人CD13基因克隆及其基因转染细胞株的构建

目的 克隆人CD13全长cDNA,构建稳定表达人CD13 分子的基因转染细胞株.方法 提取人外周血单个核细胞总RNA,通过RT-PCR 克隆人CD13基因,将人CD13基因重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term.将重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD13 和辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,收集含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞,筛选获得Zeocin抗性的基因转染细胞.结果 成功克隆人CD13基因和构建逆转录病毒载体pEGZ-Term/ CD13,并成功获得稳定表达人CD13的基因转染细胞株L929/CD13.结论 成功克隆了人CD13基因及其逆转录表达载体,成功制备了稳定表达人CD13的基因转染细胞株,为研究CD13生物学功能奠定了基础.     

应用腺病毒载体介导RNA干扰技术构建糖皮质激素受体基因阻断的人U937巨噬细胞模型

目的:利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术,建立糖皮质激素受体基因阻断的人U937巨噬细胞模型。方法:实验于2004-06/2005-05在解放军第三军医大学新桥医院呼吸研究所实验室完成。将针对糖皮质激素受体发挥RNA干扰效应的合成寡核苷酸序列连入含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒穿梭质粒pRNAT-H1.1/Adeno中,在含有pAdEasy-1病毒骨架的BJ5183大肠杆菌内进行同源重组;重组子通过脂质体介导转染293T细胞,并在293T细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒,通过反复感染扩增病毒以达到感染靶细胞的适当滴度,通过绿色荧光表达来监控腺病毒扩增;应用Westernblot法检测U937巨噬细胞感染后糖皮质激素受体蛋白的表达。结果:转染腺病毒载体的293T细胞表达绿色荧光,随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增,病毒达到合适的滴度。受腺病毒感染的U937巨噬细胞内糖皮质激素受体蛋白表达明显降低。结论:可以成功构建针对糖皮质激素受体基因的RNA干扰腺病毒载体。     

ShRNA靶向沉默VEGFR1基因对U937细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的 探讨慢病毒载体介导shRNA(short harpin RNA,siRNA前体)靶向沉默血管内皮生长因子受体1(VEGFR-1)基因对U937细胞增殖、迁移和凋亡的影响.方法 构建针对VEGFR-1基因干扰序列和无关序列的shRNA慢病毒载体,与慢病毒包装质粒通过脂质体转染293T细胞,包装产生的病毒液感染U937细胞(U937-shVEGFR-1 KD组).采用实时荧光定量PCR、Western blot法检测RNA干扰对U937细胞VEGFR-1 mRNA和蛋白表达的影响;ELISA法检测细胞培养上清液VEGF表达水平的变化;CCK-8法检测常规培养条件下和不同浓度阿糖胞苷(Ara-C)作用下细胞增殖率和抑制率变化;流式细胞术检测经Ara-C作用后细胞凋亡率变化;Transwell小室检测不同条件下细胞迁移数量的变化.结果 成功构建VEGFR-1基因shRNA慢病毒载体,转染U937细胞后,U937-shVEGFR-1 KD组细胞VEGFR-1 mRNA和蛋白表达均显著下降;细胞培养上清液VEGF表达水平明显下降,细胞增殖速度减慢;Ara-C作用下,U937-shVEGFR-1 KD组细胞增殖抑制率及凋亡率较U937无关序列shRNA阴性对照(NC)组和U937空白对照(CON)组细胞明显增高.无药物及VEGF作用下,U937-shVEGFR-1 KD组细胞迁移数量均低于U937 NC组和U937 CON组细胞;Bevacizumab作用下,U937 NC组和U937 CON组细胞迁移数量降低,而U937-shVEGFR-1 KD组细胞迁移数量无明显变化.结论 慢病毒载体介导的shRNA干扰VEGFR-1基因可有效抑制U937细胞增殖、迁移,并能够增强U937细胞对Ara-C的敏感性.     

