基于α-病毒复制酶的基因疫苗对人黑色素瘤的免疫作用

目的研究基于α-病毒复制酶的人黑色素瘤基因疫苗免疫学作用.方法建立及鉴定人/鼠嵌合模型(trimera),将基于α-病毒复制酶的mage-3基因疫苗免疫动物,检测动物体内特异抗体滴度;用标准4 h51Cr释放实验检测动物体内特异CTL活性.结果FACS分析显示,trimera小鼠腹腔细胞中人白细胞占总细胞的88.84%,脾脏细胞中人白细胞的比例占57%,同国外文献报道一致.基于α-病毒复制酶的重组基因疫苗mage-3/pSMART2a对trimera小鼠免疫后,小鼠腹腔细胞的CTL在效靶比为100:l时杀伤率达到70%左右,此时的对照组mage-3/pCI-neo组最大杀伤率为40%左右.ELISA结果显示,重组基因疫苗mage-3/pSMART2a组产生的mage-3抗原特异性抗体效价达到1:512,mage-3/pCI-neo组为1:256.结论成功建立了人/鼠嵌合模型,并在动物体内激发出针对人黑色素瘤基因疫苗的初次免疫应答.     

人肿瘤特异抗原MAGE-3基因疫苗的构建和表达

目的：克隆肿瘤特异性共享抗原mage-3基因，制备基于α－病毒复制酶的高效黑色素瘤特异性基因疫苗。方法：用RT-PCR方法从黑色素瘤细胞系LB373中制备mage-3基因，以含α－病毒复制酶的哺乳细胞高效表达质粒pSMART2a为载体，构建重组DNA疫苗。重组子用载体中的T7和T3启动子序列为测序引物进行自动测序。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化293细胞，用免疫印迹法和免疫组化法鉴定转化细胞中mage-3蛋白的表达。结果：正确构建了mage-3/pSMART2a重组质粒，并且在转化此质粒的293细胞中检测出了mage-3蛋白的表达。结论：此重组mage-3/pSMART2a质粒可以作为肿瘤特异的DNA疫苗，可进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及相关免疫学效应研究。     

HER2/neu诱导DBA/2小鼠特异性CTL应答及其抑瘤效应研究

目的：探讨HER2/neu原癌基因DNA疫苗免疫诱导特异性细胞免疫应答及其在体内的抑瘤效应。方法：将重组HER2/neu原癌基因真核表达载全转染P815细胞，用细胞组织化学及Western-blot方法鉴定质粒在细胞中的表达。在DBA/2小鼠体内构建表达HER2抗原的肿瘤动物模型，通过重组质粒免疫小鼠，诱导小鼠产生细胞免疫应答，观察免疫动物体内的抗瘤效应。结果：在体外获得了稳定表达HER2/neu基因的P815细胞；免疫小鼠脾细胞中诱导出特异性CTL，并杀伤HER2/neu阳性的P815细胞；荷瘤小鼠的肿瘤生长受抑，存活期延长。结论：HER2/neu原癌基因DNA疫苗免疫可诱导特异性细胞免疫应答，并具有一定抗瘤效应。     

肿瘤抗原P1A与细胞因子mGM-CSF共表达载体的构建和表达

目的：构建并鉴定细胞因子mGM-CSF和肿瘤特异抗原PIA共表达载体，为研究新型的肿瘤疫苗提供新的策略。方法：以PCR方法从pCI-neo／PIA中扩增出PIA编码基因片段，构建于pRSC质粒上；再从pORF-mGM-CSF中扩增出mGM-CSF基因片段．插入pRS-PIA重组质粒PIA基因的上游。以酶切和DNA测序进行鉴定。并将鉴定过的重组质粒以脂质体法转染7721细胞．用RT-PCR法鉴定转染细胞中PIA基因和mGM-CSF基因的表达。结果：经酶切鉴定和DNA测序证实mGM-CS17和PIA重组质粒构建正确，并在转染此质粒的7721细胞中检测出了PIA和mGM-CSF基因的表达。结论：成功构建mGM-CSF和PIA的共表达载体，为研制新型肿瘤疫苗奠定了基础。     

