内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性

目的:应用内部核糖体进入位点构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体,研究外源性基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞ECV304中的转染表达,探讨内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性。方法:实验于2003-12/2004-12在南京鼓楼医院科研部完成。将Phcmvsp1a-enos中内皮型一氧化氮合酶基因和PcDNA-vegf中血管内皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体PcDNA-ires中,构建重组质粒PcDNA-enos-ires-vegf,经酶切,聚合酶链反应扩增和部分DNA测序分析证实后,转染人脐静脉内皮细胞,硝酸还原酶法检测转染后细胞中一氧化氮和一氧化氮合酶活性,免疫组化和荧光双标记及westernblotting检测转染后细胞蛋白水平的表达,Trizol提取总RNA,反转录-聚合酶链反应测定转染后细胞mRNA水平的表达。结果:成功构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体PcDNA-enos-ires-vegf,双基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞基因组中获得整合及表达。重组基因PcDNA-enos-ires-vegf组与对照组PcDNA-enos在一氧化氮含量和一氧化氮合成酶活性的表达差异无显著性意义。PcDNA-enos-ires-vegf转染细胞后转染效率为30%～40%。结论:双基因表达载体PcD     

构建内皮型一氧化氮合酶真核表达载体及在内皮细胞的表达

背景:内皮型一氧化氮合酶表达产物对内皮细胞的影响是血管外科基础研究中的重要课题,对于生物人工血管的研制有重要意义。目的:构建内皮型一氧化氮合酶基因真核表达载体pcDNA3.1/eNOS,以脂质体为介导观察其在血管内皮细胞中的转染效率,评价表达产物内皮型一氧化氮合酶的酶学活性及其对内皮细胞生长的影响。设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2005-07/2007-05在南京大学医学院附属鼓楼医院生物化学实验室完成。材料:质粒PCMV-eNOS由勋阳医学院张群林教授惠赠。pcDNA3.1真核表达载体由南京大学博士后贾立军馈赠,pcDNA3.0/EGFP质粒由戚金亮博士提供。大肠杆菌DH5a和人脐静脉内皮细胞株(ECV304)为南京大学生物系保存。方法:采用分子生物学技术,先用限制性核酸内切酶EcorⅠ酶切质粒PCMV/eNOS,电泳回收3.6kb编码人内皮型一氧化氮合酶cDNA序列,克隆入质粒pcDNA3.1的EcorⅠ酶切位点,通过内皮型一氧化氮合酶cDNA序列中的XhoⅠ酶切位点筛选其插入载体的方向,构建pcDNA3.1/eNOS重组质粒。以Lipofec-tamine为介导将其与pcDNA3.0/EGFP共转染分离培养的人脐静脉内皮细胞(ECV304)。主要观察指标:①观察转染后对ECV304生长的影响,在流式细胞仪和荧光显微镜下计算转染效率。②以反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学检测内皮型一氧化氮合酶基因的表达,测定内皮型一氧化氮合酶活性以及一氧化氮产量。③观察施加不同因素(L-精氨酸、氯化钙、乙二胺四乙酸、L-NAME)对内皮型一氧化氮合酶活性及一氧化氮合成的影响;同时检测此时ECV304生长所受影响。结果:以脂质体为介导转染人脐静脉ECV304后,其转染效率为(32.6±2.6)%,反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学检测到相应的内皮型一氧化氮合酶mRNA和蛋白表达,与对照组有明显差别;同时在上述不同因素影响下内皮型一氧化氮合酶活性出现明显差别;随着培养液一氧化氮浓度升高,ECV304生长曲线下降。结论:成功构建pcDNA3.1/eNOS,在脂质体介导下能高效转染ECV304并良好表达,Ca2 是内皮型一氧化氮合酶的必要激活条件,ECV304的增生受到高浓度一氧化氮抑制。     

