DNA聚合酶β过表达对食管癌EC9706细胞的影响

目的:观察过表达的DNA聚合酶β对食管癌EC9706细胞系的影响.方法:运用PCR方法,从质粒pcDNA3.1-polβ中扩增出野生型和突变型的DNA聚合酶β基因,作为目的片段,定向克隆至pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体,获得野生型和突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-polβ.分别将野生型和突变型的pEGFP-C3-polβ转染EC9706细胞,荧光显微镜观察其定位,绘制生长曲线,测定细胞周期.结果:DNA序列分析证实了重组载体中的DNA聚合酶β序列正确,荧光显微镜结果显示野生型的DNA聚合酶β表达以细胞核为主,突变型的DNA聚合酶β则表达在整个细胞中,明显与野生型的DNA聚合酶β的核定位不同.而且,野生型的细胞生长较对照组缓慢(P＜0.05),野生型的还能抑制EC9706细胞的生长和使S期细胞减少(22.11±0.12 vs 44.86±0.03,P＜0.05),而突变型的则不能促进EC9706细胞的生长,S期细胞增殖不明显(P＞0.05).结论:过表达的野生型食管癌DNA聚合酶β可以降低EC9706细胞的增殖.     

食管癌点突变型DNA聚合酶β与绿色荧光蛋白重组表达载体的构建

目的构建携带食管癌点突变型DNA聚合酶β基因的重组真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-polβ.方法运用PCR方法,从质粒pcDNA3.1-polβ中扩增出点突变型的DNA聚合酶β基因,作为目的片段,T-A克隆至pGEM-TEasy载体,再定向克隆至pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体,重组质粒pEGFP-C3-polβ用限制性内切酶酶切和通用鉴定引物PCR扩增鉴定,并进行DNA序列分析.结果 DNA序列分析证实了重组载体中的DNA聚合酶β序列与已知的点突变型DNA聚合酶β基因序列相符.结论成功构建了携带食管癌点突变型DNA聚合酶β基因的重组的荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-polβ,为DNA聚合酶β基因的体内外表达及蛋白定位提供了理想的标记.     

二甲亚砜对人食管癌Eca109细胞细胞周期及DNA聚合酶β表达的影响

目的研究二甲亚砜(DMSO)对人Eca109细胞细胞周期及DNA聚合酶β(polβ)表达的影响。方法用1．5％DMSO处理Eca109细胞，流式细胞仪分析细胞周期的改变，RT—PCR法检测polβ表达水平的变化。结果DMSO处理后的Ecal09细胞，polβmRNA表达明显下调，且细胞周期明显改变，G1／G0期细胞增多，S期细胞减少。结论DMSO可抑制Eca109细胞polβ的表达，使Eca109细胞生长停滞于G1／G0期。     

DNA聚合酶β基因启动子在食管癌组织中的突变分析

目的:研究人食管癌组织、癌旁组织及其远端正常黏膜组织中DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,polβ)基因启动子的突变情况.方法:采用聚合酶链反应(PCR)、DNA序列分析技术对25例食管癌患者手术切除的病变标本进行DNA pol β基因启动子序列检测,并利用DNASIS、OMIGA等软件分析测序数据.结果:25例中,食管癌组织、癌旁组织和正常黏膜组织中DNA polβ基因启动子发生突变者分别为8、6、5例,三组问突变率差异无统计学意义.在三组标本中共有35个突变点(癌组织包括18个突变点,癌旁组织包括9个突变点,正常黏膜组织8个突变点),25个点在polβ核心启动子区域,其中,-37位C→A突变出现8次;.-5位G→T突变出现7次;29位T→C突变出现2次;-19位出现C的缺失和插入C突变各1次.结论:DNA polβ基因启动子突变可能与食管癌的发生和发展有关.     

前列腺癌特异突变DNA聚合酶β真核表达载体构建及鉴定

目的 构建前列腺癌(PCa)特异突变DNA聚合酶β(polβ)真核表达载体.方法 提取有特异DNA polβ突变的PCa组织的总RNA,通用引物逆转录成cDNA;用设计带有接头的DNA polβ全基因引物,PCR扩增PCa组织中呈现的突变型DNA polβ全基因;构建T-A克隆并进行重组体的筛选鉴定;亚克隆入表达载体pcDNA3.1并进行重组体的筛选和鉴定.结果 PCa特异突变DNA polβ基因扩增选择出P4(MI-polβ)和P5(M2-polβ)两个标本,构建重组有特定突变位点的polβ目的 基因的pcDNA3.1真核表达载体,经PCR扩增获得2个阳性集落.结论 经鉴定成功构建2例PCa特异突变DNA polβ真核表达载体(pcDNA3.1-M1 and peDNA3.1-M2).     

