PCNA的shRNA对子宫颈癌细胞的抑制研究

目的:构建增殖细胞抗原(PCNA)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在HeLa细胞表达,同时观察PCNA的shRNA对人HeLa细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法:将PCNA的cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil1,构建真核表达质粒pGenesil1PCNA14,并通过酶切和测序等方法进行鉴定,将真核表达质粒pGenesil1PCNA14转染子宫颈癌细胞,运用Westernblot检测PCNA的蛋白表达,流式细胞仪分析细胞周期变化。结果:PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,阻滞细胞G0/G1S期,PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论:PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现,实验结果为进一步研究PCNA的shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。     

自噬基因Beclin 1 shRNA表达质粒的构建及其对宫颈癌细胞HeLa生长的作用

目的 构建自噬基因Beclin 1小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,探讨Beclin 1抑制后对宫颈癌HeLa细胞生长的作用.方法 根据人Beclin 1 mRNA编码序列,设计RNA干扰靶点,构建Beclin 1 shRNA表达质粒,脂质体法转染人宫颈癌HeLa细胞,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot检测其对HeLa细胞自噬基因Beclin 1 mRNA及蛋白表达的影响.MTT法分析其对细胞增殖、流式细胞仪检测其对细胞周期和细胞凋亡的影响.结果 构建的shRNA表达载体可以使HeLa细胞中自噬基因Beclin 1的mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度加快,凋亡率降低.结论 成功构建了针对自噬基因Beclin 1的shRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中Beclin 1的表达,并促进细胞生长,抑制凋亡.     

靶向增强绿色荧光蛋白shRNA的真核表达载体构建

目的构建针对增强绿色荧光蛋白（EGFP）的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6。方法设计并合成针对EGFP的shRNA DNA片段,退火后连接到真核表达载体pGenesil-1上,通过测序证实载体构建成功;用脂质体将构建正确的质粒转染到中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中,72 h后在荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果测序证实针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6构建正确;荧光显微镜下观察转染pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6质粒的CHO细胞中,荧光明显减少。结论针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6能明显干扰EGFP的表达。     

CHK1 shRNA对HeLa细胞凋亡和细胞周期的影响

目的 采用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术沉默CHK1基因的表达,观察其对高表达CHK1的宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖、凋亡的影响.方法 构建针对CHK1的短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA)真核表达质粒,将该质粒通过脂质体转染法导入HeLa细胞,以RT-PCR和Western blot法分别检测其CHK1基因和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化,MTT法检测细胞的增殖.结果 shRNA能明显降低HeLa细胞表面CHK1的表达,与对照组和空载体转染组相比, shRNA转染组HeLa细胞CHK1 mRNA水平下降了66%,蛋白水平下降了60%(P<0.05).此外,shRNA转染组的HeLa细胞凋亡率明显增加,增殖活性明显降低, 而且G2/M期细胞百分率显著下降.对照组、空载体转染组和shRNA转染组的G2/M期细胞百分率分别为(53.96±1.35)%、(54.08±1.39)%和(15.10±0.87)%(P<0.05).结论 CHK1shRNA能明显增加HeLa细胞的凋亡,抑制该细胞的增殖,削弱其G2/M期阻滞,为进一步研究CHK1在肿瘤治疗中的作用机制提供实验基础.     

新基因PCIA1真核表达载体的构建及HeLa细胞稳定转染株的建立与鉴定

目的构建人的新基因（PCIA1）的真核表达载体,并将其载体稳定转染到HeLa细胞株中。方法以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）总RNA为模板,通过RT—PCR扩增PCIA1基因编码区eDNA,并将扩增的eDNA片段插入peDNA3．1（＋）真核表达质粒,构建重组质粒peDNA—PCIA1,重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将该表达载体导人到HeLa细胞中,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,用RT-PCR和Westernblot检测PCIA1基因在HeLa细胞中的表达。结果经RT—PCR及Westernblot检测,证实真核表达重组质粒peDNA-PCIA1构建成功,PCIA1基因已经稳定转染到了HeLa细胞中并表达PCIA1蛋白。结论成功建立了人新基因PCIA1的稳定转染细胞株,为进一步研究PCIA1的功能奠定了基础。     

shRNA真核表达质粒介导的RNA干扰对人结肠癌LoVo细胞mTOR基因表达的抑制作用

目的探讨shRNA真核表达质粒介导的RNA干扰技术对人结肠癌LoVo细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因表达的抑制作用。方法合成编码shRNA的特异性DNA序列，连接到质粒pGenesil-1，采用脂质体Lipofectamine^TM 2000转染LoVo细胞，G418筛选4周。根据转染质粒的不同，实验分为3组：A组（正常对照组）为未转染的正常培养LoVo细胞，B组（阴性对照组）为转染pGenesil-1空载体质粒，C组（阳性实验组）为转染质粒pGenesil-1-mTOR。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测LoVo细胞mTOR基因mRNA表达，免疫印迹（Western blot）法检测mTOR蛋白表达。结果双酶切产物琼脂糖凝胶电泳显示，重组质粒pGenesil-1-mTOR和空载体质粒pGenesil-1分别切出一条410、350bp大小的片段。G418筛选的转染细胞在倒置荧光照相显微镜下可观察到绿色荧光。C组LoVo细胞mTOR基因mRNA表达水平明显低于A组（P〈0.05），表达抑制率为73．0％。C组LoVo细胞mTOR蛋白表达水平明显低于A组（P〈0．05），表达抑制率为72．5％。结论shRNA真核表达质粒介导的RNA干扰可明显抑制人结肠癌LoVo细胞mTOR基因表达。     

