人FL细胞穿棱载体pS189诱变检测系统的建立及应用

作者用转染了穿梭载体ＰＳ１８９的亚克隆人羊膜ＦＬ细胞，对甲基硝基五硝基胍（ＭＮＮＧ）的诱变性进行了检测。结果发现，该系统中ＰＳ１８９靶基因ｓｕｐＦ的自发突变率×１０＾－５，ＭＮＮＧ剂量与其诱发突变率之间呈线性相关。用凝胶电泳、多聚酶链反应和单链构型多态对突变子分析表明，ＭＮＮＧ诱恨突变子中８９％为点突变，这些结果显示，该系统可望用于诱变剂的主诱变机理的分析研究。     

应用穿梭质粒建立哺乳动物细胞诱变检测系统的实验研究

Using Ficoll-Hypaque gradient centrifugation, we have successfully obtained the neutrophils from normal human donors, which can be used as particle antigens for immunizing BALB/c mice. Hybridomas were produced through the fusion of SP2/0 myeloma cells and splenocytes from immunized BALB/c mice. The ratio of fusion was 1:5. The cells were fused with 30% polyethylene glycol (MW 4000). The rate of fusion was 90%. The antibody producing colonies against the membrane of neutrophils in HAT medium were selected by indirect immunofluorescence assay. Antibody positive rate was 60% (102/170). Limiting dilution was used for colonization of the antibody-producing hybridoma cells. After colonization for three times, one hybridoma cell line was obtained, which could inhibit complement-mediated phagocytosis. Culture supernatant was used against class- and subclass- specific rabbit antisera (rabbit anti-mouse IgM, IgG, IgG1, IgGd22, IgG2b, IgG3) in an agar immunodiffusion system, it was shown to be IgG22.     

应用穿梭质粒建立哺乳动物细胞诱变检测系统的实验研究

用基于EB病毒的穿梭质粒载体pMCi5转染小鼠3T3细胞,建立一种能在DNA水平上检测化学物对哺乳动物细胞诱变作用及其机理的快速实验系统。该质粒带有诱变作用靶基因LacI,用甲基磺酸乙酯(EMS)作诱变剂进行的实验结果表明,该系统的自发突变率小于1.21×10~(-4),而EMS(300μg/ml)的诱发突变率为3.8×10~(-3)。7个突变子经EcoRI酶切证明,质粒上无大片段插入或缺失,6个EcoRI位点上没有点突变。     

用穿梭质粒pWB1研究黄曲霉素B1，苯并(α)芘 在人FL细胞中的诱变性

作者以β-萘黄酮诱导FL细胞表达细胞色素P450同工酶系，利用穿梭质粒pWB1研究了黄曲霉B     

用穿梭质粒pWB1研究黄曲霉素B1,苯并(α)芘在人FL细胞中的诱变性

作者以β－萘黄酮诱导ＦＬ细胞表达细胞色素Ｐ４５０同工酶系,利用穿梭质粒ｐＷＢ１研究了黄曲霉Ｂ１和苯并（α）芘在人新生儿羊膜上皮ＦＬ细胞中的诱变作用。结果：均以比自发突变频率（７．６１×１０－６）高两个数量级（１０－４）的频率,检出了黄曲霉Ｂ１和苯并（α）芘诱发的ＳｕｐＦ基因突变子,其中黄曲霉素Ｂ１表现了明显的剂量效应,从而为穿梭质粒ｐＷＢ１结合β－萘黄酮诱导ＦＬ细胞表达细胞色素Ｐ４５０同工酶系在ＦＬ细胞内检测间接致癌物的可行性提供了证据。     

EMS对穿梭质粒pZ189诱变作用的初步研究

Shuttle vector plasmid pZ189 was used as a molecular tool and the SupF inserted in the plasmid was worked as a target gene for mutagenesis study. The host cells (E. coli MBM 7070) with pZ189 were treated with ethylmethane sulfonate (EMS) and plated on the selective media containing X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactoside) and IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactoside). The SupF and the LacZ amber mutant carried by the host cells complemented each other and thus made the colonies blue on the selective media. However the colonies derived from the SupF mutants changed the colour from blue to white. The mutant frequencies in a series of experiments with different concentrations of EMS were estimated. Furthermore, the DNA isolated from 5 SupF mutants was digested with restruiction enzyme Hha I. It suggests that the 214 bp Hha I fragments containing mutant SupF could be distinguished from their wild type counterparts by temperature-gradient gel electrophoresis under optimal conditions.     

EMS对穿梭质粒pZ189诱变作用的初步研究

用甲基磺酸乙酯(EMS)处理穿梭质粒pZ189的转化菌,提取经处理的质粒再转化大肠杆菌MBM7070菌株。然后,在特定的选择性培养基上筛选出pZ189质粒上靶基因SupF发生了突变的转化子,计算了突变型频率。用DNA温度梯度凝胶电泳(TGGE)检出了含有SupF突变基因的DNA片段.     