应用腺病毒载体介导RNA干扰技术构建糖皮质激素受体基因阻断的人U937巨噬细胞模型

目的：利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术，建立糖皮质激素受体基因阻断的人U937巨噬细胞模型。 方法：实验于2004-06／2005-05在解放军第三军医大学新褫医院呼吸研究所实验室完成。将针对糖皮质激素受体发挥RNA干扰效应的合成寡核苷酸序列连入含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒穿梭质粒pRNAT-H1.1／Adeno中，在含有pAdEasy-1病毒骨架的BJ5183大肠杆菌内进行同源重组；重组予通过脂质体介导转染293T细胞，并在293T细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒，通过反复感染扩增病毒以达到感染靶细胞的适当滴度，通过绿色荧光表达来监控腺病毒扩增；应用Western blot法检测U937巨噬细胞感染后糖皮质激素受体蛋白的表达。 结果：转染腺病毒载体的293T细胞表达绿色荧光，随着时间逐渐增强，并且出现明显的细胞病变效应，经过3轮扩增，病毒达到合适的滴度。受腺病毒感染的U937巨噬细胞内糖皮质激素受体蛋白表达明显降低。 结论：可以成功构建针对糖皮质激素受体基因的RNA干扰腺病毒载体。     

基因治疗成骨肉瘤的探索：人成骨肉瘤细胞CD147基因编码区克隆和反义RNA表达质粒构建

目的:构建CD147反义RNA表达质粒载体,探索治疗骨肉瘤侵袭和转移的新方法.方法:实验于2004-05在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所实施,以人成骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板,采用反转录聚合酶链反应方法得到人CD147的编码区cDNA,用DNA重组技术将人CD147编码区基因反向克隆到真核表达质粒PcDNA3.1( )中,构建成CD147反义RNA表达质粒PcDNAasCD147.用阳离子脂质体介导转染人成骨肉瘤细胞系MG63,经G418筛选后获得的克隆进行鉴定. 结果:CD147反义RNA表达质粒载体PcDNAasCD147经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确.免疫组化SP法染色证实:转染细胞MG63/PcDNAasCD147,与亲本细胞相比,CD147的表达明显下降.结论:成功地从人成骨肉瘤细胞中克隆出CD147编码区基因,构建了CD147反义RNA表达质粒载体PcDNAas CD147,此实验结果为进一步研究CD147蛋白分子的生物学功能以及为成骨肉瘤的基因治疗研究奠定了基础.     

mdr-1和DHFR双基因共转染人CD34+细胞拓宽造血细胞耐药谱的体外研究

目的　探讨将多药耐药基因 (mdr 1)和二氢叶酸还原酶基因 (DHFR)同时导入人CD3 4 细胞 ,以拓宽造血细胞耐药谱 ,改善骨髓耐受联合化疗的可行性。方法　将以造血细胞中高表达的逆转录病毒载体FMCF为基本结构骨架 ,通过引入IRES序列构建获得含mdr 1和DHFR(L2 2Y)双耐药基因的逆转录病毒载体pSF DIM ,通过脂质体介导包装 ,单嗜性和双嗜性包装细胞上清交叉感染提高病毒滴度。低温离心病毒上清转染人脐血CD3 4 细胞 ,用流式细胞仪检测P gp的表达 ,基因组PCR检测外源性耐药基因的整合 ,CFU GM培养观察耐药性变化。结果　逆转录病毒载体pSF DIM转导人脐血CD3 4 细胞后 ,P gp的表达较未转基因组增加了 10 .98% ;基因组PCR同时检测到两种外源性耐药基因的整合 ;与未转基因组比较 ,在 48nmol/L甲氨蝶呤和 10ng/ml及 12ng/ml紫杉醇 (商品名Taxol)浓度水平 ,CFU GM集落形成显著增加 (P <0 .0 5 )。结论　重组双耐药基因逆转录病毒载体pSF DIM可以有效介导mdr 1和DHFR双耐药基因进入人脐血CD3 4 细胞并且获得共表达 ,拓宽了造血细胞耐药谱     

