抑制泛素羧基末端水解酶L1对小鼠脑缺血/再灌注损伤的影响

目的 评估抑制泛素羧基末端水解酶L1(UCHL1)对小鼠脑缺血/再灌注损伤的影响.方法 将雄性BALB/c小鼠随机分为假手术(sham)组、缺血/再灌注(I/R)组、UCHL1小干扰RNA(siRNA)组和scramble siRNA(control)组,每组10只小鼠.采用小鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)60 min后...     

小鼠脑缺血时自噬相关基因5的抗损伤作用

 目的: 观察自噬相关基因5(Atg5)在小鼠脑缺血再灌注损伤中的抗损伤作用。方法: 将雄性BALB/c小鼠随机分为假手术(sham)组、缺血再灌注(I/R)组、Atg5 siRNA组和control siRNA组。I/R组采用大脑中动脉阻塞(MCAO)60 min后再灌注24 h。Atg5 siRNA组和control siRNA组将5 μL Atg5 siRNA或scrambled siRNA在MCAO前24 h侧脑室注射。实时荧光定量PCR和Western blot检测Atg5的表达;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测抑制Atg5对缺血再灌注损伤后脑梗死面积和水肿率的影响;神经行为学评分法检测抑制Atg5对缺血再灌注损伤后神经症状的影响。结果: MCAO后再灌24 h,缺血半影区Atg5 mRNA和蛋白水平显著增高(P<0.05);Atg5 siRNA明显降低缺血再灌后Atg5 mRNA和蛋白的表达(P<0.05);侧脑室给予Atg5 siRNA能显著增加脑梗死面积和水肿率,并加重神经行为学损伤(P<0.05)。结论: 沉默Atg5加重小鼠脑缺血再灌损伤,提示MCAO后诱导的 Atg5 可减轻小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。     

右美托咪啶上调sirtuin3减轻小鼠肾缺血-再灌注损伤

目的研究右美托咪啶(DEX)在肾缺血-再灌注(I/R)损伤小鼠中的保护作用及其机制。方法将小鼠分为假手术(sham)组、siRNA+sham组、肾I/R组(常规法)、DEX+I/R组(腹腔注射25μg/kg DEX)、siRNA+I/R组及siRNA+DEX+I/R组;siRNA+sham组、siRNA+I/R组、siRNA+DEX+I/R组术前3 d经尾静脉注射5×10^9TU/kg慢病毒-去乙酰化酶3(SIRT3) siRNA。生化分析仪测定肾功能;HE染色法观察肾组织形态学;Tunel染色法检测肾组织凋亡;Western blot检测SIRT3、亲环素D(Cyp D)和细胞色素C(Cyt C)表达。结果 DEX可降低小鼠肾I/R后肾脏损伤,上调SIRT3表达并下调Cyt C及乙酰化Cyp D蛋白表达水平(P<0. 05)。抑制SIRT3后可减轻DEX对肾脏的保护作用(P<0. 05)。结论 DEX减轻肾I/R损伤的作用可能与上调SIRT3相关。     

排斥性导向分子a抑制剂6FNⅢ对大鼠大脑皮质神经元缺血再灌注后自噬的作用

目的 探讨排斥性导向分子a(RGMa)特异性抑制剂6FNⅢ对大鼠大脑皮质神经元缺血再灌注引发的自噬及对神经功能恢复的影响。 方法 雄性成年SD大鼠立体定位侧脑室注射不同浓度6FNⅢ后建立大脑中动脉闭塞（MCAO）/再灌注模型,Western blotting检测RGMa下游分子脑衰反应调节蛋白-2（CRMP-2）蛋白表达水平,确定最佳6FNⅢ干预浓度。将72只雄性成年SD大鼠随机分成4组：假手术组（sham）、脑缺血再灌注组（I/R）、生理盐水干预组（I/R+NS）、6FNⅢ干预组（I/R+6FNⅢ）,每组18只。缺血2h再灌注后24h,采用神经功能缺损评分评估各组大鼠神经功能恢复情况;Western blotting检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ水平;免疫荧光双标检测LC3在神经元内的表达情况;透射电子显微镜观察自噬体的形成情况。 结果 根据各浓度6FNⅢ干预组CRMP-2表达,确定中浓度（0.5 g/L）为本实验的最适浓度。缺血再灌注后24h,I/R组较sham组神经功能评分降低(P＜0.05)、自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ水平升高(P＜0.05)、自噬体形成增多;I/R+6FNⅢ组较I/R组神经功能评分增高(P＜0.05)、自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ水平降低(P＜0.05)、自噬体形成减少;而I/R+NS组与I/R组以上各项均无统计学意义(P＞0.05)。 结论 RGMa特异性抑制剂6FNⅡ可在缺血再灌注急性期抑制自噬发生,促进神经功能恢复。     