人可溶性血管内皮生长因子受体1基因克隆及真核表达载体的构建

背景;血管内皮生长因子在肿痛新生血管的形成中发挥着关键的作用,可溶性血管内皮生长因子受体1能竞争性地抑制血管内皮生长因子诱导新生血管形成的生物学功能.目的:克降人可溶性血管内皮生长因子受体基因1,尝试构建可溶性血管内皮牛长因子受体1基因的真核表达载体.设计、时间及地点:基因表达载体构建实验,于2006-1012007-11在中山大学附属第一医院外科实验室完成.材料:人脐静脉内皮细胞、pMD-18T载体及pcDNA3载体.方法:提取人脐静脉内皮细胞总RNA,使用反转录一聚合酶链反应的方法扩增获得到可溶性血管内皮生长因子受体1基因cDNA,并将其克隆至pMD-18T载体中,经酶切及测序证实.然后应用聚合酶链反应的方法从pMD-18T可溶性血管内皮生长因子受体1重组载体中克隆可溶性血管内皮生长因子受体1基因,再将其定向亚克降至真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1,提取质粒进行双酶切、聚合酶链反应及测序鉴定.主要观察指标:可溶性血管内皮生长因子受体1基因反转录一聚合酶链反应情况及pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1真核重组体的构建与鉴定结果.结果:构建的真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮牛长因子受体1经过双酶切及聚合酶链反应鉴定,证实其中含有目的可溶性血管内皮生长因子受体1基因;测序结果经比对分析,证实与预期设计的编码区cDNA一致.结论:应用反转录-聚合酶链反应方法成功从人脐静脉内皮细胞中克隆出可溶性血管内皮生长凼子受体1基因,成功构建出了可溶性血管内皮生长因子受体1基因真核表达载体.     

内皮型一氧化氮合酶基因转染对移植人工血管内膜增生的作用

目的：平滑肌细胞增殖移行和血小板激活导致血栓形成是移植血管再狭窄的主要原因，一氧化氮可以抑制上述生物反应，但内皮型一氧化氮合酶基因转染是否抑制种植了平滑肌细胞的人工血管内膜增生还未得到证实。实验拟进一步观察内皮型一氧化氮合酶基因转染对种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生的影响。 方法：实验于2006-04／2007—05在西安交通大学医学院中心实验室及分子生物学实验室完成。①实验材料；1月龄新西兰大白兔1只，用来获取平滑肌细胞。成年新西兰大白兔18只，随机数字表法分成3组，每组6只。正常细胞组移植未种植细胞的人工血管；LacZ转染组移植种植转染lacZ的平滑肌细胞的人工血管，内皮型一氧化氮合酶转染组移植种植内皮型一氧化氮合酶的平滑肌细胞的人工血管。②实验方法：构建含有报道基因lacZ和内皮型一氧化氮合酶基因的假型反转录病毒载体小鼠白血病病毒，疱疹性口炎病毒G糖蛋白，并转染平滑肌细胞。将转染了基因的细胞种植在人工血管上，并用血管旁路移植的方法植入兔腹主动脉。③实验评估：测定转染内皮型一氧化氮合酶基因及LacZ基因细胞培养上清中一氧化氮含量。血管植入30，100d后X—gal染色及苏木精一伊红染色观察人工血管上的平滑肌细胞，同时显微镜下测量每段血管内膜增生的厚度。 结果：纳入成年新西兰大白兔18只，均进入结果分析。①内皮型一氧化氮合酶转染组一氧化氮含量明显高于未转染的正常细胞组（P〈0．05）。平滑肌细胞转染lacZ基因后经X—gal染色，倒置显微镜下可见转染了基因的细胞被染成蓝色。②血管植入30d，与正常细胞组比较，LacZ转染组和内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度差异无显著性（P〉0．05）；100d后，内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度与正常细胞组?     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞☆

背景:血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义.目的:克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建 pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性.方法:采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和 DNA 测序的方法对提取和重组 DNA 进行鉴定.pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定.结果与结论:构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段.提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性.     