基因治疗成骨肉瘤的探索:人成骨肉瘤细胞CD147基因编码区克隆和反义RNA表达质粒构建

目的:构建CD147反义RNA表达质粒载体,探索治疗骨肉瘤侵袭和转移的新方法。方法:实验于2004-05在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所实施,以人成骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板,采用反转录聚合酶链反应方法得到人CD147的编码区cDNA,用DNA重组技术将人CD147编码区基因反向克隆到真核表达质粒PcDNA3.1(+)中,构建成CD147反义RNA表达质粒PcDNAasCD147。用阳离子脂质体介导转染人成骨肉瘤细胞系MG63,经G418筛选后获得的克隆进行鉴定。结果:CD147反义RNA表达质粒载体PcDNAasCD147经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。免疫组化SP法染色证实:转染细胞MG63/PcDNAasCD147,与亲本细胞相比,CD147的表达明显下降。结论:成功地从人成骨肉瘤细胞中克隆出CD147编码区基因,构建了CD147反义RNA表达质粒载体PcDNAasCD147,此实验结果为进一步研究CD147蛋白分子的生物学功能以及为成骨肉瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

稳定表达外源RbAp46基因的U937白血病细胞株的建立和初步特性分析

为建立RbAp46基因稳定转染的白血病细胞株，对悬浮培养的白血病细胞的电穿孔条件进行优化之后，运用电穿孔介导的转基因技术，在低电压、高电容的条件下将含RbAp46基因cDNA的表达质粒转染白血病细胞系U937，经G418筛选获得稳定转染的克隆，用PCR检测RbAp46基因的整合，用Western blot分析蛋白质的表达水平，然后筛选出表达外源RbAp46蛋白水平最高的亚克隆。用台盼蓝拒染法判定细胞活力，用细胞计数判定细胞生长速率。结果发现，转染RbAp46基因的U937细胞的生长速率比对照组低50％左右。结论：在白血病细胞系U937中建立了稳定表达外源RbAp46基因的细胞株，并发现过表达的外源RbAp46基因能抑制U937细胞的增殖。     

MHC-Ⅱ基因反义RNA导入脐血CD34^＋细胞抑制HLA-DR抗原的表达

将HLA-DRBI基因cDNA片段反向插入逆转录病毒质粒pZIP-neo SV(x)BamHI位点中,构建了HLA-DRB1基因的逆转录病毒反义RNA重组表达载体,用脂质体法导入PA317细胞。用免疫磁珠法分离、富集脐血CD34~ 细胞。将培养的病毒上清感染脐血CD34~ 细胞,筛选获得抗性克隆和进行CFU-GM的培养。用RT-PCR法从经G418选择产生的抗性克隆已证实有反义RNA目的基因的表达。流式细胞仪(FACS)检测转染的脐血细胞中HLA-DR抗原阳性率为28％(对照组为45％),其抑制率为38.2％。结果表明导入脐血细胞的MHC-Ⅱ类基因反义RNA重组体可降低其HLA-DR抗原的表达。本实验结果为用反义核酸技术在临床脐血移植中防止移植物抗宿主反应提供了新方法。     

融合蛋白AML1-ETO对C/EBPα基因表达的影响

背景:已有研究显示AML1-ETO可以通过包括抑制C/EBPα的功能在内的机制引起分化的阻滞。目的:观察AML1-ETO对髓系分化相关基因C/EBPα表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用。方法:应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937、U937-MOCK和U937-A/E1细胞表面抗原CD11b、CD14的表达;荧光实时定量PCR检测C/EBPαmRNA的表达;免疫印迹法检测C/EBPα蛋白的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与C/EBPα基因启动子之间直接的相互作用情况。结果与结论:AML1-ETO转染细胞的细胞表面分化抗原CD11b和CD14的表达明显下降,且转染了AML1-ETO的U937细胞系中,C/EBPα的mRNA与蛋白水平均下调,转染细胞沉淀富集的DNA中含有C/EBPα基因的启动子序列。结果提示C/EBPα是AML1-ETO的直接靶基因,AML1-ETO能下调C/EBPα的表达。     