Cx43沉默对机械应力作用下调控的软骨细胞自噬介导软骨基质合成的影响

目的:探究机械应力作用下通过沉默缝隙连接蛋白43(Cx43)调控软骨细胞自噬对软骨细胞的基质代谢的影响。方法:对小鼠成软骨细胞系ATDC5加载机械应力,采用q PCR和Western blot法检测ATDC5细胞中Cx43的mRNA和蛋白表达。将细胞分为空白对照组、机械应力组、Cx43 siRNA转染组、scramble siRNA转染组、机械应力+scramble siRNA转染组、机械应力+Cx43 siRNA转染组和机械应力+Cx43 siRNA转染+3-MA组,CCK-8法检测细胞活力,q PCR检测软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达,1,9-二甲基亚甲蓝(DMMB)染色法检测细胞糖胺多糖(GAG)含量,Western blot法检测自噬相关蛋白beclin 1和LC3的表达。结果:机械应力刺激下,ATDC5细胞Cx43表达上调,细胞活性显著降低,II型胶原mRNA表达降低,GAG含量减少,beclin 1和LC3-II/LC3-I蛋白表达降低(P 0. 05)。转染Cx43 siRNA可下调Cx43的mRNA和蛋白的表达。机械应力作用下,Cx43沉默显著增强软骨细胞活力,提高II型胶原的mRNA表达和GAG含量,上调beclin 1和LC3-II/LC3-I的蛋白表达(P 0. 05)。此外,自噬抑制剂3-MA处理后,Cx43沉默对机械应力下软骨细胞的保护作用受到抑制。结论:Cx43沉默通过促进机械应力作用下小鼠软骨细胞自噬,从而促进软骨细胞的合成代谢,减轻软骨细胞在机械应力下的损伤。     

醉茄素A通过调节自噬缓解心肌细胞缺血/再灌注（缺氧/复氧）损伤

目的:探讨醉茄素A(WFA)通过对自噬的调节在心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤中的作用,为寻找有效药物缓解MI/R治疗后引起的心肌损伤提供依据。方法:(1)离体培养大鼠心肌H9C2细胞通过缺氧/复氧处理模拟在体缺血/再灌注(SI/R)模型,Western blot法分别检测对照组、SI/R组、WFA治疗(WFA+SI/R)组和氯喹(CQ)预处理(CQ+WFA+SI/R)组自噬相关蛋白的变化,CCK-8法检测细胞活力,Western blot检测cleaved caspase-3蛋白水平,试剂盒检测caspase-3活性。C57BL/6小鼠吸入麻醉下,施心脏冠状动脉左前降支结扎术,30 min后打开结扎线恢复血液灌注3或12 h。(2)将小鼠随机分成假手术(sham)组、MI/R组、WFA+MI/R组和CQ+WFA+MI/R组。将再灌注3 h的小鼠分离心脏组织用于TUNEL染色,再灌注12 h的小鼠用于超声成像以检测左心室功能。结果:(1)与SI/R组相比,WFA+SI/R组LC3-II/LC3-I、beclin-1和p62水平显著降低,溶酶体相关膜蛋白2(Lamp-2)表达水平显著升高。与WFA+SI/R组相比,CQ+WFA+SI/R组LC3-II/LC3-I、beclin-1、p62、Lamp-2和cleaved caspase-3水平显著升高,心肌细胞活力显著降低,caspase-3活性显著升高。(2)在体研究显示,与WFA+MI/R组相比,CQ+WFA+MI/R组小鼠左心室功能显著降低,心肌细胞凋亡率显著升高。结论:醉茄素A通过降低过高的自噬水平,维持自噬平衡,从而改善缺血/再灌注损伤后的心功能。     