内皮型一氧化氮合酶基因转染对移植人工血管内膜增生的作用

背景：平滑肌细胞增殖移行和血小板激活导致血栓形成是移植皿管再狭窄的主要原因，一氧化氮可以抑制上述生物反应，但内皮型一氧化氮合酶基因转染是否可以抑制种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生还未得到证实。 目的：拟进一步观察内皮型一氧化氮合酶基因转染对种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生的影响。 设计、时间及地点：重复观察测量，于2006-04／2007-05在西安交通大学医学院中心实验室及分子生物学实验室完成。 材料：1月龄新西兰大白兔1只，用来获取平滑肌细胞。成年新西兰大白兔18只．随机分成3组，正常对照组植入未转染的人工血管．LacZ转染组植入种植转染lacZ的平滑肌细胞的人工血管，内皮型一氧化氮合酶转染组植入种植内皮型一氧化氮合酶的平滑肌细胞的人工血管。6只/组。 方法：构建含有报道基因lacZ和内皮型一氧化氮合酶基因的假型反转录病毒载体小鼠白血病病毒/疱疹性口炎病毒G糖蛋白，并转染平滑肌细胞。将转染了基因的细胞种植在人工血管上，并用血管旁路移植的方法植入兔腹主动脉。 主要观察指标：瓜氨酸法检测细胞培养上清中一氧化氮含量。移植血管内膜X-gal染色观察，种植的平滑肌细胞为蓝色，而内源性细胞为红色。显微镜下测量血管内膜增生厚度。 结果：18只兔均进入结果分析。内皮型一氧化氮合酶转染组一氧化氮含量明显高于正常对照组（P〈0．05）。转染lacZ基因的平滑肌细胞经X-gal染色呈蓝色。血管平滑肌细胞植入30d，各组内膜厚度基本相似（P〉0．05）：植入100d．正常对照组与内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度基本相似（P〉0．05），两组明显均低于lacZ转染组（P〈0．05）。 结论：内皮型一氧化氮合酶基因转染可抑制种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生。     

转染组织纤溶酶原激活物及内皮型一氧化氮合酶基因的内皮细胞和平滑肌细胞共同种植于人工血管对内膜增生的影响

背景:前期研究表明,双层细胞种植能有效提高内皮细胞保留率,将组织纤溶酶原激活物基因转染到内皮细胞中能提高其细胞溶解纤维蛋白的能力.目的:采用双细胞种植及修饰内皮的组织纤溶酶原激活物基因提高内皮细胞保留率和抗栓能力,通过内皮型一氧化氮合酶基因调控平滑肌细胞的增殖,观察对小口径人工血管通畅率的影响.方法:以4种不同组合细胞(内皮细胞+平滑肌细胞SMC,内皮细胞/组织纤溶酶原激活物+平滑肌细胞,内皮细胞+平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶,内皮细胞/组织纤溶酶原激活物+平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶)种植在PTFE管腔面.将新西兰大白兔随机分成4组,4种人工血管经旁路分别移植在4组兔的腹主动脉上.结果与结论:移植后60 d,种植内皮细胞+平滑肌细胞组和内皮细胞+平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶组内膜厚度无明显差异(P > 0.05).与内皮细胞/组织纤溶酶原激活物+平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶组相比,未转染内皮型一氧化氮合酶组(内皮细胞/组织纤溶酶原激活物+平滑肌细胞)内膜明显增厚(P < 0.05);未转染组织纤溶酶原激活物组(内皮细胞+平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶)内膜较薄(P < 0.05).提示组织纤溶酶原激活物基因转染可以促进血管内膜增生导致血管狭窄,但同时转入内皮型一氧化氮合酶基因可以抑制组织纤溶酶原激活物的促进平滑肌细胞增殖及内膜增生的作用.     