FLT3配基基因在人骨髓基质细胞中的表达

目的 构建人FLT3配基（FL）逆转录病毒载体，并观察其在人骨髓基质细胞中的表达。方法 用基因重组技术，将FLcDNA插入逆转录病毒载体pLXIN，获得重组载体pLFIN。采用脂质体法将重组质粒pLFIN转染包装细胞PA317，G418筛选抗性克隆，用抗性克隆上清液感染人骨髓基质细胞，RT-PCR和基因组DNA-PCR检测外源基因mRNA的转录及染色体的整合，ELISA法和小鼠CFU-GM集落形成法检测FL蛋白表达量和生物学活性。结果 酶切鉴定表明成功构重组逆转录病毒载体pLFIN；染色体基因组中整合有外源基因FL和Neo；在mRNA和蛋白质水平均可检测到FL表达；24hFL蛋白表达量为4.35ng/ml，活性测试结果显示转染的骨髓基质细胞分泌FL。结论 逆转录病毒介导的FL在骨髓基质细胞中获得表达，并具有良好的生物学活性，为进一步研究转基因骨髓基质细胞对造血调控的影响提供了实验依据。     

逆转录病毒双顺反子策略有效转导和共表达ALDH1基因与mdr1基因的研究

目的研究含内在核糖体进入位点(IRES) 的逆转录病毒双顺反子载体介导的醛脱氢酶基因(ALDH1)与多药耐药基因(mdr1)转导和共表达.方法以携带ALDH1与mdr1基因的重组逆转录病毒双顺反子G1Na-ALDH1-IRES-mdr1(G1Na-AIM)为载体,电穿孔法转导双嗜型包装细胞PA317,长春新碱筛选;所得病毒生产细胞PA317/ AIM与单嗜型包装细胞GP+E86乒乓感染提高病毒滴度;以重组病毒上清转染K562细胞,应用聚合酶链反应(PCR)和Southern blot检测转移基因的整合,流式细胞术(FCM)及MTT分析基因表达,集落培养法测定转导效率.结果双嗜型病毒上清滴度达1.0×105cfu/ml.基因修饰细胞K562/ AIM经PCR 和Southern blot证实双基因稳定整合至基因组,对4-氢过氧化环磷酰胺(4-HC)及长春新碱(VCR)耐药 (提高3～10倍),FCM及集落法检测基因转导效率为62%～70%.结论逆转录病毒IRES双顺反子载体能引导不同类型的耐药基因有效共表达,可用于扩大耐药范围,进行体内显性选择.     

HLA—DR基因反义RNA导入脐血干／祖细胞对HLA—DR抗原表达的影响

目的：探讨组织相容性抗原Ⅱ类（ＭＨＣ－Ⅱ）基因反义ＲＮＡ是否可调控脐血细胞ＭＨＣ－Ⅱ类基因的表达及降低脐血细胞的免疫原性和脐血细胞移植时发生移植物抗宿主反应（ＧＶＨＲ）的程度。方法：应用分子克隆技术构建了含人ＨＬＡ－ＤＲβ基因的逆转录病毒表达载体，经过狭缝杂交、电泳、酶切分析鉴定，获得了ＨＬＡ－ＤＲβ基因反义ＲＮＡ重组体，用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（脂质体）将重组体导入包装细胞ＰＡ３１７。结果：产重组病毒的细胞ＰＡ３１７的病毒滴度可达１×１０５ｃｆｕ／ｍｌ。用逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）可从转染的脐血干细胞中扩增出ＤＲ－β基因ｃＤＮＡ，说明反义ＲＮＡ重组体目的基因已有效表达。用流式细胞仪测定转染的脐血细胞ＨＬＡ－ＤＲ抗原阳性细胞率为２８％（对照组为４５％），其抑制率为３８．２％。结论：导入脐血干细胞的ＨＬＡ－ＤＲ基因反义ＲＮＡ重组体成功地降低了其ＨＬＡ－ＤＲ抗原的表达程度，为临床上降低脐血移植的ＧＶＨＲ提供了理论依据和实验基础。     

Targeted and highly efficient gene transfer into CD4+ cells by a recombinant human immunodeficiency virus retroviral vector.

