慢病毒表达双报告基因载体系统的构建及病毒制备

本研究旨在构建萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,FLUC)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)双基因表达的慢病毒载体,并转染特定细胞系(HeLa),观察双基因的表达。采用PCR技术分别扩增FLUC和RFP报告基因,再将报告基因连接到慢病毒表达载体pLenti-Bi-cistronic中,获得具有双报告基因的慢病毒重组质粒pLenti-FLUC-RFP。然后,用脂质体将该慢病毒重组质粒转染293T细胞,收集纯化慢病毒颗粒。最后,测定病毒滴度,并用所获慢病毒感染HeLa细胞,采用荧光显微镜和荧光素酶报告基因检测试剂盒检测RFP和FLUC的表达。结果表明,酶切和测序证明RFP和FLUC基因成功连入目的载体,所构建的pLenti-FLUC-RFP慢病毒重组质粒序列符合预期。经纯化获得的慢病毒滴度为1×107TU/ml。将pLenti-FLUC-RFP转染HeLa细胞系后,在荧光显微镜下可见大量细胞表达RFP,荧光发光检测仪也检测到转染细胞具有较高的荧光素酶活性。结论:本研究成功构建了具有双报告基因的慢病毒重组质粒pLenti-Ⅲ-FLUC-RFP,经纯化获得了高滴度的慢病毒颗粒,该病毒颗粒具有很好的感染活性,为研究间充质干细胞在体内的动态分布奠定了基础。     

敲减microRNA-205靶向PTEN抑制食管癌细胞TE1的增殖并促进细胞凋亡

目的:探讨miRNA-205对食管癌细胞株TE1增殖和凋亡能力的影响及其作用机制。方法:实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和Western印迹检测正常食管黏膜细胞Het-1A和不同食管癌细胞株(KYSE70,TE12,TE1)中miRNA-205的mRNA及蛋白表达水平。转染miRNA-205抑制剂下调TE1细胞中miRNA-205的表达,采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖能力、细胞周期和细胞凋亡情况;Western印迹检测细胞增殖和细胞凋亡相关CDK2,cyclin D1,P21,Bcl-2,cleavedcaspase-3,caspase-3,p-Rb,Rb,p-Akt和Akt的蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因分析法预测及验证其可能的靶基因。结果:MiRNA-205在各型食管癌细胞中高表达。沉默miRNA-205后,TE1细胞的增殖能力降低并表现为细胞周期阻滞,而细胞凋亡率显著升高(P0.05)。同时细胞中cyclinD1,CDK2,bcl-2,p-Rb及p-Akt的蛋白表达水平均显著降低,p21及cleaved-caspase-3的蛋白表达水平显著升高。双荧光素酶报告基因分析显示PTEN是miRNA-205的可能作用靶点,TE1中共转染miRNA-205抑制剂和PTENsiRNA可部分逆转miRNA-205介导细胞增殖抑制及凋亡诱导作用。结论:沉默miRNA-205可靶向PTEN抑制食管癌细胞株TE1的增殖,并促进其凋亡,提示miRNA-205可作为食管癌诊疗的一个潜在作用靶点。     

miR-29a靶向调控IFITM3表达对肝癌HepG2细胞生长、增殖和凋亡的影响

目的探究微小RNA-29a(miR-29a)靶向调控干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)表达对肝癌HepG2细胞生长、增殖和凋亡的影响。方法采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肝癌细胞HepG2和正常肝细胞株LO2中miR-29a的表达水平;采用脂质体法将miR-29a minmic及阴性对照转染至HepG2细胞,并分为过表达组和对照组,转染48 h后用QRCR法检测两组miR-29a水平;采用MTT法和流式细胞术检测各组细胞增殖及凋亡情况; Western blotting检测各组Bax、caspase-3凋亡相关基因及IFITM3的表达;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-29a对IFITM3的靶向调控作用。结果肝癌HepG2细胞miR-29a水平低于正常LO2细胞(P 0. 05);过表达组HepG2细胞miR-29a表达低于对照组(P 0. 05);过表达组HepG2细胞增殖率低于对照组(P 0. 05),凋亡率及Bax、caspase-3、IFITM3表达高于对照组(P 0. 05); miR-29a可显著抑制野生型FITM3-3'UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性(P 0. 05),但其对突变型FITM3-3'UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性无显著影响(P 0. 05)。结论 miR-29a在肝癌中表达降低,可靶向调控IFITM3表达,抑制肝癌细胞生长、增殖,并促进其凋亡,可作为肝癌的潜在治疗靶点。     

