多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立

目的参考AIV M基因和HA基因序列,设计了两对引物。其中XZ145-2和XZ146为通用引物,可以检测所有亚型AIV,跨幅244 bp;XZ H9-1和XZ H9-2为H9亚型特异性引物,跨幅488 bp。方法利用这两对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。结果与结论特异性和敏感性试验结果表明,该技术对H9亚型AIV同时扩增出两条大小分别为244 bp和488 bp的cDNA片段,对其他亚型AIV只扩增出244bp的cDNA片段,对其他常见禽病病原无特异性扩增,结果为阴性;该多重RT-PCR的通用引物对AIV RNA的最低检出量为1pg,对H9亚型RNA的最低检出量为10 pg。     

多重反转录聚合酶链反应检测H5亚型禽流感病毒方法的建立

目的根据A型AIV的M基因和HA基因序列,设计了两对引物。其中XZ145-2和XZ146为通用引物,可检测所有A型AIV,跨幅为244bp;XZH5-1和XZH5-5为H5亚型AIV特异性引物,跨幅为860bp。通过对多重RTPCR扩增条件的优化,建立了快速检测鉴别H5亚型AIV多重RTPCR。该多重RTPCR对H5亚型AIV同时扩增出两条大小分别为244bp和860bp的cDNA片段,对其他A型AIV只扩增出244bp的cDNA片段,对其它常见禽病病原则无244bp和860bpcDNA片段出现。该多重RTPCR对H5亚型AIVRNA最低检出量为10pg。该多重RTPCR对AIV人工感染鸡临床样品和鸡胚分离物进行检测,结果其检出率为100%。     

乙脑病毒嵌套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的　建立适用于检测人用猪源性生物制品中外源性乙脑病毒(JEV)的嵌套式RT- PCR方法。方法　根据已公布的JEV序列(GenBank登录号为M5 5 5 0 6 ) ,设计合成两对引物,对JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞抽提RNA进行RT PCR和RT nestedPCR ,将PCR产物进行了克隆测序;同时对猪细小病毒(PPV)、猴空泡病毒4 0 (SV4 0 )及正常乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞提取核酸进行PCR ,并对2 10份临床样品进行了检测。结果　PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞均扩增出10 15bp和6 2 2bp目的基因片段,而PPV、SV4 0及未感染JEV的乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞均未见特异性扩增条带,2 10份猪组织样品中未检出阳性样品。RT nestedPCR检测的最低限度为10PFU病毒。从样品核酸的提取到PCR扩增及检测结果的报告可在8小时内完成。结论　本研究建立的RT NestedPCR方法具有快速、特异、敏感、可靠的特点,可用于人用猪源性生物制品中外源性JEV的污染检测。     

红细胞富集与多重RT-PCR联合检测禽流感病毒

目的对禽流感病毒H5、H7亚型进行更快速、更灵敏检测。方法根据禽流感病毒(AIV)核蛋白基因和血凝素基因设计3对特异性引物,建立在结合红细胞富集AIV病毒的基础上进行多重RT-PCR检测方法。结果该方法在1个反应体系中不仅能够鉴定A型流感病毒,而且可以同时确定是否为H5和H7亚型AIV;该方法的检测下限可达2.5pg的病毒RNA;对于参考毒株都可以扩增出预期大小的基因片段,而对新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的平行对照结果均呈阴性。结合AIV能够吸附鸡红细胞并在一定条件下解离的特点,利用鸡红细胞对48份已确诊样品进行病毒富集,然后用建立的多重RT-PCR方法检测富集产物结果显示48个样品中,30个为H5亚型AIV阳性,与病毒分离结果完全一致。结论由以上结果初步表明本研究建立的检测方法快速,特异,在禽流感临床筛检中显示出良好的应用前景。     

H9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

目的根据环介导等温扩增技术（LAMP）,建立了一种适用于H9亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）快速检测方法。方法根据GenBank中的H9亚型AIV血凝素（HA）基因序列,在保守区设计了一套针对HA基因8个区域的6条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果结果表明该方法对H3、H5、H7亚型AIV及其它禽呼吸道病原体均无扩增反应,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化观察;扩增反应只需要在常规水浴锅中进行,50min之内可完成反应;该方法对H9亚型AIV RNA的最小检测限为0.01pg,灵敏度是一步法RT-PCR方法的1 000倍。结论本研究建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行H9亚型AIV的快速检测。     

H7N9亚型禽流感病毒研究进展

H7N9亚型禽流感病毒(H7N9 AIV)是危害家禽养殖的主要病原体之一,其不仅制约家禽养殖业的健康发展,而且表现出对人类较强的传染性和较高的致死率,严重威胁公共卫生安全。2013年我国首次报道人类感染H7N9 AIV事件,病毒溯源发现家禽体内存在H7N9 AIV,但无明显症状。2017年,H7N9 AIV出现变异株,表现出对家禽的高致病性,随后我国推出H5/H7二价苗,并在全国实施家禽强制免疫接种,有效控制了H7N9 AIV在我国家禽中的流行以及人类感染事件的发生,成为我国控制人兽共患传染病的成功案例。由于我国家禽养殖和AIV的复杂性,全面和持续的流行病学监测对于H7N9禽流感的防控仍然至关重要。本文针对2013年至今H7N9 AIV的流行特征、遗传变异特点及疫苗研究等内容作简要论述,以期为禽流感的预防和控制提供参考。     