We have established a recombinant HIV gene transfer system based on transient expression of the HIV packaging functions and a recombinant vector genome in monkey kidney Cos cells. The recombinant HIV retroviral vector introduced the neoR gene into CD4+ cells with high efficiency, comparable to that achieved with the highest titer amphotropic murine recombinant retrovirus. Vector preparations were devoid of replication competent, infectious HIV. Gene transfer was dependent on CD4 expression, as shown by expression of the CD4 gene in HeLa cells, and could be inhibited by soluble CD4. This specific and efficient gene transfer system may be useful for development of gene therapy for which T cells are the desired targets.     

流式细胞术结合G418筛选重组质粒稳定转染细胞

目的:探索优化重组质粒转染细胞后的筛选方法,以得到高纯度U937转染细胞。方法:选择带Neor及GFP基因的质粒pRNATU6.1/Neo。根据流式细胞仪可分选GFP阳性细胞这一特点,在质粒转染细胞后比较单用G418筛选与合并使用流式细胞仪分选后的筛选效果。结果:单用G418筛选时最高筛选效率为72.0%;合并使用G418及流式细胞仪分选后的筛选效率均在90.0%以上。结论:合并使用G418及流式细胞仪分选是一种高效的筛选方法。     

利用基因芯片分析RNA干扰PNAS-2后凋亡相关基因表达的变化

目的:采用基因芯片技术,比较RNA干扰法封闭U937细胞中PNAS-2基因前后,与凋亡有关基因的变化情况,从而了解PNAS-2在凋亡通路中的可能定位。方法:将急性单核细胞白血病细胞株U937分别转染已构建的靶向封闭PNAS-2的干扰质粒组和对照质粒组,合并使用流式细胞仪(FCM)筛选出GFP阳性细胞,并运用半定量PCR及实时PCR方法验证RNAi效果。采用affymetrix u133A 2.0基因芯片技术比较2组细胞间基因表达的差异。进一步通过半定量RT-PCR对其中的2条上调基因(IER3、CCL2)和6条下调基因(CASP8、CD74、VEGF、DNASE2、PRTN3、TERT)的表达情况进行验证。结果:半定量及实时PCR检测结果表明,合并使用G418及FCM筛选后得到的转染细胞在90%以上,干扰质粒组对PNAS-2的抑制率达到70%以上;基因芯片筛选结果提示共有1651条出现上调,1404条出现下调。其中比值≥2倍的基因共有336条,上调114条,下调222条。根据功能分类初步筛选出与凋亡相关基因共22条,上调基因11条,下调基因11条。RT-PCR检测证实基因芯片结果可靠。结论:抑制PNAS-2表达后促进U937细胞凋亡的机制可能与c-Jun过表达、JNK通路的激活及VEGF基因下调有关。     

Retargeting of viral vectors to the folate receptor endocytic pathway.