基因-病毒载体的研制及其抗肿瘤作用的初步研究

目的：研究一种结合肿瘤基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤治疗载体系统,即基因－病毒载体系统。方法：利用病毒重组技术将抗癌基因插入肿瘤细胞特异性的增殖病毒的病毒基因组中,通过细胞病理作用、荧光显微镜、免疫酶链技术及电镜等技术分别观察病毒的杀伤效应、报告基因绿色荧光蛋白、抗癌基因小鼠白细胞介素12表达量及病毒复制情况。结果构建了一种新型基因－病毒载体系统,该载体系统腺病毒E1b55000蛋白缺失,保留了腺病毒E1a蛋白。该载体系统具有肿瘤增殖病毒ONYX－015的相似功能,即它可在肿瘤细胞内复制及增殖,而在正常细胞内不能复制及增殖,从而特异性杀灭肿瘤细胞。该载体系统还可携带各种抗癌基因以进一步提高抗肿瘤的疗效。应该该载体系统携带该报告基因荧光蛋白可使绿色荧光蛋白在肿瘤细胞内高效表达,其表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体系,而在正常细胞内低表达,表达量与传统腺病毒载体系统相似或更低。应用该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素12,也产生类似结果。电镜也证实该载体系统携带抗肿瘤基因小鼠白细胞介素12可在肿瘤细胞株中复制及增殖。结论：基因－病毒载体将抗癌基因插入肿瘤增殖病毒基因组,可数百倍乃至上万部提高抗癌基因的表达量,进一步提高抗肿瘤的疗效。     

HER2/neu动物模型的建立和免疫学鉴定

目的 建立表达人HER2／neu原癌基因的动物肿瘤模型并用免疫学方法加以鉴定。方法 将重组HER2／neu原癌基因真核表达载体转染P815细胞，有限稀释法筛选出稳定表达HER2／neu基因的P815肿瘤细胞株：用Western blot方法鉴定HER2／neu基因在P815细胞中的表达。在DBA／2小鼠体内建立表达HER2抗原的肿瘤动物模型，再通过表达HER2／neu基因的重组质粒免疫小鼠，诱导小鼠产生特异性HER2／neu基因特异的CTL应答，从免疫学方面鉴定HER2／neu动物肿瘤模型建立成功。结果 在体外获得了稳定表达HER2／neu基因的P815细胞株；免疫小鼠脾细胞中诱导出特异性CTL。结论 本研究成功建立了HER2／neu动物肿瘤模型，HER2／neu原癌基因DNA疫苗免疫可在体诱导特异性细胞免疫应答。     

腺病毒介导的HSV—tk体外抗喉癌作用

目的：观察HSV－tk/GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用。方法：将带有报告基因LacZ的5型缺陷性腺病毒载体AdCMVLacZ感染喉癌细胞Hep-2,X-gal染色，测定腺病毒的转染率。利用同源重组技术构建含HSV－tk基因的重组腺病毒载体AcCMVtk。AdCMVtk感染Hep-2细胞后，加入10mg/LGCV,佼 活率及旁观者效应。结果：随着腺病毒感染复数量（multiplicity of infection,MOI)增加，对Hep-2细胞转染率亦增加，100％转染所需的MOI为200。AdCMVtk/GCV对Hep-2细胞的杀伤强度与AdCMVtk量呈正向关系，即有浓度依赖性。此杀伤作用存在旁观者效应，但较弱。结论：腺病毒介导的HSV－tk/GCV具有杀伤喉癌细胞作用。     

可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的构建及体内外表达

目的构建以塞姆利基森林病毒复制子载体为基础的可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB,验证其在人胚肾293T细胞及免疫小鼠肌肉组织内的表达情况。方法首先用NheI酶切既往构建的pVAX1-2PFcGB重组质粒,补平酶切后的粘末端,然后再用限制性内切酶BssHII继续酶切该线性化质粒,补平粘末端后即获得含有编码Survivin及hCGβ-CTP37肿瘤抗原的融合基因片段2PFcGB,接着利用DNA重组技术将该片段克隆入基于塞姆利基森林病毒复制子载体改造的PSCK载体,筛选阳性重组质粒。接着,利用阳离子脂质体介导法将其瞬时转染入人胚肾293T细胞,利用流式细胞术及免疫荧光法检测融合抗原在293T细胞中的表达;利用电脉冲基因导入仪将该重组质粒递送至BALB/C小鼠股四头肌,利用免疫组化法验证肿瘤抗原在小鼠体内的表达。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小与预期一致,流式细胞术检测该重组质粒瞬时转染的293T细胞,可见大量的阳性荧光细胞,其IRES序列上游融合肿瘤抗原分子阳性表达率为5.70%,下游佐剂分子阳性表达率为19.75%;同时,利用两种肿瘤抗原特异抗体在免疫小鼠股四头肌组织切片上均检测到了相应表达。结论成功构建了可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB,该重组质粒在体内外均能高效表达外源肿瘤抗原及佐剂分子,这些结果为该抗肿瘤DNA疫苗进一步的抑瘤活性及免疫学作用机制的研究奠定了坚实的实验基础。     

