人AURKA基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:针对AURKA基因构建RNA干扰重组慢病毒质粒并进行慢病毒包装,初步探讨AURKA基因的功能。方法:应用pGCLV-GFP慢病毒载体构建针对AURKA的shRNA载体,转染包装293T细胞,收集病毒上清液,转染肺腺癌细胞株A549。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况确定转染效率,应用Western blot技术检测AURKA基因在蛋白水平表达的变化,以明确RNAi的抑制率。应用BrdU法分析干扰AURKA前后A549细胞增殖情况的变化,运用克隆形成实验检测干扰AURKA后A549细胞株对长春新碱敏感性的变化。结果:针对AURKA基因的RNAi慢病毒表达载体构建成功,PCR和DNA测序鉴定实验表明插入位点与干扰片断的碱基序列完全正确。在293T细胞中进行慢病毒包装,获得高滴度病毒上清液。通过重组慢病毒载体将AURKA shRNA转导入A549细胞中,转染效率为100%。Western blot检测证实LV-AURKA慢病毒显著抑制AURKA的表达,BrdU检测显示AURKA基因表达下调抑制了A549细胞的增殖。克隆形成实验表明AURKA基因表达增强A549细胞对长春新碱的敏感性。结论:慢病毒载体介导的靶向AURKA的RNA干扰可有效抑制AURKA表达,降低肺腺癌A549细胞的增殖能力,并且增强A549细胞对长春新碱的敏感性。     

BAD慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的探讨促凋亡基因BAD(Bcl-2-associated death protein)重组慢病毒表达载体构建及其对肺癌A549细胞株增殖的影响。方法应用PCR法从含有目的基因的质粒pAV-MCMV-BAD-GFP中扩增BAD基因片段,克隆至慢病毒载体(pLVX-IRES-ZsGreen 1),应用PCR、酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染A549细胞,经流式细胞仪筛选稳定表达细胞株,Western blot鉴定重组慢病毒感染的A549细胞BAD的表达。采用CCK-8试剂盒定点检测细胞的光密度(OD)值,分析BAD蛋白过表达对A549细胞增殖能力的影响。结果酶切鉴定和基因测序证实长度为507bp的BAD基因成功克隆至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1;重组慢病毒通过感染A549细胞株和流式细胞仪筛选出单克隆细胞株BAD-A549,Western blot检测结果显示,细胞培养BADA549细胞可稳定过表达BAD蛋白。体外增殖结果显示,细胞培养120~144h,BAD组的OD值均较对照组低(P<0.05)。结论成功构建了BAD重组慢病毒载体,获得稳定表达BAD的A549细胞株。BAD过表达能有效抑制A549细胞的增殖速度。     

以Has-miR-100-3 p抑制剂慢病毒表达载体建立稳定感染A549细胞株

目的 用Has-miR-100-3p抑制剂的慢病毒来建立稳定感染人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞株,为进一步研究miR-100在NSCLC细胞中的机制奠定基础.方法 用has-miR-100-3p抑制剂的重组慢病毒液,以其最适浓度感染A549细胞,获得稳定感染慢病毒的A549细胞株.荧光显微镜观察细胞感染效率,实时定量聚合酶链锁反应(qRT-PCR)和流式细胞术(FCM)分别检测稳定感染慢病毒的A549细胞株中miR-100的表达量和细胞株中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况.结果 荧光显微镜下可见绿色荧光在细胞中表达.qRT-PCR检测结果显示,感染抑制剂的A549细胞中miR-100的表达量显著减少;流式细胞术检测感染组细胞中均有GFP的表达.结论 获得了has-miR-100-3p抑制剂的慢病毒稳定感染的A549细胞株,该细胞株中内源性miR-100的表达下调.     