Viral vectors with high transfection efficiencies are not always those with optimal target cell binding specificities. As a consequence, virus pseudotyping has been developed to endow transfection competent viruses with improved cell binding specificities and affinities. We have hypothesized that chemical conjugation of a virus to a cell specific ligand might also alter its target cell specificity and produce a virus that would transfect only the desired cell type. To test this concept, an ecotropic replication-defective myeloproliferative sarcoma retrovirus and an amphotropic murine adenovirus containing the gene for beta-galactosidase were chemically derivatized with folic acid. As expected from its strong ecotropism, the unmodified retrovirus did not induce beta-galactosidase expression in nonhost KB cells, while the amphotropic adenovirus yielded high levels of gene expression in the same cell line. Surprisingly, although folate derivatization enabled avid binding of both viruses to folate receptor expressing KB cells, the folate conjugation did not promote retroviral gene expression and actually prevented the normal beta-galactosidase expression seen with the adenoviral vector. The fact that co-administration of excess free folic acid to block uptake by folate receptor-mediated endocytosis restored adenoviral gene expression to the level obtained with unmodified virus suggests that folate derivatization per se does not hamper viral activity. We, therefore, conclude that neither retroviral nor adenoviral delivery via the folate endocytosis pathway is compatible with viral gene expression in KB cells.     

Envelope fusion protein binding studies in an inducible model of retrovirus receptor expression and in CD34(+) cells emphasize limited transduction at low receptor levels

Successful gene therapy for the treatment of heritable or acquired diseases typically requires high efficiency gene transfer and sustained transgene expression. Indirect evidence on the basis of RNA analysis and in vivo competitive repopulation experiments in animal models suggests a correlation between transduction efficiency and the abundance of retrovirus receptors on the hematopoietic target cell. However, transduction by oncoretroviral vectors is also subject to other factors such as target cell cycle status and the composition of the virus-containing medium, making it difficult to determine the level of receptor expression required for efficient transduction. In the present study we investigated the impact of receptor expression level on transduction by a vector with a gibbon ape leukemia virus (GALV) envelope protein in a tetracycline-inducible tissue culture model that allowed for the cell cycle-independent, regulated expression of the GALV receptor (Pit1) in otherwise non-susceptible NIH 3T3 cells. Up-regulation of receptor RNA expression by 4.5-fold resulted in a mean 150-fold increase in transduction efficiency. We then analyzed cell surface expression of the Pit1 receptor using a fusion protein consisting of GALV SU portion of the viral envelope protein linked to the human IgG Fc. These experiments showed that tetracycline-regulated receptor induction resulted in a dose-dependent increase in binding of fusion protein. At maximum induction fusion protein binding increased up to five-fold which paralleled the increase in RNA expression, and correlated with the improved transduction efficiency. Finally, studies of pseudotype-specific fusion protein binding to human CD34-enriched cells revealed increased expression of retrovirus receptors after cytokine stimulation, although overall receptor expression in CD34(+)cells remained lower than in fibroblast cell lines efficiently transduced by amphotropic and GALV vectors.     

VEGF反义RNA促骨髓瘤细胞凋亡及抑制内皮细胞形成血管作用的体外研究

本研究探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）反义RNA对人多发性骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡及内皮细胞ECV304体外血管形成的影响和以VEGF反义RNA进行多发性骨髓瘤（MM）基因治疗的可行性。将VEGF121反向克隆入真核表达质粒pIRES2-EGFP构建重组质粒AS-VEGF，酶切、测序鉴定。用此真核表达重组质粒转染人骨髓瘤细胞系U266，G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR、Westernblot法分别检测阳性克隆中VEGFmRNA和蛋白的表达；利用MTT法、流式细胞术检测转染细胞增殖、凋亡的变化；利用基质胶中内皮细胞ECV304的网络形成检测血管形成。结果表明：获得了携带反义VEGF基因的真核表达重组质粒AS-VEGF；VEGF121反义RNA部分阻断了U266细胞中VEGF的表达，转染重组质粒的U266细胞VEGFmRNA和蛋白表达都较对照组细胞有明显减少，细胞的增殖受到抑制，凋亡增加。转染重组质粒的细胞培养上清在基质胶中作用ECV304细胞后的血管形成较对照组亦有明显减少。结论：VEGF反义RNA可以下调VEGF表达，从而抑制骨髓瘤细胞系U266增殖，增加其凋亡并抑制血管形成。