率为87.5%,冻存于低浓度血清冻存液中的神经元百分率为73.8%,高浓度血清冻存液中的细胞复苏后的状态及神经元存活率明显优于保存于低浓度血清冻存液中的;而冻存于高低浓度血清冻存液中的胶质细胞百分率分别为9.5%和16.5%,胶质细胞在高浓度血清的相对含量明显低于低血清组.结论:高浓度血清冻存液更利于海马神经细胞冻存后的复苏和生长.     

不同组织冻存体系对牙周膜干细胞体外扩增的影响

背景：冻存是保证干细胞移植治疗的关键步骤之一。传统的冻存是将细胞直接置于冻存液中进行保存,然而冻存液中二甲基亚砜虽能减少细胞复苏过程中冰晶对细胞膜产生的机械性损伤,但同时又对细胞具有毒性作用,直接影响细胞生存状态,不利于临床移植治疗。 目的：寻找适宜牙周膜干细胞体外扩增的牙周周组织冻存的最佳方案。 方法：收集健康人牙,刮取牙周组织后将其平均分为3等份,随机分为新鲜组、5%二甲基亚砜组和10%二甲基亚砜组,后2组分别以体积分数5%和10%二甲基亚砜添加冻存1个月后提取牙周膜干细胞。新鲜组直接提取牙周膜干细胞。 结果与结论：5%二甲基亚砜组原代细胞游出组织团块所需时间和细胞收获量虽不及新鲜培养组,但却明显优于10%二甲基亚砜组(P < 0.05)。新鲜组、5%二甲基亚砜组和10%二甲基亚砜组第1代牙周膜干细胞克隆形成率、活细胞比率、第3代牙周膜干细胞BrdU细胞增殖能力、MTT细胞生长曲线和牙周膜干细胞表面标志物表达差异没有显著性意义(P > 0.05)。提示5%二甲基亚砜添加冻存体系不仅能比10%二甲基亚砜添加的普通冻存体系明显缩短牙周膜干细胞体外扩增所需时间,增加细胞收获量同时还能保持细胞基本生物学特性,降低二甲基亚砜的总体用量和其在反复冻存复苏细胞过程中对细胞造成的直接损伤,为未来更加安全的实施临床移植治疗提供了保障,是供体组织储存新的选择。     

小鼠精原干细胞冷冻保存

目的 探索小鼠精原干细胞(SSCs)冷冻保存方法 以及解冻后体外快速增殖的条件. 方法 实验以6d龄雄性昆明小白鼠为材料,两步酶消化法分离小鼠睾丸生殖细胞,Percoll非连续密度梯度离心法富集小鼠精原干细胞,随后加入不同的冷冻液以及采用不同的降温速率冷冻小鼠精原干细胞.以MEMα为基本培养基,加入10%胎牛血清和100μg/L的胶质细胞源性神经营养因子, WST-8比色法分析培养SSCs 复苏后的增殖率,运用碱性磷酸酶细胞化学染色和RT-PCR技术,对培养的SSCs进行鉴定. 结果 冷冻液中添加10%二甲基亚砜、10%胎牛血清、0.07mol/L蔗糖时,以1℃/min程控降温方式冷冻小鼠SSCs,细胞解冻后活率最高,达84%以上;采用非程控降温方式冻存SSCs,尽管细胞解冻后活率相对于程控降温方式略低,但具有方法 简单、易于操作、无需昂贵仪器的优点,复苏后SSCs贴壁时间为8～12h,24h可见细胞分裂,48h细胞出现迅速增殖,96h可见较多含20～25细胞的细胞团,此时精原干细胞增殖近5倍. 结论 本实验所用培养条件,可以使经长期冷冻的SSCs短期快速增殖.     

微囊牛肾上腺髓质细胞的冻存及其活性评价

目的　建立一种微囊牛肾上腺髓质细胞 (bovinechromaffincell,BCC)的冻存方法 ,为临床推广微囊人工生物细胞技术移植异种细胞奠定基础。方法　微囊化牛肾上腺髓质细胞冻存以二甲基亚砜为保护剂 ,循序缓慢降温 (4℃ ,1h ,- 2 0℃ 2h ,- 5 0℃过夜 ,液氮 ) ,复苏时迅速将冻存管放入 37℃水浴中。通过检测其基础儿茶酚胺分泌量和在高钾 (5 8mmol/L)、乙酰胆碱 (10 -4mol/L)刺激下的分泌量来观察其功能活性。结果　冻存复苏后微囊BCC保留了儿茶酚胺的分泌功能 ,基础与刺激分泌量分别为 (3.2 0 7± 0 .35 0 )ng/ml和 (12 .4 96± 2 .30 2 )ng/ml,大约为冻存前微囊牛肾上腺髓质细胞分泌量的 80 % ;同时刺激后儿茶酚胺分泌增加 (P <0 .0 1)。结论　建立一种微囊牛肾上腺髓质细胞的冻存方法 ,通过功能检测证明该方法是有效和成功的     

