miR-381-3p通过靶向ERK1/2/ETS1信号通路影响MC3T3-E1细胞成骨分化

目的 探讨miR-381-3p对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响和作用机制。方法 慢病毒转染细胞后实验分为NC mimic miR-381-3p组、mimic miR-381-3p组、NC inhibitor miR-381-3p组和inhibitor miR-381-3p组;运用实时荧光定量PCR(qR T-PCR)法检测不同组miR-381-3p的表达水平以验证转染效率;诱导MC3T3-E1细胞成骨分化后,检测各组细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性水平;茜素红染色法检测各组细胞的成骨矿化能力; qR T-PCR测定各组细胞中ALP、Runx2、PPARγ和ETS1 mR NA表达水平;蛋白免疫印迹法测定各组细胞中collagenⅠ、ALP、Runx2、PPARγ、ETS1、P-ERK1/2水平;并用MAPK/ERK通路抑制剂(PD98059)干预各组细胞后进行目的蛋白检测。结果 与NC mimic miR-381-3p组、mimic miR-381-3p组及NC inhibitor miR-381-3p组比较,inhibitor miR-381-3p组中细胞中ALP、Runx2、ET...     

LncRNA DANCR靶向调控对绝经后骨质疏松BMSCs成骨分化的作用

目的 研究长链非编码RNA（lncRNA）分化非蛋白编码 RNA（DANCR）靶向微小RNA（miR）-19a-3p对绝经后骨质疏松（PMOP）骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的调控作用。方法 选择健康女性志愿者4例和PMOP患者4例，分离培养BMSCs；PMOP患者BMSCs进行分组，转染阴性对照（NC）siRNA、lncRNA DANCR siRNA、miR-NC抑制物、miR-19a-3p抑制物。检测lncRNA DANCR、miR-19a-3p、PTEN的表达水平，成骨诱导分化后检测茜素红染色的OD405水平、碱性磷酸酶（ALP）活力、骨钙素（OCN）及骨桥蛋白（OPN）的mRNA表达水平。结果 PMOP患者BMSCs中lncRNA DANCR、PTEN的表达水平高于健康女性，miR-19a-3p的表达水平及成骨诱导后的OD405水平、ALP活力、OCN及OPN的表达水平均低于健康女性。在PMOP患者BMSCs中，si-DANCR组的lncRNA DANCR、PTEN的表达水平低于si-NC组，成骨诱导后的OD405水平、ALP活力及miR-19a-3p、OCN、OPN的表达水平高于si-NC组；si-DANCR+miR-19a-3p抑制物组成骨诱导后的OD405水平、ALP活力及miR-19a-3p、OCN、OPN的表达水平低于si-DANCR+miR-NC抑制物组，PTEN的表达水平高于si-DANCR+miR-NC抑制物组。结论 LncRNA DANCR靶向miR-19a-3p调控PMOP患者BMSCs的成骨分化。     