尿刊酸修饰的壳聚糖介导野生型p53基因转染对人肺腺癌细胞系H1299增殖和凋亡的影响

目的： 研究尿刊酸修饰的壳聚糖(UAC)介导野生型p53(wt-p53)基因转染对人肺腺癌细胞系H1299(p53基因缺失)的增殖抑制和凋亡诱导作用。方法： UAC介导wt-p53基因转染H1299细胞后,采用荧光显微术、RT-PCR法和Western blot法分别检测细胞内绿色荧光蛋白(GFP)、wt-p53 mRNA和蛋白的表达,并通过MTT法分析基因转染对细胞的生长抑制作用,DAPI染色法和琼脂糖凝胶电泳法评价其对细胞的诱导凋亡作用。结果： UAC介导wt-p53基因转染H1299细胞后,大量细胞表达GFP,细胞内wt-p53 mRNA和蛋白表达水平明显上调,细胞生长受到显著地抑制,凋亡细胞数量明显增加,并有清晰的DNA梯状条带出现。结论： UAC介导wt-p53基因转染能够显著地抑制人肺腺癌细胞系H1299的增殖,并诱导其凋亡。     

SOCS3基因对肺腺癌细胞株A549中c-Myc表达的影响

目的探讨SOCS3基因对人肺腺癌细胞株A549中c-Myc表达的调控作用。方法以脂质体为载体将pEFSOCS3和pSV2neo共转染至人肺腺癌细胞株A549,RT-PCR和免疫细胞化学法测定转染前后细胞中SOCS3mRNA和蛋白表达;Westernblot检测STAT3蛋白酪氨酸磷酸化水平变化;sqRT-PCR测定转染前后细胞中c-MycmRNA的表达。MTT法检测转染前后细胞增殖变化。结果RT-PCR和免疫细胞化学证实转染后细胞中SOCS3稳定表达;Westernblot证实pEFSOCS3转染组细胞STAT3蛋白酪氨酸磷酸化水平明显降低(P <0.01);sqRT-PCR显示pEFSOCS3转染组细胞中c-MycmRNA的表达显著降低。MTT法结果示pEFSOCS3转染组细胞增殖明显受到抑制。结论SOCS3蛋白可能通过抑制A549细胞中STAT3蛋白的酪氨酸磷酸化从而下调c-Myc基因的表达,最终抑制A549增殖。     

前列腺组织特异性表达载体pPSA-EGFP的构建

目的：构建前列腺组织特异性表达载体。方法：利用基因重组技术将PSA基因上游5．8kb的调控序列克隆至真核表达载体pEGFP-1，构建前列腺组织特异性表达载体pPSA-EGFP；用脂质体Lipo-fectamine将载体pPSA-EGFP分别转染前列腺癌细胞株PC．3m、乳腺腺癌细胞株MCF-7、结肠腺癌细胞株HT-29、肝癌细胞株HepG2、宫颈癌细胞株HeLa和肺腺癌细胞株A549多种细胞，转染后48h荧光显微镜下观察GFP的表达情况，pPSA-EGFP和phAR共转染PC-3m细胞。结果：在pPSA-EGFP和phAR共转染的PC-3m细胞中绿色荧光蛋白表达明显，MCF-7细胞中绿色荧光蛋白表达微弱，其他细胞中荧光蛋白不表达。结论：构建的前列腺表达载体pPSA-EGFP具有组织特异性。     