乙酰肝素酶shRNA双基因共表达真核载体的构建和筛选

目的：构建并筛选有效的、编码2条shRNA的乙酰肝素酶（Hpa）特异性基因真核表达载体．方法：分别设计、化学合成6对寡核苷酸单链,经退火、连接和磷酸化后得到Hpa shRNA双链,将两两随机问隔4～8个碱基后定向克隆入带有各自的U6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白（green fluoreseent protein,EGFP）基因和Neo基因的pGenesil-1中,构建3条含两段Hpa基因shRNA的pGenesil-1-Hpa—shRNA真核表达载体,转染卵巢癌细胞株SKOV3,流式细胞仪和荧光显微镜下观察转染效率,免疫组化分析Hpa蛋白表达．结果：酶切与测序证实pGenesil-1-HPSE—shRNA构建成功,无任何碱基突变,3组质粒转染细胞均有Hpa表达的变化,3种不同shRNA质粒转染细胞后Hpa蛋白表达有明显差别．结论：构建并筛选了针对Hpa特异性的双基因shRNA真核表达载体pGenesil-1-Hpa-shRNA．     

CENP-Ⅰ表达下调对HEK293细胞生长及染色体分离的影响

目的 构建CENP-Ⅰ特异性RNA干扰真核表达载体,体外观察抑制CENP-Ⅰ基因表达对HEK293细胞生长、细胞周期和染色体数目异常率的影响.方法 构建CENP-Ⅰ siRNA真核表达载体,脂质体法将pGenesil-1空载体和pGene-sil-1/CENP-I-siRNA-1、pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-2、pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-3真核表达载体分别导入人胚肾HEK293细胞.转染后24、48、72 h收集细胞用Western blot和FQ-PCR检测HEK293细胞内CENP-Ⅰ蛋白及mRNA水平的表达情况,以确定干扰效果及最佳干扰时间.MTT法检测各实验组细胞生长情况,流式细胞术检测各组细胞的细胞周期分布,Giemsa染色法计数细胞分裂指数,常规法制备染色体标本.结果 成功构建CENP-Ⅰ siRNA真核表达载体,筛选出具有干扰效果的质粒载体即pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-3,转染人胚肾HEK293细胞72 h后可使CENP-Ⅰ蛋白及mRNA表达显著下调.CENP-Ⅰ表达降低的HEK293细胞生长速度明显减慢(P<0.05),G2/M期细胞增加,分裂期细胞比例增大.结论 RNA干扰有效地特异性抑制着丝粒特异性蛋白质CENP-Ⅰ的表达.CENP-Ⅰ的抑制可使人胚肾HEK293细胞生长减慢,增殖能力减弱,使细胞分裂期延长.     

CENP-I表达下调对HEK293细胞生长及染色体分离的影响

目的 构建CENP-Ⅰ特异性RNA干扰真核表达载体,体外观察抑制CENP-Ⅰ基因表达对HEK293细胞生长、细胞周期和染色体数目异常率的影响.方法 构建CENP-Ⅰ siRNA真核表达载体,脂质体法将pGenesil-1空载体和pGene-sil-1/CENP-I-siRNA-1、pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-2、pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-3真核表达载体分别导入人胚肾HEK293细胞.转染后24、48、72 h收集细胞用Western blot和FQ-PCR检测HEK293细胞内CENP-Ⅰ蛋白及mRNA水平的表达情况,以确定干扰效果及最佳干扰时间.MTT法检测各实验组细胞生长情况,流式细胞术检测各组细胞的细胞周期分布,Giemsa染色法计数细胞分裂指数,常规法制备染色体标本.结果 成功构建CENP-Ⅰ siRNA真核表达载体,筛选出具有干扰效果的质粒载体即pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-3,转染人胚肾HEK293细胞72 h后可使CENP-Ⅰ蛋白及mRNA表达显著下调.CENP-Ⅰ表达降低的HEK293细胞生长速度明显减慢(P<0.05),G2/M期细胞增加,分裂期细胞比例增大.结论 RNA干扰有效地特异性抑制着丝粒特异性蛋白质CENP-Ⅰ的表达.CENP-Ⅰ的抑制可使人胚肾HEK293细胞生长减慢,增殖能力减弱,使细胞分裂期延长.     