miR-124-3p靶向Axin1 调控糖尿病骨质疏松成骨的研究

目的 研究miR-124-3p靶向Axin1 调控糖尿病骨质疏松症大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ，BMSCs）成骨分化的作用。方法 20只糖尿病大鼠模型-SPF级SD雌性大鼠分为分组对照组10例、实验组10例，经过药物注射，测血生化指标，测骨密度。BMSCs培养，流式细胞学鉴定。检测对照组和实验组miR-124-3p mRNA的表达。过表达miR-124-3p（模拟物）7、14、21 d，检测ALP、茜素红染色成骨能力。第7天检测miR-124-3p mRNA表达水平。实验组细胞用miR-124-3p模拟物转染，分为高糖组和低糖组，检测中Axin1 mRNA水平。构建载体，与模拟物共转染，荧光素酶报告基因检测miR-124-3p和Axin1靶向结合。将实验组BMSCs分为高糖组和低糖组，检测实验组BMSCs高糖组及低糖组miR-124-3p、Runx2 mRNA的表达及茜素红染色和ALP染色结果。检测实验组模拟物在高糖组及低糖组miR-124-3p、Runx2 mRNA的表达及茜素红染色和ALP染色结果。结果 ELISA检测血生化指标，实验组TG、TC、FPG、HbA1C值上调，β-CTX和SOST上调，OC和骨密度下调。BMSCs培养，流式细胞学鉴定显示CD73和CD105的表达为阳性， CD34 和 CD45 的表达呈阴性。符合间充质干细胞的抗原特点，证实为BMSCs。实验组miR-124-3p表达明显低于对照组。过表达miR-124-3p（模拟物）7、14、21 d，ALP、茜素红染色随时间逐渐升高。第7天miR-124-3p表达水平显著升高。实验组细胞用miR-124-3p模拟物转染，结果高糖组Axin1 mRNA表达水平上调，但用miR-124-3p模拟物转染时水平下降。荧光素酶报告基因检测miR-124-3p和Axin1可以靶向结合。RT-qPCR检测实验组BMSCs高糖摄入显著降低了miR-124-3p、Runx2表达；高糖可抑制成骨分化，减少钙沉积，减少ALP表达。高血糖条件下miR-124-3p过表达（模拟物）中Runx2的表达显示，高糖+对照明显低于低糖+对照组；高糖+miR-124-3p模拟物明显高于高糖+对照组。茜素红染色和ALP染色显示，高糖+对照明显低于低糖+对照组；高糖+miR-124-3p模拟物明显高于高糖+对照组。结论 miR-124-3p能通过靶向抑制Axin1促进糖尿病骨质疏松症大鼠BMSC的成骨发生。     

仙茅苷调节lncRNA MEG3/miR-181a-5p通路对骨质疏松大鼠成骨细胞自噬的影响

目的 探讨仙茅苷（Curculigoside，CUR）对骨质疏松症（osteoporosis，OP）大鼠成骨细胞自噬的影响以及对lncRNA MEG3/miR-181a-5p信号轴的调节作用。方法 体外培养骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）诱导成骨细胞分化，CCK-8法筛选CUR浓度；数据库预测lncRNA MEG3与miR-181a-5p结合位点；利用转染技术将BM-MSCs细胞分为NC组、CUR组、CUR+3-MA组、CUR+pc-NC组和CUR+pc-LncRNA MEG3组，qRT-PCR检测lncRNA MEG3、miR-181a-5p的表达水平，碱性磷酸酶（ALP）染色法检测细胞ALP活性，MDC法检测细胞自噬体数量，免疫荧光检测细胞微管相关蛋白1-轻链3（LC3）、自噬效应蛋白（Beclin1）的表达。肌肉注射地塞米松磷酸钠建立OP大鼠，大鼠分为对照组（CT组）、模型组（OP组）、OP+CUR组（灌胃15 mg/kg CUR），CT检测大鼠胫骨骨形态学，Western blot和qRT-PCR分别检测LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1与lncRNA MEG3、miR-181a-5的表达。结果 25 μg/mL以上浓度的CUR显著提高BM-MSCs细胞增殖活力（P＜0.05）；lncRNA MEG3与miR-181a-5p具有靶向结合位点；与NC组相比，CUR组细胞ALP活性、自噬体数量以及LC3、Beclin1表达增加（P＜0.05）；与CUR组相比，CUR+3-MA组细胞ALP活性、自噬体数量以及LC3、Beclin1表达减少（P＜0.05）；与CUR+pc-NC组相比，CUR+pc-LncRNA MEG3组细胞ALP活性、自噬体数量以及LC3、Beclin1表达减少（P＜0.05）。OP组大鼠骨形态学评价以及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、miR-181a-5p表达较CT组下降，lncRNA MEG3表达增加（P < 0.05）；OP+ CUR组大鼠骨形态学评价以及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、miR-181a-5p表达较OP组增加，lncRNA MEG3表达降低（P＜0.05）。结论 CUR可能通过调节LncRNA MEG3/miR-181a-5p信号轴促进OP大鼠成骨细胞自噬活性。     

lncRNA MEG3靶向调节miR-27a-3p抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的实验研究