转染组织纤溶酶原激活物及内皮型一氧化氮合酶基因的内皮细胞和平滑肌细胞共同种植于人工血管对内膜增生的影响

背景：前期研究表明,双层细胞种植能有效提高内皮细胞保留率,将组织纤溶酶原激活物基因转染到内皮细胞中能提高其细胞溶解纤维蛋白的能力。目的：采用双细胞种植及修饰内皮的组织纤溶酶原激活物基因提高内皮细胞保留率和抗栓能力,通过内皮型一氧化氮合酶基因调控平滑肌细胞的增殖,观察对小口径人工血管通畅率的影响。方法：以4种不同组合细胞（内皮细胞＋平滑肌细胞SMC,内皮细胞/组织纤溶酶原激活物＋平滑肌细胞,内皮细胞＋平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶,内皮细胞/组织纤溶酶原激活物＋平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶）种植在PTFE管腔面。将新西兰大白兔随机分成4组,4种人工血管经旁路分别移植在4组兔的腹主动脉上。结果与结论：移植后60d,种植内皮细胞＋平滑肌细胞组和内皮细胞＋平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶组内膜厚度无明显差异（P〉0.05）。与内皮细胞/组织纤溶酶原激活物＋平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶组相比,未转染内皮型一氧化氮合酶组（内皮细胞/组织纤溶酶原激活物＋平滑肌细胞）内膜明显增厚（P〈0.05）;未转染组织纤溶酶原激活物组（内皮细胞＋平滑肌细胞/内皮型一氧化氮合酶）内膜较薄（P〈0.05）。提示组织纤溶酶原激活物基因转染可以促进血管内膜增生导致血管狭窄,但同时转入内皮型一氧化氮合酶基因可以抑制组织纤溶酶原激活物的促进平滑肌细胞增殖及内膜增生的作用。     

构建含人血管内皮细胞生长因子121腺病毒表达载体的体外表达实验

目的：构建携带人血管内皮细胞生长因子121cDNA的腺病毒表达载体，探讨应用血管内皮细胞生长因子基因治疗缺血性疾患的可行性。方法：实验于2003—05／2004—02于解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第6研究室（创伤烧伤复合伤国家重点实验室）完成。穿梭质粒pDC315和Ad5腺病毒基因组质粒pBHGloxdeltaE1，3Cre由解放军第三军医大学免疫学教研室邹强博士惠赠。pUC18-血管内皮细胞生长因子由第三军医大学高原医学教研室惠赠。BamH I，Xba I，NcoI DNA限制性内切酶均购自Takara公司；鼠抗人血管内皮细胞生长因子121单克隆抗体购自ROCHE公司；用双酶切法将pUC18-人血管内皮细胞生长因子121质粒中的人血管内皮细胞生长因子121cDNA克隆到穿梭质粒pDC315中，与腺病毒质粒pBHGloxdehaE1，3Cre共同转染293细胞并反复扩增，构建携带目的基因的重组腺病毒，并进行滴度测定。用重组腺病毒感染NTH3T3细胞，用免疫组化方法检测人血管内皮细胞生长因子121在NTH3T3细胞中的表达。结果：（1）重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121的鉴定：重组质粒经XbaI和NcoI酶切后，得到酶切片段长度为651bp的正向连接重组质粒。测序结果也证实作者重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121序列正确。（2）Ad-血管内皮细胞生长因子重组腺病毒构建及滴度测定：pDC315-人血管内皮细胞生长因子121重组质粒和pBHGloxdehaE1，3Cre质粒共转染293细胞后7d，部分293细胞出现CPE，10d后出现CPE的细胞明显增多，约2周时绝大多数细胞出现CPE，而对照组未转染质粒的细胞未见CPE现象。最终重组腺病毒Ad-人血管内皮细胞生长因子121滴度为1．0&;#215;10^10-4．3&;#215;10^11PFU／mL。（3）血管内皮细胞生长因子基因在NIH3T3细胞中的表达：重组腺病毒转染NIH3T3细胞48h后行细胞免疫组织化学染色，结果显示细胞人血管内皮细胞生长因子121染色阳性，阳性染色主要位于细胞浆中，而未转染病毒的细胞染色极弱。结论：构建的携带人血管内皮细胞生长因子121基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达，有可能用于缺血性疾息的基因治疗。     