人生长激素的酵母/哺乳动物穿梭载体的构建

目的酿酒酵母已被证实可作为载体应用于口服基因治疗及免疫中。为研究人生长激素(HGH)以酿酒酵母作为运送载体的口服基因药物,需要构建一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞表达的HGH穿梭载体。方法利用ECHO克隆系统先构建出HGH的哺乳动物表达载体,使HGH处于CMV启动子的调控下;然后设计引物扩增CMV-HGH片段,连接到酿酒酵母表达载体pESC-URA中,构建HGH的酵母/哺乳动物穿梭载体。结果经EcoRI单酶切、EcoRI/SpeI双酶切、菌落PCR以及序列测定鉴定,确认所构建的确为酵母/哺乳动物穿梭载体pESC-CMV-HGH。结论成功构建的穿梭载体可在酿酒酵母中复制,在哺乳动物中受CMV启动子的调控进行表达,为HGH的口服基因药物研制打下了基础。     

低浓度MNNG诱发FL细胞应答反应的蛋白质组学研究

目的：研究低浓度甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对人羊膜FL细胞蛋白质表达谱的影响，以助于阐明环境致癌物引起细胞早期应答反应的分子机制。方法：FL细胞分别用MNNG和DMSO(溶剂对照)处理后，提取细胞总蛋白，用双向凝胶电泳分离蛋白质组成分，银染染色后用相应的分析软件分析数字化的凝胶图像，找出在MNNG处理后表达有差异的蛋白斑点，用基质辅助的激光解吸-飞行时间质谱(MALDI-TOF)鉴定。结果：在MNNG处理后有60多个蛋白斑点出现质和量的变化，其中18个蛋白斑点只能在MNNG处理的细胞中检测到，13个蛋白斑点则在MNNG处理后消失；同时检测到30个蛋白斑点在表达量上有显著变化，其中16个点表达升高，14个点则表达降低。通过数据库的检索，初步的鉴定了一批结构和功能各异的蛋白。结论：在低浓度烷化剂攻击后，FL细胞中的蛋白表达谱发生了显著的变化。     

甲基硝基亚硝基胍诱导人胃粘膜上皮细胞恶性转化的观察

对甲基硝基亚硝基胍（ＭＮＮＧ）在诱发体外培养的人胃粘膜上皮细胞恶性转化中的作用进行了观察，结果发现，ＭＮＮＧ处理组各时相胃粘膜上皮细胞的增殖速率，非程序ＤＮＡ合成水平，脂质过氧化物和ｒａｓｐ２１蛋白含量均显著高于对照组（Ｐ＜０．０５～０．０１）。结果提示，ＭＮＮＧ可诱发胃粘膜上皮细胞恶性转化，其作用机理可能是通过损伤细胞ＤＮＡ，诱发脂质过氧化或导致ｒａｓｐ２１异常表达所致。     

表达人CD4分子的逆转录病毒基因转移体系的建立

目的构建表达人CD4（hCD4）分子pLXIN—hCD4载体的基因转移体系，使hCD4分子在小鼠T淋巴细胞白血病细胞系L615中长久、稳定地表达。方法将目的基因hCD4亚克隆到真核细胞表达载体pLXIN上，构建重组质粒pLXIN—hCD4。将该质粒用PloyFect脂质体转染到PT67包装细胞，获得病毒颗粒；用病毒颗粒感染体外培养的小鼠T淋巴细胞白血病细胞系L615。收集筛选后的细胞（L615-hCD4），以抗CD4单抗标记后用流式细胞术（FCM）检测其细胞膜hCD4分子的表达情况。PI-FCM法检测L615细胞和L615-hCD4细胞的细胞周期。结果菌落PCR鉴定及酶切鉴定显示hCD4基因成功地插入pLXIN载体中；hCD4分子可在L615-hCD4细胞膜表面稳定表达，而野生型L615细胞膜表面无hCD4分子表达。L615-hCD4与野生型L615的细胞周期比较无差异。结论成功构建了能在真核细胞上表达hCD4分子的重组质粒pLXIN—hCD4。L615-hCD4细胞能长期稳定表达hCD4分子，其细胞周期无改变。     

人羊膜诱导胚胎干细胞向表皮样干细胞的定向分化

[目的]探索体外定向诱导胚胎干细胞(ES细胞)分化为表皮样干细胞的条件,为研究其分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础.[方法]将小鼠胚胎干细胞单独(对照组)或与人羊膜共培养4～5 d,观察其形态分化,分别用β1整合素免疫组化和流式细胞仪检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化.[结果]与人羊膜共培养4～5 d后,ES细胞分化为表皮细胞样的单层细胞,细胞排列紧密,呈多边形,免疫组织化学染色后,多数细胞呈现β1整合素阳性,对照组大量细胞死亡,未见β1整合素阳性细胞;流式细胞仪检测结果显示实验组和对照组β1整合素阳性细胞分别为81.4%和8.4%,两者比较差异显著,Z检验P<0.01.[结论]人羊膜组织可在体外诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞.     