hsa＿circ＿0002141对口腔癌细胞生物学行为的调控作用

目的 筛选人口腔癌细胞系显著差异表达circRNA,探讨hsa＿circ＿0002141对人口腔癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及对口腔癌裸鼠肿瘤生长的影响。方法 取人口腔癌细胞系HSC3、Sa3、SAS及人正常口腔角质形成细胞系HNOKs,采用高通量测序法检测circRNA表达,筛选显著差异表达的circRNA,取表达上调倍数最高的hsa＿circ＿0002141和高表达hsa＿circ＿0002141的SAS细胞进行后续实验。取SAS细胞分为对照组(正常培养)、空白转染组(转染sh-circNC慢病毒)、转染组(转染sh-circ＿0002141慢病毒),转染2周,采用实时荧光定量PCR法检测3组细胞hsa＿circ＿0002141相对表达量,采用CCK-8法检测细胞增殖,采用Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭,采用流式细胞术测定细胞凋亡率。将6只裸鼠随机分为空白转染模型组和转染模型组各3只,分别接种转染sh-circNC慢病毒、sh-circ＿0002141慢病毒的SAS细胞,于建模第3、6、9、12、15、18、21天测量肿瘤长径和短径,计算肿瘤体积;饲养21 d处死2组...     

MiR-146b在白藜芦醇保护缺氧/复氧心肌细胞损伤中的作用及其机制

目的:探讨miR-146b在白藜芦醇保护缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)心肌细胞损伤中的作用及其机制。方法:将体外培养的心肌细胞分为正常组、H/R组、白藜芦醇组、白藜芦醇+antimiR-NC组和白藜芦醇+anti-miR-146b组。采用荧光定量PCR检测miR-146b的表达,ELISA法检测细胞上清液中IL-1β,TNF-α和IL-6含量,MTT法检测细胞存活率,比色法检测LDH漏出率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测Bcl-2,caspase-3,NF-κB和TRAF6蛋白的表达,双荧光素酶报告基因实验检测miR-146b和TRAF6的靶向关系。结果:与正常组相比,H/R组细胞中miR-146b和Bcl-2蛋白的表达水平、细胞存活率显著降低,而细胞上清液中IL-1β,TNF-α,IL-6含量和LDH漏出率、细胞凋亡率以及caspase-3,NF-κB蛋白的表达水平显著升高(P<0.05);与H/R组相比,白藜芦醇组中miR-146b和Bcl-2蛋白的表达水平、细胞存活率显著升高,而IL-1β,TNF-α,IL-6含量和LDH漏出率、细胞凋亡率以及caspase-3,NF-κB蛋白的表达水平显著降低(P<0.05);与白藜芦醇组相比,白藜芦醇+anti-miR-146b组中miR-146b和Bcl-2蛋白的表达水平、细胞存活率显著降低,而IL-1β,TNF-α,IL-6含量和LDH漏出率,细胞凋亡率以及caspase-3,NF-κB蛋白的表达水平显著升高(P<0.05);而白藜芦醇+anti-miR-NC组与白藜芦醇组相比差异无统计学意义(P>0.05)。双荧光素酶报告基因和蛋白质印迹法证实TRAF6是miR-146b靶基因,且miR-146b可靶向调控其表达。结论:miR-146b抑制心肌细胞凋亡和炎症反应是白藜芦醇减轻H/R心肌细胞损伤的调控机制,其作用原理可能与靶向调控TRAF6有关。     

新型人工miRNA表达框架的构建及其有效性验证

目的构建针对EGFP基因的人工miRNA表达框架并验证其有效性。方法用融合PCR技术在体外构建针对EGFP基因的人工miRNA表达框架。经测序比对后,以该表达框架与报告基因质粒p EGFP-N2分别共转染人肝癌细胞系Hep G2、人宫颈癌细胞系He La和人肺腺癌细胞系A549,48 h后用倒置荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况并用流式细胞仪定量检测其抑制效率。结果构建的人工miRNA表达框架经测序比对正确;共转染该表达框架和报告基因质粒p EGFP-N2后,倒置荧光显微镜观察结果显示,3种细胞中发出荧光的细胞数量减少,荧光强度明显降低。流式细胞术检测结果显示,Hep G2细胞、He La细胞和A549细胞中共转染组和单独转染组的细胞荧光表达率差异均有统计学意义(t分别为20.80、30.35和20.34,P均0.01)。结论成功构建靶向EGFP的人工miRNA表达框架,且此表达框架能有效而特异地抑制EGFP蛋白在Hep G2细胞、He La细胞和肺癌A549细胞中的表达。     