基因疫苗在肿瘤免疫治疗中的研究进展

肿瘤的治疗目前仍是世界性的难题,随着免疫学和分子生物学的发展,肿瘤疫苗的发展经历了肿瘤细胞疫苗、重组蛋白疫苗和基因疫苗三个阶段。肿瘤基因疫苗也称DNA疫苗,是目前研究的热点,主要包括与肿瘤相关抗原（TAAs）有关的全长、表位、独特型（Id）和融合DNA疫苗,能够自主复制的RNA疫苗,与树突细胞（DCs）相关的肿瘤基因疫苗等。近年来,肿瘤基因疫苗在动物基础研究和临床前研究,     

增殖型腺病毒载体介导mIL-12基因对胃癌细胞的杀伤作用

目的:观察增殖型腺病毒载体介导的mIL-12基因对胃癌细胞的杀伤作用.方法:利用携带mIL-12基因的增殖型腺病毒转染胃癌细胞株SGC-7901,通过病毒增殖实验、细胞病理效应、酶链免疫反应等分别观察病毒复制能力、病毒对胃癌细胞的杀伤作用及mIL-12表达水平.结果:携带mIL-12基因的增殖型腺病毒转染胃癌细胞株SGC-7901具有肿瘤增殖型腺病毒ONYX-015的相似作用,可在肿瘤细胞内复制、增殖并杀死肿瘤细胞,而并不能在正常细胞内复制及增殖.该病毒在肿瘤细胞内的增殖能力是传统载体的近千倍.该载体携带的mIL-12基因的表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体体系,是传统基因治疗表达量的百倍.结论:CNHK200-mIL-12能在胃癌细胞中增殖并杀死胃癌细胞,并提高目的基因的表达水平,可能为胃癌治疗提供一新途径.     

小鼠肥大细胞瘤P815特异抗原P1A的克隆与表达

目的 克隆小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５细胞株的ＰＩＡ基因以制备肿瘤ＤＮＡ疫苗,方法 用ＲＴ－ＰＣＲ方法制备ＰＩＡ基因,以哺乳细胞高效表达质粒ｐＣＩ－ｎｅｏ为载体,构建重组ＤＮＡ疫苗。重组体用克隆位点上游和下游的Ｔ７和Ｔ１３启动了序列为测序引物,用自动测序仪测定鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用磷酸钙法转化２９３细胞,用ＲＴ－ＰＣＲ法鉴定转化细胞中ＰＩＡ基因的表达。结果 正确构建了ＰＩＡ／ｐＣＩ－ｎ     

共刺激分子B7.1和葡萄球菌肠毒素A膜表面共修饰瘤苗抗肿瘤作用的研究

目的 观察跨膜型葡萄球菌肠毒素A(SEA-TM)和糖基化磷脂酰肌醇锚定型mB7．1(mB7．1-GPI)二种免疫分子膜表面修饰瘤苗的抗肿瘤作用是否优于单种免疫分子膜表面修饰的瘤苗。方法构建pcDNA3．1( )／mB7．1-GPI真核表达载体,转染中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)中,表达和纯化mB7．1-GPI。通过蛋白转染法将SEA-TM、mB7．1-GPI单独或共同锚定到EL-4肿瘤细胞膜上,制成瘤苗,观察这些瘤苗刺激小鼠脾细胞的增殖和分泌白细胞介素(IL)-2和γ干扰素(IFN)-γ的量及抗肿瘤作用。结果mB7．1-GPI。和SEA-TM能单独或共同锚定在肿瘤细胞膜上,具有相当的稳定性;在体外有刺激小鼠脾细胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ的功能。mB7．1-GPI、SEA-TM、mB7,1-GPI SEA-TM锚定肿瘤细胞,制成的瘤苗,能抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长和延长荷瘤小鼠的存活时间。mB7．1-GPI和SEA-TM双锚定瘤苗,显示出比单一蛋白锚定瘤苗更强的抗肿瘤作用。结论用蛋白转染法将SEA和mB7.1二种免疫分子同时锚定到肿瘤细胞膜上所制成的瘤苗,其抗肿瘤作用优于单种免疫分子锚定的瘤苗。     