前列腺癌特异突变DNA聚合酶β表达载体转染NIH3T3的细胞生物学行为变化

目的观察前列腺癌(CPa)特异突变DNA聚合酶β(polβ)表达载体转染NIH3T3的细胞生物学行为变化。方法采用业已成功构建的2例特异突变polβ表达载体(pCDNA3.1-M1和pCDNA3.1-M2),采用脂质体包裹转染NIH3T3细胞,观察比较这些突变对细胞polβ基因mRNA和蛋白表达的影响以及引发的相应的细胞周期和细胞自发突变率等细胞生物学行为的变化。结果筛选得到高表达PCa特异突变polβ的NIH3T3细胞株(NIH3T3-M1,NIH3T3-M2)和高表达野生型polβ的NIH3T3细胞株(NIH3T3-W)。RT-PCR和Western印迹结果显示,外源DNApolβ在转化的NIH3T3细胞中呈现高表达。与转染空载体和未转染的NIH3T3细胞相比,转染PCa特异突变polβ的2个细胞株和转染野生型polβ的细胞株的细胞周期的S期比例及转染细胞的HGPRT(次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)基因的自发突变率均显著增加,且转染野生型polβ的细胞株亦显著高于转染PCa特异突变DNApolβ的细胞株。结论 DNApolβ高表达介导了肿瘤发生的分子机制。     

转染kiss-1基因对人食管癌EC9706细胞裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:研究转染kiss-1基因对人食管癌EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤的作用,探讨其在食管癌基因治疗中的可行性和特异性.方法:在食管癌细胞系EC9706中转染kiss-1基因,经G418筛选,建立稳定高表达Kiss-1蛋白的细胞系.稳定表达该基因的细胞为转染kiss-1基因组,转染空质粒细胞及未处理细胞为对照组,建立裸鼠荷瘤模型;监测肿瘤生长变化,HE染色观察肿瘤病理学变化,RT-PCR、Western blot方法检测kiaa-1 mRNA和蛋白变化.结果:转染kiss-1基因组肿瘤生长受到显著抑制:HE染色显示转染kiss-1基因组及转染空质粒纽肿瘤组织内坏死均较空白对照组多;RT-PCR、Western blot结果表明转染kiss-1基因组裸鼠肿瘤组织kiss-1 mRNA和蛋白表达均显著升高,三组间比较差异具有统计学意义(F=72.685,24.807,均P<0.05).结论:转染kiss-1基因能抑制人食管癌EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤的形成,且能有效上调kiss-1 mRNA和蛋白的表达,可为食管癌的基因治疗提供新的靶点、开辟新的思路.     

HPA反义寡核苷酸对人食管癌EC9706细胞中HPA蛋白表达的影响

目的　探讨乙酰肝素酶 (HPA)反义寡核苷酸 (ASODN)对人食管癌 EC970 6细胞中 HPA蛋白表达的影响。方法　将食管癌 EC970 6细胞体外分组贴壁培养 ,实验组分别用设计合成的 10、2 0、30 μm ol/ L 三种浓度的 4条封闭肝素酶不同基因位点的 ASODN(ASODN- t1 、ASODN- t2 、ASODN- t3、ASODN- t4 )。对照 组为 1条无关寡核苷酸 (N - ODN)转染 EC970 6细胞 ,对照 组为无转染。采用免疫组化 (SP)法检测各组 EC970 6细胞中HPA蛋白表达情况。结果　实验组中 3种浓度的 4条 HPA- t2 效应最强。不同浓度的 4条 HPA ASODN对EC970 6细胞中 HPA蛋白表达的影响无统计学意义 (P >0 .0 5 ) ,但均低于对照 组及对照 组 (无转染 )(P<0 .0 5 )。结论　HPA ASODN可抑制食管癌 EC970 6细胞中 HPA蛋白表达。     

DMBT1过表达对食管癌细胞系EC9706生物学行为的影响

目的: 建立稳定表达候选抑癌基因DMBT1的食管癌细胞系EC9706,并分析转染前后其增殖特点、转移侵袭能力的变化.方法: 脂质体介导法将DMBT1的全长表达质粒转染食管癌细胞系EC9706,G418筛选阳性克隆细胞,Western blot及RT-PCR检测DMBT1蛋白及mRNA水平变化,MTT法绘制细胞生存曲线及无血清条件下测细胞生存抑制率,Transwell实验检测细胞趋化迁移能力变化.结果: 通过稳定转染后,DMBT1蛋白水平及mRNA水平均比对照组提高3.2倍以上,与对照组比较,差异有显著意义( P<0.01);实验组细胞增殖速度、倍增时间、对数生长期等均比对照组细胞更为缓慢,在无血清培基中增殖抑制率随时间延长不断增高,实验组迁移细胞数为206±25,对照组为367±42,2组比较差异有显著意义( P<0.01).结论: 在体外成功建立稳定表达DMBT1的细胞系,DMBT1过表达在体外显著抑制食管癌细胞系EC9706的生长增殖及趋化迁移.     