目的:探究lncRNA MEG3对胃癌(GC)细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。方法:qRT-PCR检测人正常胃上皮细胞GES-1和GC细胞(BGC823、MGC803、SGC7901、AGS、MKN28、MKN451)中MEG3及miR-27a-3p表达差异;将AGS细胞分为对照组、GV144组、GV144-MEG3组、GV144-MEG3+miR-27a-3p NC组、GV144-MEG3+miR-27a-3p mimics组;比较各组AGS细胞中MEG3及miR-27a-3p表达情况;检测细胞增殖、迁移和侵袭能力,Western blot检测ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达,双荧光素酶报告实验验证MEG3与miR-27a-3p的靶向关系。结果:与GES-1细胞相比,GC细胞中MEG3水平降低,miR-27a-3p水平升高(P<0.05);与对照组相比,GV144-MEG3组MEG3水平升高,miR-27a-3p、ki-67、MMP-2、MMP-9水平及增殖、迁移和侵袭能力降低(P<0.05);上调miR-27a-3p表达可减弱MEG3过表达对AGS细胞恶性行为的抑制作用。miR-27a-3p是MEG3的靶基因。结论:过表达MEG3可能通过靶向下调miRNA-27a-3p表达抑制AGS细胞增殖、迁移及侵袭。     

miR-26a-5p靶向PTEN基因影响成骨细胞分化及基质矿化

摘要：目的 探究微小RNA-26a-5p（miR-26a-5p）对第10染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因（PTEN）的靶向作用及对成骨细胞分化及基质矿化的影响。方法 通过在线软件预测miR-26a-5p与PTEN基因的结合位点，并经双荧光素酶报告基因检测验证。取生长状态良好的MC3T3-E1细胞，分为miR-26a-5p模拟物（mimic）组、miR-26a-5p mimic阴性对照（NC）组、pcDNA3.1-PTEN组、miR-26a-5p+pcDNA3.1-PTEN组，通过MTT法检测细胞增殖、碱性磷酸酶活性测定研究细胞分化情况、骨钙素定量检测分析和茜素红染色观察细胞基质矿化情况、Western blot检测成骨分化标志物和Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路蛋白表达变化。结果 与NC组比较，miR-26a-5p mimic组miR-26a-5p水平、细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原（ColⅠ）、骨桥蛋白（OPN）、骨钙素、矿化率及β-catenin表达升高，PTEN mRNA及蛋白表达和糖原合成酶激酶-3b（Gsk-3b）表达降低（P＜0.05），pcDNA3.1-PTEN组PTEN mRNA及蛋白表达和Gsk-3b表达升高，细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ、OPN、骨钙素、矿化率及β-catenin表达降低（P＜0.05）；与miR-26a-5p mimic组比较，miR-26a-5p+pcDNA3.1-PTEN组PTEN mRNA及蛋白表达和Gsk-3b表达升高，细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ、OPN、骨钙素、矿化率及β-catenin表达降低（P＜0.05）。结论 miR-26a-5p可靶向下调PTEN表达，调控Wnt/β-catenin信号通路，促进成骨细胞增殖、分化及基质矿化。     