磷酸肌酸减少大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡及自噬泡的数量

目的 研究磷酸肌酸减少大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡及白噬的能力.方法 雄性SD大鼠24只,体质量200 ～ 250 g,随机均分为假手术(sham)组、缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)组和磷酸肌酸钠(phosphocreatine,CP)干预组.其中CP组按4 mg/kg磷酸肌酸钠剂量于再灌注前经右股静脉注射.用TUNEL法检测心肌细胞凋亡;电子显微镜观察心肌细胞自噬泡的发生和线粒体的形态学改变;Western blot检测微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)蛋白的表达.结果 I/R组与sham组相比,线粒体超微结构损伤加重,自噬泡数量增多(P＜0.01),心肌细胞凋亡率明显增加(P＜0.01);CP干预组可减轻I/R组线粒体超微结构损伤,自噬泡数量减少(P＜0.05),降低心肌细胞凋亡率(P ＜0.05);LC3-Ⅱ作为评价自噬强度的指标,I/R组与sham组相比,LC3-Ⅱ蛋白的表达明显上调(P＜0.01);而CP与I/R组相比,该蛋白表达明显下调(P＜0.05).结论 磷酸肌酸通过减少大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡及自噬泡的数量,从而减轻心肌缺血再灌注损伤.     

白藜芦醇通过Sirtuins 1通路促进自噬减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤

目的观察白藜芦醇(Res)在大鼠局灶性脑缺血/再灌注(I/R)损伤中脑保护作用与自噬的关系。方法随机将大鼠分成假手术组(S组)、脑缺血/再灌注模型组(I/R组)、低和高剂量(15和40 mg/kg)Res处理组(R1和R2组),其中将R2组另设2个亚组:R2+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组和R2+Sirt1抑制剂Sirtinol组。线栓法构建大鼠I/R模型。缺血2 h,再灌注24 h后,用尼氏染色观察皮质区的组织学形态;用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测脑组织的梗死体积;用real-time QPCR和Western blot检测脑组织中Sirt1和LC3的mRNA和蛋白表达。结果与S组相比,I/R组大鼠可见明显的脑梗死灶,显微镜下见病理损伤改变,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Sirt1表达均有上升。Res预处理后,能明显减轻I/R大鼠皮质区的病理损伤,减少脑梗死体积(P0.01),显著增加I/R大鼠脑组织中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Sirt1的表达(P0.01);而Sirt1抑制剂及3-MA能削弱Res的作用。结论 Res减轻大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的脑保护作用可能与Res通过提高Sirt1的表达进而促进自噬来完成的。     

抑制mTOR通路对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠自噬的影响

目的:应用哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)抑制剂Cystatin C,探讨其对局灶性脑缺血再灌注大鼠自噬的影响。方法:成年雄性SD大鼠60只(体质量260~280 g),随机分为假手术组(sham)、缺血再灌注组(I/R)、Cystatin C组(根据不同浓度分为低、中、高3个亚组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每组12只。I/R组和Cystatin C组采用线栓法制备大鼠右侧脑缺血再灌注损伤模型。缺血2 h再灌注24 h,观察神经功能缺损评分、测定脑梗死体积;应用Western Blot技术检测损伤脑皮质中自噬标志物LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和Beclin-1的变化。结果:与I/R组相比,Cystatin CⅠ、Ⅱ组大鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积减少,而Cystatin CⅢ组大鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积增大。I/R组脑皮质中自噬标志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达明显升高(P0.05);Cystatin C各组脑皮质中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1的表达逐步升高,且与浓度呈正相关。结论:m TOR抑制剂Cystatin C干预脑缺血再灌注大鼠可诱导脑皮质组织自噬,Cystatin CⅠ、Ⅱ组可减轻脑组织损伤,而Cystatin CⅢ组则加重脑组织损伤。     

重组人EPO通过减少自噬减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤

目的研究重组人促红细胞生成素(rh EPO)在大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)损伤中的保护作用及其与自噬的关系。方法将60只SD大鼠随机分为假手术组(sham组)、缺血/再灌注组(I/R组)、rh EPO处理组(rh EPO组)、rh EPO+自噬激活剂雷帕霉素(Rap)处理组(rh EPO+Rap组)和雷帕霉素处理组(Rap组)。构建大鼠心肌I/R模型,术中监测血流动力学指标(LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax);于再灌注结束后检测血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性;采用伊文氏蓝-TTC法检测心肌梗死面积;采用Western blot法检测自噬相关基因LC3、Beclin1的蛋白表达。结果 I/R组心功能明显减弱,血清CK、LDH含量增高,可见明显心肌梗死,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达上升(P0.01)。rh EPO处理后,心功能明显改善,CK、LDH含量减少,心肌梗死面积缩小,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达下降(P0.01)。自噬激活剂雷帕霉素能削弱rh EPO的作用。结论 rh EPO减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用可能通过减少心肌自噬而完成。