内皮型一氧化氮合酶基因转染对移植人工血管内膜增生的作用

目的:平滑肌细胞增殖移行和血小板激活导致血栓形成是移植血管再狭窄的主要原因,一氧化氮可以抑制上述生物反应,但内皮型一氧化氮合酶基因转染是否抑制种植了平滑肌细胞的人工血管内膜增生还未得到证实.实验拟进一步观察内皮型一氧化氮合酶基因转染对种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生的影响.方法:实验于2006-04/2007-05在西安交通大学医学院中心实验室及分子生物学实验室完成.①实验材料:1月龄新西兰大白兔1只,用来获取平滑肌细胞.成年新西兰大白兔18只,随机数字表法分成3组,每组6只.正常细胞组移植未种植细胞的人工血管;LacZ转染组移植种植转染lacZ的平滑肌细胞的人工血管,内皮型一氧化氮合酶转染组移植种植内皮型一氧化氮合酶的平滑肌细胞的人工血管.②实验方法:构建含有报道基因lacZ和内皮型一氧化氮合酶基因的假型反转录病毒载体小鼠白血病病毒/疱疹性口炎病毒G糖蛋白,并转染平滑肌细胞.将转染了基因的细胞种植在人工血管上,并用血管旁路移植的方法植入兔腹主动脉.③实验评估:测定转染内皮型一氧化氮合酶基因及LacZ基因细胞培养上清中一氧化氮含量.血管植入30,100 d 后X-gal染色及苏木精-伊红染色观察人工血管上的平滑肌细胞,同时显微镜下测量每段血管内膜增生的厚度.结果:纳入成年新西兰大白兔18只,均进入结果分析.①内皮型一氧化氮合酶转染组一氧化氮含量明显高于未转染的正常细胞组(P ＜ 0.05).平滑肌细胞转染lacZ基因后经X-gal染色,倒置显微镜下可见转染了基因的细胞被染成蓝色.②血管植入30 d,与正常细胞组比较,LacZ转染组和内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度差异无显著性(P ＞ 0.05);100 d后,内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度与正常细胞组无明显差异,与LacZ转染组相比较,差异显著(P ＜ 0.05).结论:内皮型一氧化氮合酶基因转染抑制了种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生.     

人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒的构建及体外表达

目的：构建人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒。方法：实验于2005-03／2005—10在华中科技大学同济医学院公共实验平台完成。①通过聚合酶链反应对pcDNA3．1-BMP2及pUC-CAGGS-VEGF165的目的基因片段亚克隆并引入新的酶切位点，将其分别定向连人真核双表达载体pIPES，构建同时表达两个目的基因的双顺反子，通过聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定鉴定重组质粒。②重组质粒经脂质体介导体外转染小鼠骨髓基质细胞，通过反转录-聚合酶链反应检测骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA的表达。结果：①pIRES-BMP2-VEGF165双基因表达质粒的构建和鉴定：将重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165分别作XhoⅠ／MluⅠ和Xba Ⅰ／NotⅠ双酶切，经10g／L琼脂糖凝胶电泳可见1．2kbp的人骨形成蛋白2条带和592bp的血管内皮生长因子165条带，酶切条带与聚合酶链反应产物电泳带处于相同位置。经聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定证实，目的基因插入片段方向正确，DNA序列无突变。②骨形成蛋白2、血管内皮生长因子165mRNA的表达：以转染pIPES空质粒为阴性对照，48h后提取转染细胞的RNA分别用P1，P2和P3，P4作为引物进行反转录一聚合酶链反应。结果表明转染pIPES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质细胞扩增出1．2kbp及592bp两条带。证实该重组质粒能在体外同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165 mRNA。结论：成功构建了可同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165的双基因真核表达质粒，为进行联合基因治疗骨缺损的实验研究奠定了基础。     

血管内皮生长因子C靶向RNA干扰重组载体的构建和效应检测

目的:构建针对人血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,并观察其在胃癌细胞中的干扰效果。方法:实验于2006-02/2007-02在河南省分子医学重点学科开放实验室完成。①实验材料:小干扰RNA表达载体pSilencer3.1为美国Ambion公司产品;胃癌细胞SGC7901为河南省分子医学重点学科开放实验室保存;血管内皮生长因子C基因的干扰片断和聚合酶链反应引物(152bp)由上海生工生物公司合成。②实验过程:根据pSilencer3.1-H1载体要求设计靶向血管内皮生长因子C基因的两对小干扰RNA,退火后连接入载体相应位点,构建重组表达质粒。经酶切和测序鉴定后分别转染胃癌细胞株SGC-7901,经G418筛选,获得稳定表达的细胞株。③实验评估:采用反转录-聚合酶链反应和Westernblot法检测血管内皮生长因子CmRNA和蛋白水平的表达。结果:①重组质粒的酶切、核苷酸序列分析结果:经酶切和测序鉴定证实成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,建立了稳定转染细胞株。②稳定转染的细胞株中血管内皮生长因子CmRNA和蛋白表达:反转录-聚合酶链反应和Western blot显示转染后血管内皮生长因子C表达与对照组相比有不同程度的降低,以pSilencer3.1-neo-VEGF-C1尤为明显,抑制血管内皮生长因子C表达,不影响细胞的生长。结论:成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体及稳定转染的胃癌细胞株。     