利用重组慢病毒载体建立稳定表达绿色荧光蛋白细胞系

目的：利用重组慢病毒载体将绿色荧光蛋白基因（GFP）导入293T细胞,建立稳定表达GFP的细胞系,将GFP作为靶基因观察不同方法调节基因表达的效力的差异。方法：以载体质粒pHR＇-pCMV-GFP、包装质粒pCMV-ΔR8.2及包膜质粒pCMV-VSVG用磷酸钙共沉淀法共转染包装细胞系293T,收集病毒颗粒再次感染293T细胞,用克隆环筛选出荧光亮度较强的细胞克隆。多次传代后,流式细胞术检测细胞荧光表达的稳定性。同时进行靶向GFP的RNA干扰,观察GFP表达下调情况,验证该细胞系用于研究基因调控方法的有效性。结果：利用重组慢病毒载体可有效建立GFP稳定表达的新细胞系,此细胞系中GFP阳性细胞占99%以上,12次传代前后GFP表达无明显差异;靶向GFP的RNAi可以显著下调GFP表达。结论：成功建立了表达GFP的G4细胞系,并可有效地用于基因调节方法的研究。     

黄芩苷诱导HL-60细胞凋亡的分子机制研究

本研究旨在探讨黄芩苷对急性髓系白血病HL-60细胞增殖及凋亡的影响及其作用机制。CCK-8法检测黄芩苷对HL-60细胞增殖抑制情况;普通光学显微镜和Hoechst 33342染色后荧光显微镜下观察细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-PCR方法检测凋亡相关基因caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax mRNA表达;Westernblot检测Bcl-2、Bax、caspase-8及caspase-3剪切片段的蛋白表达。结果表明,黄芩苷对HL-60细胞具有明显的增殖抑制作用,呈浓度和时间依赖性;在光学显微镜和荧光显微镜下细胞均呈凋亡的形态学改变;AnnexinⅤ/PI法检测到细胞早期凋亡;caspase-3、caspase-9、Bax基因mRNA表达水平呈上升趋势,Bcl-2 mRNA表达水平呈下降趋势,Bax、caspase-8及capsase-3剪切片段蛋白表达上调,同时Bcl-2蛋白表达下调,Bcl-2/Bax比值降低。结论:黄芩苷显著抑制HL-60细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与降低Bcl-2/Bax比值,激活线粒体凋亡途径及死亡受体途径有关。     

miR-206靶向HSP10通路促进卵巢颗粒细胞的凋亡

目的研究miR-206对卵巢颗粒细胞凋亡的影响以及其作用的信号通路。方法 Target Scan软件预测和双荧光素酶报告基因法验证miR-206和热休克蛋白10(Heat shock protein 10,HSP10)的相互作用。采用Western blot检测过表达或抑制miR-206对HSP10的蛋白水平的影响。将miR-206模拟剂或miR-206抑制剂转染到卵巢颗粒细胞中,以正常组为对照,用Real-time PCR检测凋亡基因Bcl-2、Bax、caspase-3的表达。过表达miR-206后,用免疫荧光检测Bcl-2和caspase-3的表达。结果 Target Scan软件分析HSP10可能是miR-206的靶基因,双荧光素酶报告基因法进一步验证了miR-206和HSP10具有相互作用。过表达或降低miR-206表达,HSP10的蛋白水平变化趋势相反。过表达miR-206可以抑制Bcl-2的表达,促进Bax和caspase-3的表达;抑制miR-206表达可以促进Bcl-2的表达,抑制Bax和caspase-3的表达。过表达miR-206增强了caspase-3的荧光强度和抑制了Bcl-2的荧光强度。结论 (1)miR-206可能靶向HSP10,HSP10 3'UTR和miR-206可能的结合位点;(2)miR-206的过表达抑制了HSP10的转录活性;(3)miR-206表达的改变影响HSP10的蛋白水平;(4)miR-206表达变化影响了凋亡相关基因的表达;由此表明miR-206可能通过抑制HSP10信号通路调控颗粒细胞的凋亡参与卵巢功能的调节。     