MicroRNA-196a靶向调节HDAC9对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

目的 探究微小RNA（miR）-196a靶向调节组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法 将MC3T3-E1细胞分为对照组（Cont）组、诱导组、miR-196a-mimics-NC组、miR-196a-mimics组、miR-196a-inhibitor-NC组、miR-196a-inhibitor组、miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9-NC组、miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9组,根据分组转染后进行成骨诱导。定量荧光PCR检测MC3T3-E1细胞中miR-196a、HDAC9表达量;试剂盒检测碱性磷酸酶（ALP）活性;茜素红染色观察矿化程度;Western blot检测HDAC9、ALP、Runt相关转录因子2（Runx2）、胶原蛋白I（COL1）、骨桥蛋白（OPN）、Histone H3、Histone H3（acetyl K9、K14和K23）表达量。结果 与Cont组相比,诱导组MC3T3-E1细胞中miR-196a表达、ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表达、ALP活性、矿化程度及Histone H3 K9、K14、K23位点乙酰化水平增高（P＜0.05）,HDAC9 mRNA和蛋白表达降低（P＜0.05）。转染miR-196a-mimics可明显增加miR-196a表达,降低HDAC9表达,并增加ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表达、ALP活性、矿化程度及Histone H3乙酰化,转染miR-196a-inhibitor则作用相反。miR-196a可靶向下调HDAC9表达,过表达HDAC9可部分逆转miR-196a mimics对MC3T3-E1细胞成骨分化的促进效应。结论 miR-196a可靶向下调HDAC9表达,增加组蛋白乙酰化水平,促进MC3T3-E1细胞成骨分化。     

过表达miR-664a-5p激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨质疏松大鼠骨重建

目的 探究过表达miR-664a-5p的脂肪间充质干细胞（miR-664a-5p-ADSCs）通过激活Wnt/β-catenin信号通路对骨质疏松（OP）大鼠骨重建的促进作用。方法 将大鼠分为Sham组、OVX组、ADSCs组和miR-664a-5p-ADSCs组。切除卵巢建立OP大鼠模型,Sham组仅切除脂肪组织。3个月后,ADSCs组和miR-664a-5p-ADSCs组分别尾静脉注射miR-664a-5p-ADSCs及其阴性对照ADSCs;Sham组和OVX组注射等量生理盐水。1个月后进行指标检测。micro-CT、HE染色、TRAP染色检测OP大鼠骨重建情况;免疫组化染色、RT-qPCR、Western blot检测Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin mRNA和蛋白的表达。结果 Sham组骨小梁完整,破骨细胞较少;与Sham组相比,OVX组骨小梁稀疏且变薄,破骨细胞较多;Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平明显降低（P<0.05）;与OVX组相比,ADSCs组、miR-664a-5p-ADSCs组骨小梁增加且增厚,破骨细胞较少;Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平明显升高,且miR-664a-5p-ADSCs组上述效果强于ADSCs组（P<0.05）。结论 过表达miR-664a-5p的ADSCs通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进OP大鼠骨重建。     

IGF-1介导MAPKs通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的作用

目的 探究胰岛素样生长因子1(IGF-1)介导丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的调控作用及机制。方法 不同浓度IGF-1(0、5、10、20 ng/mL)培养C3H10T1/2细胞,碱性磷酸酶(ALP)与茜素红(ARS)染色检测ALP活性、钙盐沉积情况,qRT-PCR法检测成骨特性因子核心结合因子α-1(RUNX2)、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平,Western Blot法检测MAPK通路蛋白磷酸化表达水平。对数期细胞分为空白组、IGF-1组、ERK通路抑制剂(PD98059)组、PD+IGF-1组、p38通路抑制剂(SB202192)组、SB+IGF-1组,qRT-PCR法检测成骨特性因子RUNX2、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平。结果 不同浓度IGF-1组ALP显色加深,ALP活性升高,钙盐结节形成增多,RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平升高,磷酸化ERK、p38、JNK蛋白表达增加,具有剂量效应(P<0.05)。与空白组比较,PD组、SB...     