传统及改良纱布包裹冻存法对人血管内皮细胞保护的比较*

背景：传统的细胞冻存多采用4,-20 ℃放置的阶梯式降温方法,程序复杂且浪费时间。 目的：比较传统法与改良冻存法对血管内皮细胞的保护效果。 方法：将常规培养的人血管内皮细胞用胰酶消化后,用配置好的冻存液(10%二甲基亚砜、体积分数60%胎牛血清、30%DMEM无血清培养基)调整浓度,将细胞悬液吸入冻存管,分组干预：实验组以纱布包裹,并直接投入-80 ℃冰箱;对照组按常规冻存法,4 ℃冰箱和-20 ℃冰箱分别预冷30 min和1 h后放入-80 ℃冰箱。1个月后快速复苏冻存细胞。 结果与结论：复苏后实验组细胞存活率及生长曲线与对照组比较差异无显著性意义;复苏后实验组细胞贴壁率、形态学变化及增殖能力明显优于对照组。说明改良的纱布包裹法优于传统的细胞冻存法,且更加方便快捷。     

单采血小板来源外泌体的提取与鉴定

目的研究单采血小板来源外泌体提取和鉴定的常见影响因素,为后续开展单采血小板来源外泌体研究提供参考。方法利用超速离心法分离提取单采血小板来源外泌体,并通过透射电镜、Western Blotting验证提取产物;利用BCA试剂盒测定外泌体总蛋白浓度。结果 5天组外泌体蛋白浓度(1822.2±11. 4μg/mL)明显高于1天组(775. 7±11. 5μg/mL),P <0.001;未冻存组蛋白浓度(1822.2±11.4μg/mL)明显高于不含DMSO冻存组(1153.6±2.6μg/mL)和含5%DMSO冻存组(1403.4±6.1μg/mL),P<0. 001。结论单采血小板来源外泌体含量随标本保存时间延长逐渐增加;冻存处理会一定程度上降低外泌体提取产量和影响其形态观察。     

-80℃冰箱直接冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞杀伤活性的影响

目的:研究-80℃冰箱直接冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)杀伤活性的影响。方法采用非程序降温方法-80℃冰箱冻存CIK,于冻存后6、12、18周复苏,通过LDH释放法分别测定其对K562细胞的杀伤活性,与新鲜未经冻存的CIK的杀伤活性进行比较。结果:未冻存的CIK在培养至第11天时,有较多贴壁成团细胞,而冻存后复苏培养的CIK贴壁成团细胞较少。比较各组细胞杀伤活性,冻存6、12周后复苏的CIK与未冻存的CIK,对K562细胞的杀伤活性无显著性差异(P>0.05),冻存18周后复苏的CIK的杀伤活性与未冻存的CIK对K562细胞的杀伤活性有显著性差异(P<0.05)。结论:采用-80℃冰箱直接冻存CIK,在12周内复苏应用于临床治疗较好。     

果糖和二硫苏糖醇对骨髓间充质干细胞冻存后活性及多能性的影响

背景:冻存是保证干细胞临床应用的关键步骤之一,但现有冻存技术常导致细胞活性降低、多能性丧失及分化能力下降。目的:探究果糖及二硫苏糖醇是否有助于维持冻存后骨髓间充质干细胞多能性及成骨分化潜能。方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,在细胞冻存前分别用果糖(200μmol/L),二硫苏糖醇(500μmol/L)μmol/L)及果糖(200μmol/L)+二硫苏糖醇(500预处理1 h。冻存6个月后,复苏细胞并用倒置显微镜观察细胞形态,MTT实验检测细胞活性,定量PCR检测相关干性基因(Nanog,Oct4及Sox2)的表达,碱性磷酸酶活性测试及茜素红染色检测复苏骨髓间充质干细胞成骨分化能力。结果与结论:(1)复苏后各组细胞在形态上无明显差别;(2)果糖预处理及联合预处理有助于骨髓间充质干细胞活性维持;(3)二硫苏糖醇预处理可显著促进骨髓间充质干细胞多能性相关基因Nanog及Sox2的表达;(4)果糖、二硫苏糖醇及联合预处理皆有助于维持骨髓间充质干细胞成骨分化潜能,但以二硫苏糖醇及联合预处理组效果最佳;(5)结果表明,果糖预处理有助于维持冻存骨髓间充质干细胞活性,二硫苏糖醇有助于维持冻存骨髓间充质干细胞多能性及成骨分化能力。     

用牛奶衍生物替代胎牛血清在-80℃冻存杂交瘤细胞的方法(文摘)

杂交瘤细胞的长期保存,一般都是冻存在液氮(或氮气)中,所用培基中含有胎牛血清(FCS)及二甲基亚砜(DMSO)。这种冻存杂交瘤细胞方法虽安全可靠,但需要液氮装置,并经常补充液氮,价值甚高。本文作者设计了一种以牛奶衍生物代替FCS作为冻存细胞的培基,置-80℃冰箱长期保存细胞的方法。牛奶衍生物为新鲜牛奶经过67℃加热处理,离心去脂肪、去细胞碎片的浓缩蛋白液。为了作对比,配制两种细胞冻存液,培基A含有40％牛奶衍生物和10％DMSO,培基B含有40％FCS及10％DMSO。实验用细胞是分泌抗人促性腺激素