评价肿瘤疫苗免疫原性的新型人免疫系统小鼠模型

人免疫系统(human immune system,HIS)小鼠大都用于评价肿瘤疫苗诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)效应的能力,却不能准确反映肿瘤疫苗诱导体液免疫应答的能力。本研究利用密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,与体外诱导分化的同源树突状细胞(dendritic cells,DCs)共移植到NCG小鼠中从而建立DC-HIS小鼠模型。在DC-HIS小鼠中,共移植的抗原递呈细胞(HLA-DR⁺CD11c⁺)能定植于模型小鼠脾脏;DCs共移植也显著提高了激活的人CD4⁺ T/CD8⁺ T细胞和人B细胞的比例,提示DCs-HIS小鼠能较好的模拟人体的免疫应答情况。利用所构建的DCs-HIS小鼠评价靶向HER2蛋白疫苗(NitraTh-HER2)的免疫原性,结果显示,NitraTh-HER2疫苗能够诱导HER2特异性人IgG抗体的产生,并具有显著的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC),靶细胞SK-BR-3的裂解率达到47.1%;NitraTh-HER2疫苗能够产生抗原特异性的CTL效应,靶细胞SK-BR-3的裂解率达到14.6%。研究结果提示,DC-HIS小鼠模型为预测人类肿瘤疫苗的免疫原性提供了有效的方法。     

IL—12提高DNA疫苗诱导小鼠抗HBV皮下移植瘤的免疫研究

目的 观察ＩＬ－２真核表达载体（ｐＷＲＧ３１６９）对ＨＢＶ－ＳＤＮＡ疫苗（ｐＣＲ３．１－Ｓ）诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠（Ｈ－２＾ｄ）的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达ＨＢｓＡｇ的小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５细胞（Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ）成瘤性的影响。方法肌肉注射ＤＮＡ疫苗,背部皮下接种Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ细胞,观察成瘤情况,４ｈ＾５１Ｃｒ释放法检测小鼠脾细胞ＣＴＬ活性。结果 对照组、ｐＣＲ３．１－Ｓ及共同免疫     

联合应用白介素2和白介素6基因转染瘤苗抗肿瘤的实验研究

为了提高细胞因子基因转染瘤苗治疗肿瘤的效果，本实验观察了联合应用白细胞介素２（ＩＬ－２）基因转染瘤苗和白细胞介素６（ＩＬ－６）基因转染瘤苗治疗黑色素瘤实验性肺转移小鼠的效果，结果表明，联合治疗组荷瘤小鼠的肺转移结节数显著地少于单用瘤苗治疗组，其存活期也显著长于单一瘤苗治疗组，其脾脏细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）活性、天然杀伤细胞（ＮＫ）活性、淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ）活性以及ＩＬ－２和ＴＮＦ分泌水平均非常显著地高于单一瘤苗治疗组水平。实验结果说明，ＩＬ－２基因转染瘤苗与ＩＬ－６基因转染瘤苗联合应用后，能更有效地激活免疫功能达到更佳的抗肿瘤效果。     

乙型肝炎病毒核心抗原基因疫苗对小鼠的体液和细胞免疫原性观察

目的 观察不同品系小鼠（Ｈ－２＾ｂ,Ｈ－２＾ｄ）经乙型肝炎病毒核心抗原（ＨＢｃＡｇ）基因疫苗免疫后特异性辅助性Ｔ细胞反应类型和特异性细胞毒性Ｔ细胞活性。方法 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法鉴定该基因疫苗的体外表达产物;基因枪法和肌内注射法接种该基因疫苗;间接ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清抗－ＨＢｃ ＩｇＧ亚类（ＩｇＧ１,ＩｇＧ２ａ）水平;＾５１铬释放法测定小鼠脾细胞ＨＢｃＡｇ特异性细胞毒性Ｔ细胞活性。结果     

Enhancing Antitumor by Immunization with Fusion of Dendritic Cells and Engineered Tumor Cell

Antitumor immune responses are consideredto be primarily mediated by T cells.Based on theprevious data that genetically engineered tumorcells can be used to be against tumor as a source ofwhole- cell antigens,and as well as the secretion ofcytokines and,or costimulatory molecules,manyof the immunotherapeutic approaches developed totreat tumor in animal model or clinical trials[1— 3 ] .However,tumor cells are poor antigen- presentingcells (APCs) ,because of the lack of costimulatorymolecule e…     