姜黄素抑制肺癌细胞A549上皮间质转化的机制研究

目的 探讨姜黄素对肺癌细胞A549上皮间质转化的影响。方法 姜黄素诱导肺癌细胞A549 24 h,CCK-8法检测A549细胞活性,Transwell实验检测A549细胞迁移、侵袭的能力,Western blotting检测上皮间质转化标志蛋白的相对表达量,实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测HOTAIR、E-cadherin、N-cadherin及Snail mRNA的相对表达量,测序方法检测姜黄素诱导后lncRNA表达的变化,实验验证介导姜黄素发挥作用的具体非编码RNA,分析HOTAIR与临床病理参数之间的关系。结果 CCK-8法检测结果显示,姜黄素诱导肺癌细胞A549 24 h后,不同浓度组肺癌细胞A549的OD值比较,差异有统计学意义（P <0.05）,随着姜黄素浓度的升高,OD值降低。Transwell结果显示,姜黄素诱导肺癌细胞A549 24 h后,姜黄素诱导组抑制肺癌细胞A549的侵袭、迁移,与对照组比较,差异有统计学意义（P <0.05）。Western blotting和qRT-PCR检测结果显示,姜黄素诱导组的间质表型基因和蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Snail）与对照组比较,差异有统计学意义（P <0.05）,N-cadherin、Snail相对表达量下降,E-cadherin相对表达量升高。癌旁正常组和肺癌组中HOTAIR的相对表达量比较,差异有统计学意义（P <0.05）,肺癌组高于癌旁正常组。测序检测和qRT-PCR结果显示,姜黄素抑制HOTAIR的表达。分析HOTAIR在肺癌组织中的表达及其与临床病理参数之间的关系显示,HOTAIR的表达与TNM分期、分化程度、淋巴结转移密切相关。对照组、姜黄素诱导组、姜黄素诱导+HOTAIR过表达组A549细胞OD值比较,差异有统计学意义（P <0.05）。结论 姜黄素有效抑制肺癌细胞A549的增殖、侵袭及迁移,姜黄素抑制lncRNA HOTAIR表达,姜黄素抑制肺癌细胞A549上皮间质转化是通过HOTAIR实现的。     

人细胞色素P4502A13与GFP融合基因共表达慢病毒载体的构建与表达

目的:构建人细胞色素P450 2A13(CYP2A13)基因与绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)共表达的慢病毒载体,并转染肺腺癌A549细胞使之持续高表达CYP2A13基因.方法:采用基因重组技术,将CYP2A13基因与GFP连接,构建慢病毒载体.转染293T细胞,包装后产生病毒...     

RNA干扰技术抑制肺癌细胞外源性绿色荧光蛋白的表达

目的：构建针对绿色荧光蛋白（GFP）基因的发夹结构RNA（small hairpin RNA,shRNA）表达载体（pshRNA-GFP）,观察对肺癌A549细胞的GFP特异性抑制作用。方法：设计针对GFP基因的shRNA序列,构建pshRNA-GFP质粒。与报告基因质粒PEGFP-N1共转染A549细胞,分别用激光共聚焦扫描显微镜（Laser confocal seanning mieroscope,LCSM）和流式细胞术检测干扰效果。结果：瞬时共转染pshRNA-GFP质粒和PEGFP-N1质粒后,荧光显微镜观察结果显示A549细胞中发出荧光的细胞数量减少,荧光强度明显降低。流式细胞术检测阳性细胞百分率降低至32.4％,差异有显著性。结论：靶向GFP的shRNA表达质粒能有效而特异抑制GFP在A549中的表达,A549细胞中存在RNA干扰现象。     

PKM2基因沉默对人肺癌细胞生物学特性的影响

目的 探讨M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2,PKM2）下调对人肺癌A549细胞生物学特性的影响。方法 采用免疫荧光技术检测A549细胞中PKM2蛋白的表达;将构建有PKM2-shRNA的重组质粒转入A549细胞;分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测PKM2 mRNA和蛋白表达水平;CCK-8法检测PKM2基因沉默对A549细胞增殖能力的影响;采用葡萄糖测定试剂盒测定细胞对葡萄糖的消耗量;Transwell实验检测细胞穿过人工基膜的能力。结果 肺癌A549细胞的细胞质及细胞核中均有PKM2表达;PKM2-shRNA质粒转染A549细胞48h后,可明显下调A549细胞中PKM2 mRNA及蛋白的表达水平,并且明显抑制A549细胞增殖;PKM2 shRNA可减少A549细胞葡萄糖的消耗,还可抑制细胞侵袭能力。结论 在肺癌细胞A549中,抑制PKM2表达可显著抑制细胞增殖、侵袭和糖代谢能力。     