Ku80沉默增强鼻咽癌细胞放射敏感性并诱导凋亡

目的:研究Ku80沉默对鼻咽癌细胞系放射敏感性和凋亡的影响。方法:q RT-PCR测定鼻咽癌细胞系和正常鼻咽部细胞系中Ku80 m RNA的相对表达水平;将鼻咽癌细胞系CNE2分成对照组、阴性对照Sh RNA组及Ku80 Sh RNA组,分别不感染慢病毒、感染阴性Sh RNA慢病毒、感染Ku80 sh RNA慢病毒,测定3组的感染效率,将上述3组细胞分别照射0,2,4,6,8及10 Gy,测定三组细胞存活率;流式细胞术测定细胞凋亡率。结果:Ku80 m RNA在鼻咽癌细胞系CNE2,CNE1,HONE-1及C666中相对表达量分别为9.0±0.9,8.0±0.3,5.0±0.4及4.0±0.2,Ku80 m RNA在正常鼻咽上皮细胞系NP69中的相对表达量为1.0,Ku80 m RNA在鼻咽癌细胞系中的相对表达量显著高于正常鼻咽上皮细胞系NP69,差异有统计学意义(P0.05)。慢病毒感染后,Ku80 sh RNA组Ku80 m RNA的相对表达量为0.1±0.03,显著低于阴性对照sh RNA组的0.93±0.04,差异有统计学意义(P0.001);Ku80s h R N A组Ku 8 0蛋白相对表达量为0.1 5±0.0 5,显著低于阴性对照s h R N A组的1.0,差异有统计学意义(P0.001)。Ku80 sh RNA组的细胞存活率显著低于对照组和阴性对照sh RNA组;照射后48 h,Ku80 Sh RNA组细胞凋亡率为20.0%±0.9%,对照组及阴性对照Sh RNA组凋亡率分别为4.3%±0.8%,5.0%±0.8%,Ku80 Sh RNA组凋亡率显著高于对照组和阴性对照Sh RNA组。结论:Ku80沉默表达可增强鼻咽癌细胞放射敏感性,并诱导细胞凋亡,沉默Ku80表达有望成为鼻咽癌放射增敏的靶点。     

Caspase activation is required for T cell proliferation

Triggering of Fas (CD95) by its ligand (FasL) rapidly induces cell death via recruitment of the adaptor protein Fas-associated death domain (FADD), resulting in activation of a caspase cascade. It was thus surprising that T lymphocytes deficient in FADD were reported recently to be not only resistant to FasL-mediated apoptosis, but also defective in their proliferative capacity. This finding suggested potentially dual roles of cell growth and death for Fas and possibly other death receptors. We report here that CD3-induced proliferation and interleukin 2 production by human T cells are blocked by inhibitors of caspase activity. This is paralleled by rapid cleavage of caspase-8 after CD3 stimulation, but no detectable processing of caspase-3 during the same interval. The caspase contribution to T cell activation may occur via TCR-mediated upregulation of FasL, as Fas-Fc blocked T cell proliferation, whereas soluble FasL augmented CD3-induced proliferation. These findings extend the role of death receptors to the promotion of T cell growth in a caspase-dependent manner.     

In vitro effects of ciprofloxacin and roxithromycin on apoptosis of jurkat T lymphocytes

Ciprofloxacin (CPFX) and roxithromycin (RXM) induced apoptosis of activated Jurkat T cells in vitro. CPFX showed concentration-dependent acceleration of apoptosis of activated Jurkat T cells by enhancing the expression of FasL and activities of caspase-3 and -8. RXM accelerated cell death, enhanced expression of FasL and caspase-3 but not caspase-8, and did not show the concentration dependency.     

MiRNA-146a对血管平滑肌细胞凋亡的抑制作用

目的观察miRNA-146a对血管平滑肌细胞凋亡的作用并研究其机制。方法原代培养大鼠血管平滑肌细胞，分成inhibitor组、control组和normal组，采用脂质体2000分别转染miRNA-146ainhibitors（50μM）、错义链（50μM）、PBS，realtimePCR测定转染后miRNA-146a水平，流式细胞仪检测转染后血管平滑肌细胞凋亡，western blot检测转染后Bax蛋白水平。结果转染48h后，inhibitor组血管平滑肌细胞的miRNA-146a水平明显低于normal和control组（P〈O．01），inhibitor组血管平滑肌细胞的凋亡显著高于normal、control组（P〈0．05），且Bax蛋白表达水平增加（P〈O．05）。结论miRNA-146a可以抑制血管平滑肌细胞的凋亡，其机制与抑制Bax表达相关。     

Involvement of Fas (CD95/APO-1) and Fas ligand in apoptosis induced by ganciclovir treatment of tumor cells transduced with herpes simplex virus thymidine kinase.