H_2O_2下调miR-21对MC3T3-E1细胞成骨分化影响的研究北大核心CSCD

目的探讨H_2O_2诱导的miR-21下调对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用及机制。方法取MC3T3-E1细胞系,培养传至第7代进行实验。取MC3T3-E1细胞,以不同浓度H_2O_2(0、40、80、160、320μmol/L)培养,经实时荧光定量PCR检测miR-21表达、MTS法检测细胞活性,选择H_2O_2最合适实验浓度。取MC3T3-E1细胞分为空白对照组(A组)、H_2O_2组(B组)、成骨诱导组(C组)、H_2O_2+成骨诱导组(D组),对应培养后实时荧光定量PCR检测miR-21表达以及成骨标志基因Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠalpha 1,Col1a1)表达,Western blot检测磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)蛋白表达,茜素红染色观察细胞外钙基质沉积情况,分析H_2O_2对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。然后再取MC3T3-E1细胞,分为H_2O_2组(A1组)、H_2O_2+成骨诱导组(B1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂+成骨诱导组(C1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂阴性对照+成骨诱导组(D1组);以及H_2O_2组(A2组)、H_2O_2+成骨诱导组(B2组)、H_2O_2+ siRNA-PTEN阴性对照+成骨诱导组(C2组)、H_2O_2+siRNA-PTEN+成骨诱导组(D2组);对应培养后检测成骨标志基因(Runx2、OPN、Col1a1)表达以及细胞外钙基质沉积情况,分析下调miR-21或沉默PTEN对细胞成骨分化的影响。结果结合实时荧光定量PCR检测以及MTS法结果,选择160μmol/L H_2O_2进行实验。第1、2周B组miR-21相对表达量低于A组(P<0.05),D组低于C组(P<0.05);第2周C组PTEN蛋白相对表达量均低于A、D组(P<0.05);第1、2周D组Runx2、OPN及Col1a1 mRNA相对表达量均低于C组(P<0.05),茜素红染色显示D组钙基质沉积少于C组。C1组PTEN蛋白相对表达量高于D1组(P<0.05);第1、2周B1、D1组Runx2、OPN mRNA相对表达量均高于C1组(P<0.05),第2周B1、D1组Col1a1 mRNA均高于C1组(P<0.05);茜素红染色显示C1组钙基质沉积少于B1、D1组。第1周D2组OPN、Col1a1 mRNA相对表达量高于B2、C2组(P<0.05),第3周茜素红染色显示D2组钙基质沉积明显多于B2、C2组。结论 H_2O_2抑制MC3T3-E1成骨分化可能与miR-21下调有关。     

lncRNA XIST靶向miR-302a-3p对IL-1β诱导软骨细胞损伤的调控机制

目的 探讨lncRNA X染色体失活特异转录因子（XIST）靶向miR-302a-3p对白细胞介素-1β（IL-1β）诱导软骨细胞损伤的调控机制。方法 SW1353细胞分为Control组、IL-1β组、IL-1β+si-NC组、IL-1β+si-XIST组、IL-1β+si-PDK1组、IL-1β+si-XIST+miR-NC inhibitor组、IL-1β+si-XIST+miR-302a-3p inhibitor组。检测XIST、miR-302a-3p以及3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）mRNA表达;噻唑蓝（MTT）实验测定细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;qRT-PCR检测炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10）水平;双荧光素酶报告基因检测实验证实miR-302a-3p与XIST或PDK1的靶向关系;免疫印迹法检测凋亡蛋白（Bcl-2、Bax）及PDK1蛋白表达。结果 与IL-1β组相比,IL-1β+si-XIST组XIST表达下调,细胞活力升高,凋亡率降低,Bax表达及TNF-α、IL-1β、IL-6水平下降,Bcl-2表达及IL-4、IL-10水平升高（P<0.05）。XIST直接靶向下调miR-302a-3p表达,miR-302a-3p下调可恢复si-XIST介导的促增殖、抗凋亡和炎症反应作用（P<0.05）。PDK1是miR-302a-3p的靶基因,沉默PDK1可抑制细胞的炎症反应（P<0.05）。结论 敲低XIST可提高IL-1β诱导软骨细胞的细胞活力,减轻OA样软骨细胞损伤,其作用机制与靶向上调miR-302a-3p进而抑制PDK1表达有关。     