新生儿高胆红素血症时血IL—6的观察研究

目的了解新生儿高胆红素血症时血白细胞介素－６（ＩＬ－６）的改变。方法应用ＥＬＩＳＡ法测定２０例新生儿高胆红素血症患儿与同期１１例对照组正常足月新生儿血ＩＬ－６含量。结果新生儿高胆红素血症组血ＩＬ－６浓度增高,其均值±标准差（ｘ±ｓ）为（４３２．２３±２５６．８４）ｎｇ／Ｌ,对照组为（２８．８２±９．６６）ｎｇ／Ｌ,Ｐ＜０．００１。结论新生儿高胆红素血症时细胞因子白细胞介素－６增高,白细胞介素－６可能在新生儿高胆红素血症的发病中起一定的作用。     

吉兰-巴雷综合征脑脊液中白细胞介素-6的测定

目的探讨白细胞介素-6(IL-6)在吉兰-巴雷综合征(Guillian-Barre Syndrome,GBS)发病及诊断中的作用.方法采用ELISA法测定GBS患者急性期和恢复期脑脊液中IL-6水平,并与正常人脑脊液对照.结果36例成人GBS患者脑脊液IL-6水平为(36.88±9.26)×1012kU/L;26例正常对照组为(14.97±8.68)×1012kU/L;成人GBS组脑脊液IL-6水平明显高于正常对照组,P＜0.01.18例成人GBS患者脑脊液IL-6治疗前水平为(33.57±5.0)×1012kU/L,治疗后水平为(13.55±8.03)×1012kU/L,较治疗前明显下降(P＜0.01).但病情轻重各级之间脑脊液IL-6水平无显著性差异.结论IL-6参与GBS的病理过程,但与病情轻重无明显关系.     

IL-6及CRP在早期诊断新生儿败血症中的临床研究

目的探索新生儿败血症的早期诊断手段,评价白细胞介素6(IL-6)和C反应蛋白(CRP)在新生儿败血症早期诊中的临床价值。方法按败血症的诊断标准,23例新生儿败血症(确诊新生儿败血症病例9例,临床诊断新生儿败血症14例)作为研究组,35例无感染病例作为对照组;比较两者IL-6、CRP的差异。结果研究组的血清IL-6、CRP浓度分别为(68.5±24.1)ng/L、(23.2±7.8)mg/L,对照组的血清IL-6和CRP浓度分别为(35.8±11.4)ng/L、(8.6±3.1)mg/L,统计比较均有显著性差异;以对照组95%可信区间上限为切割值,IL-6和CRP的敏感性分别为87%、60.8%,特异性分别为82.9%、88.6%。结论IL-6、CRP可作为早期诊断新生儿败血症的指标,对制定治疗方案,改善预后具有重要的参考意义。     

肺炎支原体肺炎患儿血清IL-6、IL-18和hs-CRP水平检测和意义

目的探讨肺炎支原体肺炎(MPP)患儿血清白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素18(IL-18)和超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平变化,并探讨在MPP发生、发展中的作用。方法选择MPP患儿60例,检测其急性期和恢复期血清IL-6、IL-10和h-CRP水平,并与正常对照组进行比较。结果 MPP急性期患儿血清IL-6、IL-10和h-CRP水平明显增高,MPP恢复期显著降低(P<0.01);MPP急性期血清IL-6、IL-18水平与hs-CRP正相关(P<0.05);血清IL-6与IL-18与水平呈正相关P<0.05)。结论 IL-6、IL-18和h-CRP等炎性介质参与了MP的发生、发展;联合检测血清IL-6、IL-18和hs-CRP水平有助于MP病情严重程度的判定。     

急性心肌梗死患者IL-6和IL-10水平测定及其临床意义

目的：分析急性、陈旧性心肌梗死和急性心肌梗死溶栓前后炎症因子白细胞介素—6(IL-6)和抗炎因子白细胞介素—10(IL-10)含量的变化并探讨其临床意义。方法：用ELISA分析试剂盒检测24例急性心肌梗死和20例陈旧性心肌梗死患血浆IL-6和IL-10含量。10例急性心肌梗死患行溶栓治疗，分别检测治疗前后IL-6和IL-10的含量。结果：急性和陈旧性心肌梗死组血浆IL-6和IL-10含量均显高于健康对照组。急性心肌梗死组IL-6和IL-10含量较陈旧性心肌梗死组显增高。急性心肌梗死患溶栓后血浆IL-10的含量明显降低，IL-6的含量有所增高。急性心肌梗死组IL-10的含量与肌酸激酶(CK)和肌酸激酶—同功酶(CK—MB)均呈不同程度的显正相关。IL-6的含量与CK和CK—MB无显相关。结论：急性心肌梗死患血浆IL-6和IL-10均显增高，它们在缺血损伤和再灌注过程中可能存在相互调节的关系。     