Transduction of cancer cells with herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSVtk) followed by prodrug ganciclovir (GCV) treatment has been shown to induce apoptosis. In this study, four murine tumors including B16F10 melanoma, NG4TL4 sarcoma, H6 hepatoma and 1MEA 7R.1 hepatoma were found to vary in sensitivity to this gene therapy strategy in vitro but, at effective doses of GCV, the HSVtk-transduced cells of all four tumors showed similar kinetics of early rise in p53 protein levels, then cell cycle S-/G2-phase arrest and finally signs of apoptosis. Immunoblot analyses revealed that Fas (CD95/APO-1), Fas ligand (FasL) and two downstream mediators, RIP and caspase-3, (CPP32, YAMA, Apopain) were increased in GCV-treated HSVtk-transduced tumor cells the cell cycle arrest and before apoptosis. Increased expression of FasL could also be observed in vivo in HSVtk-transduced tumors induced to regress by GCV treatment. Enzyme measurements using specific substrate showed that the caspase-3 activation followed kinetically the FasL expression. More than half of the HSVtk/GCV-induced cell death could be abrogated by addition to the cell culture medium of a specific antisense oligonucleotide to block FasL synthesis, a recombinant Fas/Fc chimeric protein to compete with Fas receptor for FasL binding, or cell-permeable specific tetrapeptide inhibitors of caspase-3 or caspase-8.     

特发性血小板减少性紫癜患者外周血T细胞Fas-FasL和caspase-3凋亡相关蛋白的表达及其意义

目的 探讨Fas、FasL及caspase-3凋亡相关蛋白在特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者T淋巴细胞的表达及其意义.方法 应用流式细胞术测定T细胞亚群表面Fas、FasL的表达率及细胞质中活化caspase-3的表达率,用Western blot法检测T细胞亚群caspase-3蛋白的表达.结果 与健康对照组[(29.4±8.2)%]相比,ITP患者组CD4+ T细胞表面Fas的表达率显著增加[(42.1±9.5)%](P＜0.05),CD8+ T细胞表面Fas的表达率略有增加但差异无统计学意义[(9.3±6.0)%与(13.4±5.8)%](P＞0.05).ITP患者组T细胞亚群表面FasL的表达率均较健康对照组显著增加(P＜0.05).ITP患者组T细胞亚群胞质中活化caspase-3的表达率,明显高于健康对照组(P＜0.05).Western blot检测结果显示,与治疗前相比,ITP患者治疗后CD4+ T细胞表达pro-caspase-3和cleaved-caspase-3均明显减少(P＜0.05).结论ITP患者外周血T细胞Fas、FasL及caspase-3表达明显增加,激素治疗可干预Fas-FasL、caspase-3的表达水平,提示Fas、FasL及caspase-3信号通路在ITP发生机制中起一定作用.     

下调人乳腺癌MCF-7细胞系miRNA-221和miRNA-222表达对抑制肿瘤细胞增殖及迁移能力的探讨

目的通过敲低微小RNA(microRNA,miRNA)-221和miRNA-222的表达上调组织金属蛋白酶抑制剂3(TIMP3)的方法来研究人乳腺癌MCF-7细胞系的增殖和迁移能力。方法根据miRBase数据库中Homo sapiens(hsa)-miRNA-221和hsa-miRNA-222的寡核苷酸序列和一段无义序列分别设计并重组成质粒:反义抑制miRNA-221(antisense-miRNA-221,AS-miRNA-221)、反义抑制miRNA-222(antisense-miRNA-222,AS-miRNA-222)、共同反义抑制miRNA-221/222(antisense-miRNA-221/222,AS-miRNA-221/222)和无义抑制(Scramble),并将其分别利用脂质体LipofectamineTM2000转染进人乳腺癌MCF-7细胞中,经G418筛选后建立稳定表达的对照细胞株[未转染正常细胞(Control组)和无义抑制细胞(Scramble组)]和低表达miRNA-221、miRNA-222细胞株(即ASmiRNA-221组、AS-miRNA-222组和AS-miRNA-221/222组)。转染24 h后于荧光显微镜下观察转染效率;采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测各组细胞中miRNA-221和miRNA-222的表达量,采用逆转录PCR检测各组细胞中质粒载体上携带的抗性neo基因的表达情况,以此来验证转染是否成功;分别采用实时荧光定量PCR、免疫印迹法检测TIMP3和金属蛋白酶17(ADAM17)的表达差异;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测并绘制生长曲线,观察低表达miRNA-221、miRNA-222各组细胞的生长能力;采用划痕修复实验观察转染后细胞的迁移能力。结果转染24 h之后,在荧光显微镜下观察到各转染组细胞的绿色荧光蛋白表达较多,即转染效率较高。检测转染后各组细胞中neo基因、miRNA-221和miRNA-222的表达。与Control组比较,Scramble组、ASmiRNA-221组、AS-miRNA-222组、AS-miRNA-221/222组neo基因表达明显升高;与Scramble组比较,AS-miRNA-221组、AS-miRNA-222组、AS-miRNA-221/222组miRNA-221和miRNA-222的表达量明显降低,即证实转染了反义抑制miRNA-221/222的低表达稳定细胞株构建成功。与Scramble组比较,AS-miRNA-221组、AS-miRNA-222组、AS-miRNA-221/222组细胞TIMP3 mRNA表达升高,而其调控的ADAM17水平降低。生长曲线显示低表达miRNA-221、miRNA-222各组细胞的生长能力明显受到抑制。划痕修复实验结果显示低表达miRNA-221、miRNA-222各组细胞的迁移能力降低。结论通过敲低miRNA-221、miRNA-222、上调TIMP3表达可以抑制人乳腺癌细胞系MCF-7的增殖和迁移能力。     