LncRNA FGD5-AS1靶向miR-103a-3p对IL-1β诱导的关节软骨细胞凋亡的机制研究

目的探讨LncRNA FGD5-AS1靶向miR-103a-3p对IL-1β诱导的关节软骨细胞损伤及细胞凋亡的影响与分子机制。方法体外培养大鼠关节软骨细胞,分为NC组、IL-1β组(IL-1β浓度为10 ng/m L)。采用qRT-PCR检测细胞中FGD5-AS1、miR-103a-3p的表达水平。分别将pc DNA-FGD5-AS1、miR-103a-3p mimics转染至软骨细胞,随后使用IL-1β处理48 h。采用ELISA检测IL-6、TNF-α、IL-8水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告实验验证FGD5-AS1与miR-103a-3p的靶向关系; Western blot检测Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表达量。结果与NC组相比,IL-1β组软骨细胞中FGD5-AS1的表达水平显著降低(P0.05),miR-103a-3p、Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3的表达水平显著升高(P0.05),IL-6、TNF-α、IL-8水平显著升高(P0.05),细胞凋亡率显著升高(P0.05); FGD5-AS1过表达后可明显降低IL-6、TNF-α、IL-8、p-NF-κB p65、p-IκBα水平(P0.05),降低细胞凋亡率(P0.05),抑制Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3表达(P0.05);双荧光素酶报告实验证实FGD5-AS1靶向结合miR-103a-3p并可负向调控miR-103a-3p的表达(P0.05); miR-103a-3p过表达可明显逆转FGD5-AS1过表达对细胞凋亡及炎症反应的抑制作用(P0.05)。结论 LncRNA FGD5-AS1可通过靶向负调控miR-103a-3p的表达从而抑制IL-1β诱导的关节软骨细胞炎症反应及细胞凋亡,其作用机制可能通过抑制NF-κB信号通路激活有关。     

miR-92a-3p靶向EZH2对IL-1β诱导软骨细胞合成基质降解酶的影响

目的研究miR-92a-3p靶向zeste基因增强子同源物2(EZH2)对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的软骨细胞合成基质降解酶的影响。方法分离培养人软骨细胞,分成Normal、IL-1β(IL-1β处理)、miR-NC+IL-1β(mimics control转染后IL-1β处理)、miR-92a-3p+IL-1β(miR-92a-3p mimics转染后IL-1β处理)组,RT-PCR方法测定miR-92a-3p表达变化,Western blot检测MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表达。靶基因预测软件发现EZH2可能为miR-92a-3p的靶基因,荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。将p CDNA3.1-EZH2和miR-92a-3p mimics共同转染到软骨细胞中,检测MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表达情况。结果与Normal比较,IL-1β组细胞中miR-92a-3p表达减少,MMP-13、MMP-1表达增多,COLⅡ表达减少(P0.05)。与miR-NC+IL-1β比较,miR-92a-3p+IL-1β组细胞中miR-92a-3p表达增多,MMP-13、MMP-1表达减少,COLⅡ表达增多(P0.05)。miR-92a-3p靶向负调控EZH2表达。p CDNA3.1-EZH2可以逆转miR-92a-3p mimics对IL-1β条件下软骨细胞中MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表达影响。结论 miR-92a-3p靶向下调EZH2抑制IL-1β诱导的软骨细胞合成基质降解酶。     

微小RNA-30a-5p激活Wnt/β-连环蛋白信号通路对胃癌细胞增殖与侵袭的作用机制

目的探讨人微小RNA(has-miR)-30a-5p调控Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路对胃癌细胞增殖及侵袭的影响及其作用机制。方法体外培养胃癌MKN-45细胞;在所研究胃癌细胞系中使用小干扰RNA(siRNA)转染建立miR-30a-5p的敲除和过表达模型, 胃癌MKN-45细胞分为3组:miR-30a-5p小干扰RNA(miR-30a-5p inhibitor)组, miR-30a-5p过表达RNA组和空白对照组(NC), 荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测Wnt/β-catenin信号通路相关标志物Cyclin D1(CCND1)基因的表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-30a-5p与Wnt信号通路下游关键基因CCND1的靶向调节关系;在培养的胃癌细胞MKN-45中加入Wnt/β-catenin信号通路抑制剂-银杏双黄酮, 分为miR-30a-5p inhibitor组、miR-30a-5p inhibitor+银杏双黄酮组、miR-30a-5p Inhibitor NC组及miR-30a-5p Inhibit...     