内皮型一氧化氮合酶基因转染对血管损伤后新生内膜增生的影响

背景：一氧化氮能够抑制血管平滑肌细胞的迁移和增殖,而一氧化氮合酶是其合成的关键酶,有关一氧化氮合酶基因体内转染对平滑肌细胞及动脉粥样硬化血管损伤后内膜增生影响少有报道。目的：观察内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）基因体内局部转染对动脉粥样硬化大鼠血管损伤后新生内膜增生的抑制作用。方法：建立动脉粥样硬化Wistar大鼠颈动脉球囊损伤模型,建模后随机分成空白对照组、AdCMV-lacz对照组和AdCMV-eNOS组,分别将PBS,AdCMV-lacz和AdCMV-eNOS体内转染至以上3组大鼠的损伤血管壁。转染2周后培养并鉴定损伤局部平滑肌细胞,并用RT-PCR法检测各组损伤及转染后血管平滑肌细胞eNOS mRNA的表达,同时观察转染后不同时期新生内膜增生的影响。结果与结论：AdCMV-eNOS组的颈总动脉血管平滑肌细胞可表达eNOS mRNA。3组大鼠转染后1和3个月,AdCMV-eNOS组内膜/中膜面积比值低于空白对照组和AdCMV-lacz对照组（P〈0.01）。结果显示,eNOS基因体内转染损伤后血管可以抑制血管新生内膜增生,减少再狭窄发生率。     

内皮型一氧化氮合酶基因转染对血管损伤后新生内膜增生的影响

背景:一氧化氮能够抑制血管平滑肌细胞的迁移和增殖,而一氧化氮合酶是其合成的关键酶,有关一氧化氮合酶基因体内转染对平滑肌细胞及动脉粥样硬化血管损伤后内膜增生影响少有报道。目的:观察内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)基因体内局部转染对动脉粥样硬化大鼠血管损伤后新生内膜增生的抑制作用。方法:建立动脉粥样硬化Wistar大鼠颈动脉球囊损伤模型,建模后随机分成空白对照组、AdCMV-lacz对照组和AdCMV-eNOS组,分别将PBS,AdCMV-lacz和AdCMV-eNOS体内转染至以上3组大鼠的损伤血管壁。转染2周后培养并鉴定损伤局部平滑肌细胞,并用RT-PCR法检测各组损伤及转染后血管平滑肌细胞eNOS mRNA的表达,同时观察转染后不同时期新生内膜增生的影响。结果与结论:AdCMV-eNOS组的颈总动脉血管平滑肌细胞可表达eNOS mRNA。3组大鼠转染后1和3个月,AdCMV-eNOS组内膜/中膜面积比值低于空白对照组和AdCMV-lacz对照组(P<0.01)。结果显示,eNOS基因体内转染损伤后血管可以抑制血管新生内膜增生,减少再狭窄发生率。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景:已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达.尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究.目的:创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒.设计、时间及地点:基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成.材料:人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所.方法:设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段.构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1-4)并行酶切鉴定分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率.主要观察指标:重组质粒酶切鉴定结果.转染效率.采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达.结果:成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒.重组质粒经酶切鉴定证实构建成功.质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%.短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%.结论:成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用.短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显.     