miRNA-592在肾细胞癌进展中作用及其与预后关系研究

目的 探讨miRNA-592在肾细胞癌(RCC)中的作用及其与预后的关系.方法 逆转录-聚合酶链反应检测110例RCC组织及其配对的癌旁组织、正常人肾上皮细胞系(HK-2)和人RCC细胞系(786-O、ACHN、Caki-1和769-P)中miRNA-592的表达.分析miRNA-592与RCC临床病理特征及生存预后的...     

miRNA-150、miRNA-146a在脓毒症患儿血清中的表达及其临床意义

[目的]探讨miRNA-150、miRNA-146a在脓毒症患儿血清中的表达及临床意义.[方法]选取2014年2月至2016年2月在本院儿科ICU病房住院的脓毒症患儿62例(脓毒症组),另外选取同时期的全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS)患儿30例(SIRS组),30例健康儿童作为健康对照组,比较三组及不同脓毒症病情患儿外周血中的miRNA-150、miRNA-146a、TNF-α和IL-10水平.[结果]脓毒症患儿外周血中的miRNA-146a、TNF-α和IL-10水平均明显高于健康对照组和SIRS组,而miRNA-150水平明显低于健康对照组和SIRS组,其差异有统计学意义(P＜0.05);不同严重程度脓毒症患儿外周血miRNA-150、miRNA-146a、TNF-α和IL-10水平具有显著的差异(P＜0.05);miRNA-150与SOFA评分、TNF-α、IL-10呈现负相关(P ＜0.05);miRNA-146a与SOFA评分、TNF-α、IL-10呈正相关.[结论]脓毒症患儿外周血中的miR-NA-150下调,miRNA-146a上调,两者表达水平与患儿炎症因子水平及疾病预后等密切相关.     

c-FLIP mediates resistance of Hodgkin/Reed-Sternberg cells to death receptor-induced apoptosis

Resistance to death receptor-mediated apoptosis is supposed to be important for the deregulated growth of B cell lymphoma. Hodgkin/Reed-Sternberg (HRS) cells, the malignant cells of classical Hodgkin's lymphoma (cHL), resist CD95-induced apoptosis. Therefore, we analyzed death receptor signaling, in particular the CD95 pathway, in these cells. High level CD95 expression allowed a rapid formation of the death-inducing signaling complex (DISC) containing Fas-associated death domain-containing protein (FADD), caspase-8, caspase-10, and most importantly, cellular FADD-like interleukin 1beta-converting enzyme-inhibitory protein (c-FLIP). The immunohistochemical analysis of the DISC members revealed a strong expression of CD95 and c-FLIP overexpression in 55 out of 59 cases of cHL. FADD overexpression was detectable in several cases. Triggering of the CD95 pathway in HRS cells is indicated by the presence of CD95L in cells surrounding them as well as confocal microscopy showing c-FLIP predominantly localized at the cell membrane. Elevated c-FLIP expression in HRS cells depends on nuclear factor (NF)-kappaB. Despite expression of other NF-kappaB-dependent antiapoptotic proteins, the selective down-regulation of c-FLIP by small interfering RNA oligoribonucleotides was sufficient to sensitize HRS cells to CD95 and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis. Therefore, c-FLIP is a key regulator of death receptor resistance in HRS cells.