健骨胶囊对成骨样细胞MC3T3-E1增殖及分化作用机制

目的 探讨国医大师刘柏龄“健骨胶囊”对MC3T3-E1成骨细胞分化及增殖的影响。方法 制备健骨胶囊水提物,采用CCK-8法和细胞迁移实验检测健骨胶囊提取物对MC3T3-E1细胞增殖和细胞迁移的影响;茜素红染色检测MC3T3-E1细胞的矿化能力;实时荧光定量PCR检测成骨分化基因Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2、RASSF1A等mRNA表达水平;蛋白质印迹法Western blot检测Col1a1、Bcl2的蛋白表达水平。结果 通过实验结果比对得出,健骨胶囊提取物能促进MC3T3-E1细胞增殖、使细胞迁移率提高;同时健骨胶囊提取物组能明显提高MC3T3-E1细胞钙化能力(P＜0.01),促进Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2的mRNA表达(P＜0.05),上调Col1a1、Bcl2蛋白量的表达。结论 健骨胶囊能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖及细胞迁移能力,并通过上调成骨基因的表达水平如Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2等,提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。     

microRNA125a-3p对滋养层细胞功能的调控作用及机制

目的 观察microRNA125a-3p(miR-125a-3p)在滋养层细胞中的表达,探讨其对滋养层细胞增殖、侵袭和凋亡的调控及机制。方法 荧光实时定量PCR检测人滋养层细胞系HTR-8/SVneo、绒癌细胞系JAR和JEG-3中miR-125a-3p的表达情况。以HTR-8/SVneo和JEG-3细胞为实验对象,分为3组：空白对照组(CK组),未做任何处理;阴性对照组(NC组),转染NC-inhibitor;实验组(inhibitor组),转染miR-125a-3p inhibitor。以Transwell、流式细胞仪、CCK8法分别检测细胞的侵袭、凋亡及增殖能力。Western blot检测Fyn蛋白表达情况及ERK1/2、STAT3磷酸化水平。荧光实时定量PCR检测Fyn mRNA水平,免疫共沉淀法检测Fyn活性水平。结果 miR-125a-3p mRNA表达水平在HTR-8/SVneo、JAR和JEG-3细胞中依次降低,两两比较均有统计学差异(P<0.01)。抑制HTR-8/SVneo和JEG-3中miR-125a-3p后,细胞的凋亡水平明显降低,侵袭和增殖能力均明显升...     