由人淋巴结建立的—株人淋巴母细胞样细胞系

本文报告由人淋巴结建立一株人淋巴母细胞样细胞系,命名为“昆明总医院淋巴细胞株KGHLY(Kunming General Hospital Lymphoblastoid Cell line KGHLY)。KGHLY细胞悬浮生长,易形成团块,生长旺盛,第30代细胞倍增时间为26h,光镜和电镜下培养细胞的形态和结构与淋巴母细胞样细胞的相似。细胞分泌IgM,表面标志研究显示,无绵羊红细胞受体,这些提示细胞来自B淋巴细胞。核型是非整倍体,染色体众数为44—46条,在体外已维持一年,传代70代,细胞保存液氮复苏良好,此细胞系的建立将是淋巴母细胞样细胞和人一人杂交瘤有用的研究材料。     

人hepcidin真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的 构建人hepcidin全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达hepcidin的HepG2细胞系,以应用于拮抗hepcidin从而增强铁吸收的活性药物筛选.方法 化学合成结合PCR拼接hepcidin 全长结构基因,插入原核表达载体pMD18-T中,测序正确后再经HindⅢ与EcoRⅠ双酶切,定向插入真核表达载体pcDNA3.0内,酶切鉴定后,采用脂质体转染法将重组质粒转染人HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,ELISA检测转染细胞hepcidin的蛋白表达.结果 经酶切鉴定,成功构建hepcidin真核表达载体pcDNA3-hepcidin;重组质粒转染HepG2,经G418筛选3周获得抗性细胞克隆,其hepcidin蛋白表达量为普通HepG2细胞表达量的3倍.结论 成功构建了稳定高表达hepcidin的HepG2细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究hepcidin降低肠道铁吸收的分子机制以及筛选拮抗hepcidin作用的活性药物奠定了实验基础.     

人成骨肉瘤顺铂耐药细胞系的建立

目的建立顺铂诱导的人成骨肉瘤多药耐药细胞系(MG63/R)并观察其生物学特性。方法以顺铂为诱导剂,采用大剂量冲击与逐步增加剂量相结合的方法诱导人成骨肉瘤MG63细胞,建立多药耐药系MG63/R。MTT法检测药物敏感性;光镜、透射电镜观察MG63、MG63/R细胞形态及超微结构变化;生长曲线、克隆形成试验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数、P-pg、bcl-2、P53蛋白表达。结果经顺铂186d的诱导,建立了MG63/R,其对顺铂的耐药指数为83.557±4.841,对阿霉素、长春新碱、氨甲基蝶呤、环磷酰氨亦产生不同程度的交叉耐药;光镜观察可见MG63/R细胞排列不规则,形态呈三角形、多角形及多核现象;透射电镜显示MG63/R细胞表面突起增加,粗面内质网丰富;细胞周期分析显示细胞增殖能力明显增加而细胞凋亡明显降低;MG63/R细胞P-pg、bcl-2阳性表达较MG63细胞明显增加,P53表达则明显降低。结论本研究建立了稳定的人成骨肉瘤多药耐药细胞系MG63/R,为进一步研究顺铂的多药耐药机制和耐药治疗提供了一种新的实验模型。     

人PD-L1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的稳定转染

目的构建含有人PD-L1基因的真核表达载体,并通过稳定转染获得稳定表达PD-L1分子的HEK293细胞系。方法从人心脏cDNA文库中扩增出PD-L1基因,通过双酶切（Xho1和EcoR1）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定高表达PD-L1分子的HEK293细胞系,通过流式细胞术、RT-PCR及Westernblot分析PD-L1的表达。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/PD-L1,建立了稳定转染PD-L1目的基因的HEK293细胞系。结论成功构建了PD-L1真核表达载体并获得了稳定转染该分子的HEK293细胞系。     

人TLT-2真核表达载体的构建及其在L929细胞株中的稳定转染

目的构建含有人TLT-2基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达TLT-2分子的L929转基因细胞株。方法运用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从健康人外周血单个核细胞（PBMC）的cDNA文库获得全长TLT-2基因,经过双酶切（XhoI和EcoRI）装入逆转录病毒表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染L929细胞,经G418抗性筛选,流式细胞术、RT-PCR及Western blot鉴定TLT-2分子的表达。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/hTLT-2,建立了稳定转染TLT-2目的基因的L929细胞株。结论成功构建了TLT-2真核表达载体并获得了稳定转染该分子的转基因细胞,为进一步研究人TLT-2分子的生物学功能提供了物质基础。