OVA基因修饰的树突状细胞疫苗抗裸鼠肺肿瘤效应研究

目的 探讨OVA基因修饰的树突状细胞疫苗(DC-OVA)在肿瘤模拟抗原OVA(ovabumin)的裸鼠肺癌模型体内抗肺肿瘤的效应。方法 裸鼠右肺原位接种携带OVA的Lewis肺癌细胞(Lewis lung cancer cell-OVA, LLC-OVA)悬液,建立裸鼠肺癌模型。获取DC,经基因转导制备DC-OVA疫苗。Western 印迹法检测OVA蛋白的表达。获取T细胞,进而制备DC疫苗系统(DC-OVA/T)。CCK8试剂检测DC-OVA刺激后T细胞的增殖。模型建立2周后,尾静脉注射DC-OVA/T。Micro-CT扫描荷瘤裸鼠的胸部,观察肺部影像。H-E染色观察肺部及肿瘤组织形态结构。IHC方法观察脾、淋巴结、肿瘤组织中CD8的表达;观察肿瘤组织中SOX2、BMI1的表达。ELISA法检测血清中IL-12水平。结果 Western印迹法在样本中检测出清晰的OVA条带。DC-OVA强有效地刺激了T细胞的增殖(P<0.05)。DC-OVA/T治疗4周,疫苗组裸鼠肺micro-CT未见明显肿瘤阴影;取材,裸眼可见疫苗组病灶减小,H-E染色显示疫苗组的肿瘤组织较少,肺组织形态较完整。疫苗组裸鼠的脾、淋巴结、肿瘤组织内CD8阳性表达均明显高于对照组(P<0.05,P<0.05,P<0.01),肿瘤组织中的SOX2、BMI1阳性表达明显低于对照组(P<0.05,P<0.05);血清中的IL-12含量较对照组明显升高(P<0.001)。结论 基因修饰的DC疫苗在裸鼠体内具有强大的抗肺癌效应,为临床治疗肺癌提供了新的实验依据。     

GPI-CD80融合蛋白的抗肿瘤作用研究

目的 研究GPI-CD80融合蛋白对肿瘤生长的抑制作用及其机制.方法 将纯化的GPI-CD80蛋白与HepG2细胞共培养后用丝裂霉素灭活,制成肿瘤疫苗.设单纯丝裂霉素灭活的HepG2细胞为对照疫苗.将两组疫苗与裸鼠脾淋巴细胞共培养,MTT法检测淋巴细胞增殖及细胞因子IL-2、IFN-γ量的变化;乳酸脱氢酶法检测CTL的活性变化;将两组疫苗接种于荷瘤裸鼠,测量裸鼠肿瘤体积的变化.结果 脾淋巴细胞经肿瘤疫苗刺激后,OD值、IL-2、IFN-γ的量和CTL的活性均高于对照疫苗组,差异有统计学意义;实验组荷瘤裸鼠平均肿瘤体积小于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义.结论 GPI-CD80融合蛋白能够抑制荷瘤裸鼠瘤体的生长速度,其机制可能与诱导T淋巴细胞增生、刺激细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌、增强CTL活性等有关.     

小鼠对HBV DNA疫苗的免疫应答及细胞因子的免疫佐剂效应

目的 :观察编码小鼠 IL- 2及 IL- 12的真核表达载体 ,对 HBV DNA疫苗诱导 Balb/ c小鼠 (H- 2 d )免疫应答的调节作用及其对稳定表达 HBs Ag的小鼠肥大细胞瘤 P815细胞 (P 815 - HBV- S)成瘤性的影响。　方法 :肌内注射HBV DNA疫苗及细胞因子真核表达载体 ;背部皮下接种 P 815 - HBV - S细胞 ,观察成瘤情况 ;EL ISA法测定血清抗HBs;4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL 活性。　结果 :免疫 8周后 ,以 p CR3.1- S、p CR3.1- S+IL- 2及 p CR3.1-S+IL- 12免疫的小鼠血清 ,45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1、1.98± 0 .17及 1.6 7± 0 .15 ,均较 p CR3.1组显著提高(P<0 .0 5 )。CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %、(6 1.9± 7.1) %及 (73.3± 8.8) % ,后两组与 p CR3.1- S组比较差异均显著 (P<0 .0 5 )。脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 ,CTL细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) %、(5 6 .2± 7.5 ) %和 (75 .6± 9.1) % ,抗 CD8+ 单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) %、(13.6± 1.9) %和 (16 .9±2 .3) %。对照组成瘤率为 10 0 % ,p CR3.1- S组小鼠成瘤率为 12 .5 % ,p CR3.1- S+IL- 12真核表达载体组成瘤率为0 ,对照组平均存活期和 6周后存活率分别为 2 8.4天和 0天。后两组分别 >38.2天及 45