新型氨基糖苷类修饰酶基因aac(6')-Ib-cr的研究进展

随着喹诺酮类药物在临床的广泛应用，喹诺酮类的耐药问题也受到了广泛的关注，细菌对喹诺酮类药物的耐药机制在20世纪90年代以前认为均是由染色体介导，如靶位改变、流出泵等。1998年，Martinez等最先报道临床分离菌株肺炎克雷伯菌中携带的质粒pM6252能介导细菌对喹诺酮类耐药，使人们对喹诺酮类耐药机制有了新的认识。     

KLF6mRNA Expression in Primary Hepatocellular Carcinoma

Hepatocellularcarcinoma(HCC)isoneofthethreeleadingcausesofcancerdeathsworldwide.Itsprogressionisbelievedtoresultfromtheaccumulationofgeneticalterationsatnumerouslocicontrollinggrowthandproliferation.Asamodelforbothmultistepandmultipathwaycarcinogenesis,he…     

川崎病心肌和冠状动脉损伤与血清TNF-α和IL-6水平的研究

目的 探讨川崎病(KD)患儿血清TNF-α、IL-6变化与心肌酶、肌钙蛋白-I(cTn-I)、冠状动脉损伤(CALs)及心功能间的关系.方法 对23例KD患儿、11例急性上呼吸道感染患儿和10例健康儿童进行血清TNF-α、IL-6、心肌酶及cTn-I检测,超声心动图检查冠状动脉及心功能情况,分析其差异.结果 ①KD组急...     

注意缺损多动障碍中五羟色胺6受体基因与多巴胺转运体基因之间的相互影响

目的 :探讨注意缺损多动障碍 (ADHD)患者中五羟色胺 6受体 (5 HTR6 )基因与多巴胺转运体 (DAT1)基因之间的相互影响。方法 :采用聚合酶链式反应 限制性片段长度多态 (PCR RFLP)和扩增片段长度多态 (Amp FLP)的分子遗传学技术方法 ,对 74个ADHD核心家系进行单体型关联分析。 结果 :①核心家系组成的患儿组和对照组在 5 HTR6基因等位基因、基因型的分布上差异无显著性。经基于单体型和基于基因型的单体型相对风险分析 ,5 HTR6基因与ADHD均无关联。②上海地区汉族人中 ,DAT1基因多态以等位基因 4 80bp片段 (核心序列为 4 0bp的可变数目串联重复序列的 10次重复 )为主 ,其基因频率为 (92 % )。③有关 5 HTR6基因的 2 6 7C/T变异和DAT1重复序列多态性在患儿组和对照组中的分布 ,经 χ2 检验表明各组之间差异均无显著性。结论 :上海地区汉族人群中 5 HTR6基因多态性与注意缺损多动障碍无遗传关联。也未能发现注意缺损多动障碍中 5 HTR6基因和DAT1基因之间的相互作用     

AXL激酶与肿瘤（英文）

Axl是受体酪氨酸激酶家族（RTKs）成员之一,它与配体生长阻滞特异基因6（Gas6）结合后可以介导细胞外基质到胞质内的信号转导,在细胞生长、增殖和迁移中是一个关键的调节者。最近研究表明,Axl还在肿瘤形成、侵袭和转移方面也有重要的作用。Axl激酶的异常表达和激活将为一些肿瘤细胞的生长提供有利条件。Axl激酶抑制剂将增强肿瘤细胞对细胞毒化合物的敏感性,成为肿瘤治疗中潜在的靶点。本文拟将Axl激酶在肿瘤细胞中的信号转导途径及作为抗肿瘤药物的作用靶点等方面进行综述。＊