RNA干扰抑制血管平滑肌细胞MT1-MMP基因表达的实验研究

目的 探讨膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)shRNA真核表达载体(pGenesil-1-MT1-MMP)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)MT1-MMP基因mRNA表达及蛋白表达的影响.方法 构建质粒表达载体pGenesil-1-MT1-MMP和pGenesil-1-HK;实验分为3组:空白对照组,阴性对照组(加入pGenesil-1-HK),RNA干扰(RNAi)组(加入pGenesil-1-MT1-MMP).用脂质体瞬时转染VSMC,48 h后通过荧光显微镜观察转染效果,流式细胞仪检测转染效率.于转染后72 h采用RT-PCR方法检测MT1-MMP mRNA表达水平,用Western blot方法检测MT1-MMP蛋白质表达水平.结果 瞬时转染VSMC 48 h后通过流式细胞仪检测转染效率高达85.5%,转染pGenesil-1-MT1-MMP质粒72 h后,RNAi组MT1-MMP mRNA及蛋白质水平明显下调(P<0.05).结论 靶向MT1-MMP的短发夹RNA质粒能够高效地转染入VSMC,并能有效下调MT1-MMP基因mRNA和蛋白的表达.     

ＰＩ３-Ｋ／Ａｋｔ ｓｈＲＮＡ真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建针对P13-K/Akt基因的特异性短发卡RNA(shRNA)真核表达载体.方法:用DNA重组技术将针对大P13-K/Akt基因不同位点所设计的8个shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中.在酶切分析及序列测定后,用脂质体染至大鼠肾小球系膜细胞(GMCs).Western blot检测蛋白的相对表达量来筛选最佳沉默效率的shRNA.结果:限制性酶切及酸序列分析证明重组质粒正确.Western blot证实在重组质粒中shPik3c3-2、shAktl-4具有最佳沉默效率.结论:成功构建了PK/Akt shRNA的真核表达质粒.该实验结果为进一步研究P13-K/Akt信号通路的生物学功能奠定了基础.     

Knocking-down of Nogo-A Gene Expression in PC12 Cell Line by Plasmid-based RNAi

To study the inhibitory effect of Nogo-A shRNA on cell line PC12, the Nogo-A shRNA （short hairpin RNA, or shRNA） was designed and synthesized. The annealed shRNA template was inserted into plasmid pGenesil-1 containing enhanced green fluorescent protein （EGFP） gene by gene cloning technique to generate eukaryotic expression vector. The recombinant plasmid was transfected into PC12 cells by lipofecamine2000 and the mRNA and protein expression level of Nogo-A gene was detected by RT-PCR and Western blotting 48 h after the transfection. Gene sequencing showed that that the Nogo-A shRNA eukaryotic expression vector was successfully constructed. No significant change was found in the Nogo-A mRNA and protein expression level in empty vector-transfected group as compared with controls （P〉0.05）, while the expression level in shRNA-transfected group decreased significantly （P〈0.05）. It is concluded that the pGenesil-1/Nogo-AshRNA recombinant plasmid can effectively suppress the expression of Nogo-A gene in PC12 cells.     

pGenesi1-1-EGFP-shRNA／survivin真核表达载体构建及其表达验证

目的构建用survivin启动子驱动增强绿色荧光蛋白（EGFP）的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA／survivin并验证其在宫颈癌Caski细胞中的表达。方法用有活性的survivin启动子取代pGenesil-1-EGFP-shRNA／U6载体中的u6启动子从而获得新的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP—shRNA／survivin;将pGenesil-1-EGFP-shRNA／survivin转染到宫颈癌Cash细胞及正常人脐静脉内皮HuVEC细胞,观察EGFP在两种细胞中的表达变化。结果成功构建pGenesil-1-EGFP-shRNA／survivin载体,分别转染Caski及HuVEC细咆,在Caski细胞中观察到较少的绿色荧光蛋白表达,而在HuVEC细胞中观察到较多的绿色荧光蛋白表达。结论survivin启动子能驱动shRNA在宫颈癌Caski细胞中特异性表达,而在正常HuVEC细胞中不表达。     

21.5kD MBP RNAi有效靶点的筛选及验证

目的:构建21.5 kD MBP基因干扰序列21.5 kD MBP-shRNA(21.5 kD MBP short hairpin RNA interference),筛选最佳沉默效果的21.5 kD MBP-shRNA真核表达载体,为21.5 kD MBP基因功能研究提供实验材料。方法:将21.5 kD MBP-shRNA阳性真核表达载体和阴性真核表达载体经脂质体介导分别转入人神经胶质瘤细胞株U251中,观察转染24 h后的转染效率;提取各组细胞总RNA,用实时荧光定量PCR技术检测各组21.5 kD MBP基因在mRNA水平的表达差异性。结果:21.5kD MBP-shRNA真核表达重组载体被成功转染入U251细胞,与阴性对照质粒(pGenesil-1-MBP-neg)转染组相比,沉默质粒转染组(pGenesil-1-MBP-1、pGenesil-1-MBP-2、pGenesil-1-MBP-3质粒分别转染)细胞中21.5 kD MBP mRNA表过水平均显著下降(P<0.05),其中pGenesil-1-MBP-3转染组细胞中21.5 kD MBP mRNA表达水平最低。结论:成功筛选出最佳沉默效果的21.5 kD MBP-shRNA真核表达载体,为21.5 kD MBP基因功能研究及基因治疗研究奠定了实验基础。