胃癌中DNA聚合酶β的突变及与胃癌分化程度的关系

肿瘤的发生是多个基因突变积累的结果。这些突变包括参与DNA复制和修复以及维持基因稳定性和完整性的基因，其中DNA聚合酶β（polβ）和肿瘤的关系受到越来越多的关注。polβ是一种修复酶，其突变的存在与一些肿瘤的发生有关。胃癌病因起源复杂，推测在其发生发展过程中一定伴有DNA损伤修复，然而有关胃癌中有无polβ突变国内尚少见报道。本研究对胃癌及癌旁组织标本进行ploβ突变检测。     

稳定表达点突变型DNA聚合酶β的细胞系的建立

目的建立稳定表达点突变型DNA聚合酶β的细胞系。方法将已构建的点突变型DNA聚合酶β的真核表达载体用脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞．经G418筛选后得到稳定转染的细胞株，用RT—PCR方法鉴定点突变型DNA聚合酶βmRNA水平的表达。结果与结论建立稳定表达DNA聚合酶口的细胞株，为进一步研究突变的DNA聚合酶β的功能变化奠定基础。     

常见DNA聚合酶γ基因突变和线粒体疾病

DNA聚合酶是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶γ（polγ）存在于人类线粒体中,它是线粒体DNA复制和修复所必须。DNA聚合酶γ基因（POLG）发生突变后会导致其编码的polγ功能发生改变,使线粒体DNA（mtD—NA）复制及线粒体氧化磷酸化等功能障碍,引起线粒体相关疾病。对这些突变位点及其与疾病关系的研究为线粒体疾病的发病机制及治疗等提供了线索。本文对一些POLG常见位点突变相关研究进行了综述。     

新型核苷类似物β-L-D4A对人DNA聚合酶β和δ的作用及其机制

目的:对人DNA聚合酶δ进行纯化和鉴定,通过检测β-L-D4A对人DNA聚合酶β和δ的作用,观察β-L-D4A的毒副作用.方法:运用多次离子交换层析的方法提取、纯化人Hela细胞的DNA聚合酶δ:检测β-L-D4A对人DNA聚合酶β和δ的酶动力学作用.结果:提纯并鉴定了DNA聚合酶δ,收得率是15%,比活力是1911 Ukat/mg.β-L-D4A为抑制剂时,对人DNA聚合酶β和δ的酶动力学参数分别是Km=1.86 μmol/L,2.45μmol/L,IC50=25.21 μmol/L和150.1μmol/L,Ki=24.03μmol/L和132.7μmol/L,结果均提示β-L-D4A对DNA聚合酶β和δ的抑制作用远小于拉米夫定,结论:β-L-D4A是人DNA聚合酶β和δ的竞争性抑制剂,他对这两种酶的毒副作用远小于拉米夫定,可望成为更高效低毒的抗HBV类药物.     

新型核苷类似物beta-L-D4A对人DNA聚合酶β和δ的作用及其机制

目的: 对人DNA聚合酶δ进行纯化和鉴定, 通过检测β-L-D4A对人DNA聚合酶β和δ的作用, 观察β-L-D4A的毒副作用. 方法: 运用多次离子交换层析的方法提取、纯化人Hela细胞的DNA聚合酶δ; 检测β-L-D4A对人DNA聚合酶β和δ的酶动力学作用. 结果: 提纯并鉴定了DNA聚合酶δ, 收得率是15%, 比活力是1911 Ukat/mg. beta-L-D4A为抑制剂时, 对人DNA聚合酶β和δ的酶动力学参数分别是Km = 1.86 mumol/L, 2.45 mumol/L, IC50 = 25.21 mumol/L和150.1 mumol/L, Ki = 24.03 mumol/L和132.7 mumol/L, 结果均提示β-L-D4A对DNA聚合酶β和δ的抑制作用远小于拉米夫定. 结论: beta-L-D4A是人DNA聚合酶β和δ的竞争性抑制剂, 他对这两种酶的毒副作用远小于拉米夫定, 可望成为更高效低毒的抗HBV类药物.     