人反义血管内皮生长因子基因载体构建及对肾细胞癌血管内皮生长因子表达的影响

目的:构建反义血管内皮生长因子基因表达载体,观察其对肾癌细胞血管内皮生长因子表达的影响.方法:实验于2006-07/2007-03在郑州大学第三附属医院实验中心完成.①实验材料:质粒pcDNA3.1(-),宿主菌DH5α,肾癌细胞株786-0.②实验过程:克隆人血管内皮生长因子基因,将反义血管内皮生长因子基因定向克隆于质粒pcDNA3.1(-)表达载体,酶切鉴定;转染人肾癌细胞,并分别命名为反义血管内皮生长因子组和空载体组,未转染细胞命名为对照组;G418筛选阳性克隆.③实验评估:反转录-聚合酶链反应方法检测血管内皮生长因子mRNA的表达,免疫组织化学法检测血管内皮生长因子基因的蛋白表达,流式细胞术检测细胞周期,四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长情况.结果:①成功构建反义血管内皮生长因子基因表达载体.②反义血管内皮生长因子组血管内皮生长因子mRNA的表达受到抑制,明显低于空载体组和对照组血管内皮生长因子mRNA的表达(P＜0.01),空载体组血管内皮生长因子mRNA的表达没有受到影响.③反义血管内皮生长因子组的血管内皮生长因子蛋白表达明显降低,明显低于空载体组和对照组(P＜0.01),空载体组和对照组血管内皮生长因子蛋白的表达差异无显著性.④反义血管内皮生长因子组细胞生长减慢,G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少,反义血管内皮生长因子组细胞生长明显减慢.结论:成功构建血管内皮生长因子的pcDNA3.1(-)反义基因表达载体,人反义血管内皮生长因子基因可明显降低肾癌细胞血管内皮生长因子基因在转录和翻译水平的表达,抑制肾癌细胞生长,为肾癌基因治疗提供一定的实验依据.     

构建含人血管内皮细胞生长因子121腺病毒表达载体的体外表达实验

目的:构建携带人血管内皮细胞生长因子121cDNA的腺病毒表达载体,探讨应用血管内皮细胞生长因子基因治疗缺血性疾患的可行性。方法:实验于2003-05/2004-02于解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第6研究室(创伤烧伤复合伤国家重点实验室)完成。穿梭质粒pDC315和Ad5腺病毒基因组质粒pBHGloxdeltaE1,3Cre由解放军第三军医大学免疫学教研室邹强博士惠赠。pUC18-血管内皮细胞生长因子由第三军医大学高原医学教研室惠赠。BamHI,XbaI,NcoIDNA限制性内切酶均购自Takara公司;鼠抗人血管内皮细胞生长因子121单克隆抗体购自ROCHE公司;用双酶切法将pUC18-人血管内皮细胞生长因子121质粒中的人血管内皮细胞生长因子121cDNA克隆到穿梭质粒pDC315中,与腺病毒质粒pBHGloxdeltaE1,3Cre共同转染293细胞并反复扩增,构建携带目的基因的重组腺病毒,并进行滴度测定。用重组腺病毒感染NTH3T3细胞,用免疫组化方法检测人血管内皮细胞生长因子121在NTH3T3细胞中的表达。结果:①重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121的鉴定:重组质粒经XbaI和NcoI酶切后,得到酶切片段长度为651bp的正向连接重组质粒。测序结果也证实作者重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121序列正确。②Ad-血管内皮细胞生长因子重组腺病毒构建及滴度测定:pDC315-人血管内皮细胞生长因子121重组质粒和pBHGloxdeltaE1,3Cre质粒共转染293细胞后7d,部分293细胞出现CPE,10d后出现CPE的细胞明显增多,约2周时绝大多数细胞出现CPE,而对照组未转染质粒的细胞未见CPE现象。最终重组腺病毒Ad-人血管内皮细胞生长因子121滴度为1.0×1010～4.3×1011PFU/mL。③血管内皮细胞生长因子基因在NIH3T3细胞中的表达:重组腺病毒转染NIH3T3细胞48h后行细胞免疫组织化学染色,结果显示细胞人血管内皮细胞生长因子121染色阳性,阳性染色主要位于细胞浆中,而未转染病毒的细胞染色极弱。结论:构建的携带人血管内皮细胞生长因子121基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达,有可能用于缺血性疾患的基因治疗。