miR-124-3p经Wnt通路因子Axin1调控骨髓间充质干细胞的研究

目的 探讨miR-124-3p经Wnt通路因子A(Axin1)对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分子靶向机制及调节BMSCs的成骨分化进而参与绝经后骨质疏松（PMOP）的形成。方法 收集20例股骨骨折需要手术并扩髓或暴露髓腔的患者,10例绝经后骨质疏松妇女（PMOP组）和10例非骨质疏松的绝经后妇女（对照组）,术中取骨髓组织3~5 mL,建立体外BMSCs细胞模型,用流式细胞仪检测BMSCs标志物,将BMSCs诱导分化为成骨细胞,RT-qPCR法检测miR-124-3p的表达。双荧光素酶报告基因系统检测miR-124-3p结合位点A-Axin1。构建miR-124-3p过表达载体,miR-124-3p过表达转染PMOP-BMSCs同时更换成骨诱导培养基进行成骨诱导培养。诱导第7、14、21 天 分别收集细胞进行检测碱性磷酸酯酶染色（ALP）和茜素红染色。成骨诱导第7天,RT-qPCR检测各组BMSCs中Runx2、Osterix靶因子Axin1的表达。Western Blotting检测miR-124-3p转染BMSCs后的表达与Axin1关系。结果 ①RT-qPCR法检测miR-124-3p的表达,PMOP组低于对照组。②miR-124-3p过表达转染、成骨诱导,随着诱导时间的延长,细胞培养液中ALP水平逐渐上升,茜素红染色可见结节沉积逐增加。③RT-qPCR检测成骨诱导第7天,Runx2和Osterix的表达,BMSC+成骨分化液组明显高于BMSC组,BMSC+过表达miR-124-3p组较其对照组明显上升;Axin1的表达,BMSC+成骨分化液组明显低于BMSC组,BMSC+过表达miR-124-3p组较其对照组显降低。④荧光素酶报告基因实验证明了miR-124-3p与Axin1的可结合性。⑤Western Blotting检测BMSCs,miR-124-3p过表达组Axin1表达显著下降,而miR-124-3p抑制组Axin1表达显著升高。结论 miR-124-3p可通过Wnt通路靶点Axin1调节BMSCs的成骨分化进而参与PMOP的形成。     

H_2O_2下调miR-21对MC3T3-E1细胞成骨分化影响的研究

目的探讨H_2O_2诱导的miR-21下调对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用及机制。方法取MC3T3-E1细胞系,培养传至第7代进行实验。取MC3T3-E1细胞,以不同浓度H_2O_2(0、40、80、160、320μmol/L)培养,经实时荧光定量PCR检测miR-21表达、MTS法检测细胞活性,选择H_2O_2最合适实验浓度。取MC3T3-E1细胞分为空白对照组(A组)、H_2O_2组(B组)、成骨诱导组(C组)、H_2O_2+成骨诱导组(D组),对应培养后实时荧光定量PCR检测miR-21表达以及成骨标志基因Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠalpha 1,Col1a1)表达,Western blot检测磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)蛋白表达,茜素红染色观察细胞外钙基质沉积情况,分析H_2O_2对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。然后再取MC3T3-E1细胞,分为H_2O_2组(A1组)、H_2O_2+成骨诱导组(B1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂+成骨诱导组(C1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂阴性对照+成骨诱导组(D1组);以及H_2O_2组(A2组)、H_2O_2+成骨诱导组(B2组)、H_2O_2+ siRNA-PTEN阴性对照+成骨诱导组(C2组)、H_2O_2+siRNA-PTEN+成骨诱导组(D2组);对应培养后检测成骨标志基因(Runx2、OPN、Col1a1)表达以及细胞外钙基质沉积情况,分析下调miR-21或沉默PTEN对细胞成骨分化的影响。结果结合实时荧光定量PCR检测以及MTS法结果,选择160μmol/L H_2O_2进行实验。第1、2周B组miR-21相对表达量低于A组(P0.05),D组低于C组(P0.05);第2周C组PTEN蛋白相对表达量均低于A、D组(P0.05);第1、2周D组Runx2、OPN及Col1a1 mRNA相对表达量均低于C组(P0.05),茜素红染色显示D组钙基质沉积少于C组。C1组PTEN蛋白相对表达量高于D1组(P0.05);第1、2周B1、D1组Runx2、OPN mRNA相对表达量均高于C1组(P0.05),第2周B1、D1组Col1a1 mRNA均高于C1组(P0.05);茜素红染色显示C1组钙基质沉积少于B1、D1组。第1周D2组OPN、Col1a1 mRNA相对表达量高于B2、C2组(P0.05),第3周茜素红染色显示D2组钙基质沉积明显多于B2、C2组。结论 H_2O_2抑制MC3T3-E1成骨分化可能与miR-21下调有关。