Tumstatin-EGFP真核表达载体构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建重组tumstatin-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的分泌型真核表达载体质粒,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-K1).方法 利用重叠多聚酶链反应(PCR)技术从pGEM-T/STL质粒和pEGFP-C2质粒中扩增出STL-EGFP,用DNA重组技术将片段定向插入pIRESneo3质粒中,经酶切和序列验证正确后,用lipofectamine 2000转染CHO-K1细胞,通过G418筛选建立稳定转染的CHO细胞系,用逆转录-PCR、Western blot检测tumstatin-EGFP的表达,用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达.结果 重组真核表达载体正确构建并在CHO细胞获得稳定表达,tumstatin-EGFP基因整合入细胞基因组DNA,培养液上清有融合蛋白tumstatin-EGFP的分泌,绿色荧光蛋白的表达高达95%以上.结论 成功构建了质粒PIRESneo3-STL-EGFP,获得稳定表达tumstatin-EGFP的细胞系.     

衰老过程中大白鼠脾细胞DNA聚合酶催化DNA合成的忠实性研究

从大鼠脾细胞提取DNA聚合酶,经DEAE纤维素分离可分为DNA聚合酶α及β,DNA聚合酶的活性与衰老无关,而DNA聚合酶α催化DNA合成的忠实性在衰老过程中明显降低,当DNA合成的反应体系中缺失三种脱氧核苷酸时,断乳鼠、青年鼠及老年鼠脾细胞DNA聚合酶α的活性分别相当于4种脱氧核苷酸均存在时的4.0％,7.6％及13.9％。DNA聚合酶α催化DNA合成的忠实性还受二价阳离子的影响,当以M■~( )代替Mg~( )时,其忠实性降低。DNA聚合酶β催化DNA合成的忠实性与衰老无关。     

聚合酶链反应DNA扩增对活动性肺结核的诊断价值

为探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）ＤＮＡ扩增对诊断活动性肺结核的临床价值，本文用ＰＣＲ技术扩增结核杆菌特有的ＭＰＢ６４蛋白基因序列，对１２１例病人临床标本进行检测。发现３４例活动性肺结核中有２８例ＰＣＲ阳性；疑诊为肺结核者３３例中有１８例阳性；非结核肺疾患５４例中有１０例阳性，其中有肺结核既往史者阳性６例，有结核接触史者阳性３例。提示ＰＣＲ阳性并非为活动性肺结核所特有。     

人肺腺癌紫杉醇耐药细胞系DNA polβ的表达

目的建立人肺腺癌紫杉醇多药耐药细胞系,测定耐药细胞系DNA聚合酶β（DNA polβ基因和蛋白表达。方法以紫杉醇为诱导药．人肺腺癌细胞系（A549）为诱导对象,逐步增加紫杉醇药物浓度进行诱导,建立耐紫杉醇的多药耐药细胞系A549／TXL20。采用MTT法检测A549／TXL20耐药指数,同时对顺铂、长春新碱、5氟脲嘧啶、丝裂霉素和羟基尿素五种药物进行交叉耐药检测。RC—PCR法和Western blotting法分别测定细胞内DNApolβ表达水平。结果A549／TXL20对紫杉醇及其他五种抗癌药物均有不同程度的耐药性。A549／TXL20细胞中DNA polβ mRNA及蛋白的表达水平均高于A549细胞（P〈0．05）。结论A549／TXL20具有多药耐药表型,耐药性产生可能与细胞内DNA polβ表达增高有关。     

真核生物DNA聚合酶δ的生物学功能

DNA聚合酶是指以脱氧核苷三磷酸为底物催化合成DNA的一类酶。1955年Arthur首次分离得到DNA聚合酶。之后真核生物的DNA聚合酶陆续被发现有多个种类，其中DNA聚合酶α、δ、ε是DNA聚合酶B家族的成员，     

DNA聚合酶β活力测定在肺癌诊疗中的意义

DNA聚合酶β是一种重要的DNA修复酶,它在肿瘤诊断和治疗中的意义近年来才被人们关注。本文通过选用DNA聚合酶专一性抑制剂和~3H—TTP掺入法,测定了25例肺癌患者外周血淋巴细胞中DNA聚合酶β的活力,并与同期收治的14例肺结核病人相对照,旨在探讨测定该酶活力在肺癌诊断、鉴别诊断和治疗中的意义。结果显示,肺癌病人外周血淋巴细胞中DNA聚合酶β活力明显高于肺结核病人(P<0.05),这种现象在不同年龄肺癌病人(33～81岁)中均存在;化疗1至2周内,该酶活力出现下降(P<0.05),化疗后3周时仍有下降趋势,并且下降越明显,疗效越好。上述结果表明,肺癌病人外周血淋巴结胞DNA聚合酶β活力有异常升高,这对肺癌的诊断或鉴别诊断有一定辅助意义。同时也提示,通过分析肺癌病人化疗前后DNA聚合酶β活力,可能有助于对病人的疗效分析。化疗以后,该酶活力下降越多,肺癌的DNA修复能力削弱就越重,疗效相对较好。