禽流感病毒H1、H3、H5、N2亚型多重RT-PCR检测方法的初步研究

目的根据禽流感病毒H1、H3、H5亚型的HA基因和N2型NA基因的保守序列,设计出四对RT-PCR引物,建立一步法多重RT-PCR对禽流感H1、H3、H5、N2四亚型进行快速检测。方法利用所设计的四对引物,通过对该方法扩增条件的优化,成功建立快速检测禽流感病毒H1、H3、H5、N2四亚型的一步法多重RT-PCR。利用禽流感H1、H3、H5、N2四亚型毒株和其它相关标准毒株进行敏感性和特异性试验。结果与结论所建立的一步法多重RT-PCR具有较高的特异性和敏感性,与禽流感其它亚型和NDV、IBV、ARV?IBDV的核酸均无交叉反应。用该方法检测现场样品395份(4省20多个地区),结果与经典检测方法一致。     

RT-PCR技术在流行性出血热病毒分型诊断中的应用

目的　运用逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)技术对流行性出血热 (EHF)病人标本进行研究 ,以建立一项有效的 EHF病毒分型诊断方法。方法　收集发病 10 d以内的早期 EHF病人血浆、外周血单个核细胞 (PBMC)、尿沉淀细胞。采用异硫氰酸胍 -酚 -氯仿一步抽提各种标本的总RNA。两对特异性引物分别互补于汉滩病毒 ( 型 )及汉城病毒 ( 型 ) M基因片段的 G1区。分别在两对引物的正链引导下反转录合成特异性 c DNA,用相应的引物对进行 PCR扩增。产物经琼脂电泳 ,标准分子量对照鉴定。同时以 Vero- E6细胞及鼠脑传代的标准病毒株进行阳性对照 ,以正常人血浆作阴性对照。结果　 19例病人的 30份标本均能被 I型或 型引物扩增出特异性产物 ,其中I型阳性 13例 , 型阳性 4例 ,I、 型同时阳性 2例 ,同一病人的不同标本结果一致。结论　标准病毒株 RT- PCR分型结果与其本身的血清型一致     

集合HIV RNA RT-PCR方法在高危人群中窗口期检测的应用

探讨使用集合艾滋病病毒(HIV)核糖核酸(RNA)反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,对高危人群窗口期进行检测。方法采用50∶1(一级pools)、10∶1(二级pools)、1∶1(单个样本)三级集合HIV RNA,用RT-PCR方法进行样本检测。结果检测的3 904份HIV抗体阴性样本中,检出8份样本的病毒载量高于检测线。结论提示该集合方法对于大样本量的阴性样本筛查还是具有可操作性的。     

多重聚合酶链反应和反向线性点杂交技术在常见呼吸道病毒检测中的应用

目的应用多重聚合酶链反应（mPCR）扩增基因技术和反向线性点杂交技术（RLB）相结合的方法从基因水平建立常见呼吸道病毒的检测方法。方法根据常见的7种呼吸道病毒包括流感病毒A,副流感病毒1、2、3型,腺病毒1型,呼吸道合胞病毒A、B型的特点设计特异性的引物和探针,应用mPCR/RLB技术对常见的7种病毒株进行检测,建立研究方法。结果使用特异性引物对7种病毒株的基因进行mPCR,均得到相应的目标扩增产物,扩增条带清晰,与目标片段一致。7种病毒株的PCR产物与特异性探针杂交,均可得到清晰的杂交模式,并且彼此之间没有交叉反应,与作为阳性对照的细菌标准菌株亦没有交叉反应。结论 mPCR和RLB相结合是从基因水平检测常见呼吸道病毒的方法 。     

鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡转录组学分析

目的 为了分析鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡后宿主基因表达水平的变化。方法 以鸭源H7N9亚型禽流感病毒感染SPF鸡,收集肺脏进行高通量测序。结果 与对照组相比,感染组得到差异表达基因740个,其中上调基因有602个,下调基因有138个。GO条目分析发现,差异基因主要涉及免疫应答反应和炎症反应等。经KEGG 数据库比对注释及富集分析显示有7个通路富集显著,其中Toll-like信号通路有11个基因表达上调,分别为IL-6、TLR4、PIK3、IRF7、MD-2、IRF5、MYD88、CD86、STAT1、TLR2和CCL4,NOD-like受体信号通路有7个基因表达上调,分别为IRF7、CTSB、P2RX7、CYBB、PSTPIP1、HSP90AA1和NAMPT。结论 鸭源H7N9亚型病毒感染SPF鸡后,免疫相关基因表达明显增强。在Toll-like信号通路中, TLR4在MD-2的协助下被激活,随后依赖MYD88途径激活下游的IRF5,继而引起CCL4、IL-6显著表达。同时NLRP3炎症体在H7N9亚型病毒感染过程中也发挥着重要作用。