反义寡核苷酸对脑胶质瘤细胞生长抑制作用的动态研究

目的　探讨原癌基因 c- m yb反义寡核苷酸 (AON)对 C6脑胶质瘤细胞的体内生长抑制作用。方法　将 C6脑胶质瘤细胞接种于裸鼠皮下 ,当肿瘤长至 10 mm左右时随机分成 3组 (每组 12只 ) ,分别用 c- mybAON、正义寡核苷酸 (SON)和生理盐水瘤区原位注射 ,注药后 4、8、12和 16日各组处死动物 3只 ,动态观察肿瘤的体积、重量及病理学改变 ;用流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡 ;以免疫组化方法分析各组的 c- m yb、bcl- 2蛋白阳性表达率。结果　 c- myb AON组的肿瘤体积抑制率分别为第 4天 6 6 .7% ,第 8天 71.4% ,第 12天 72 % ,第 16天73% ,与对照组相比 ,其生长抑制作用具有显著性 (P<0 .0 5 ) ;AON组凋亡细胞百分率为第 4天 3.4% ,第 8天 2 7.1% ,第 12天 46 .1% ,第 16天 48.4% ,是 SON组和对照组相应时段凋亡细胞的 3.5倍以上 (P<0 .0 5 ) ;AON组 c-myb和 bcl- 2蛋白阳性表达率较对照组有显著降低 (P<0 .0 5 ) ;且 AON治疗后的脑胶质瘤中见较多炎性细胞浸润和钙化灶。结论　 c- myb癌基因有可能成为反义基因治疗恶性脑胶质瘤的优选靶点之一     

Expression and implication of c-myb and bcl-2 proteins in C6 gliomas]

This study was aimed at the level and implication of expression of c-myb and bcl-2 proteins in C6 glioma. The therapeutic effect of oncogene c-myb antisense oligodeoxynucleotide on C6 glioma in nude mice was studied. C6 glioma cells were implanted into the cutis of 36 nude mice. Ten days later, the nude mice were randomly divided into three groups and were treated with SON, AON and normal saline respectively. Three mice of every group were killed at 4 days, 8 days, 12 days and 16 days after treatment, respectively. The levels of c-myb and Bcl-2 proteins expression in the three groups were observed by the S-P immunohistochemical method. The results showed the expression of c-myb and bcl-2 proteins was significantly decreased in the AON group, compared with that in the SON and control groups (P < 0.05). These data suggest that c-myb and bcl-2 proteins may play an important role in malignant glioma, and c-myb gene and bcl-2 gene may be involved in the tumorigenesis and development of glioma.     

阳离子脂质体介导的反应c—myb寡核苷酸对脑胶质瘤生长的抑制作用研究

目的：观察阳离子脂质体lipofectAMINE介导的反义c-myb寡核苷酸（LipoAON)对肿瘤生长的影响。方法：取雄性Wistar大鼠48只，行脑内C6胶质瘤接种，术后6天，将携瘤大鼠随机分成LiPoAON组，反义c-myb寡核苷酸组（AON组），阳离子脂质体lipofectAMINE组（Lipo组）和生理盐水对照组（NS组），每组各12只，经大鼠右股静脉给药，间隔1天后，再次用同法经大鼠左股静脉等量给药，给药后严密观察各组大鼠饮食，四肢活动及体重变化情况，并于给药后第4天和第10天每组分别处死6只大鼠，进行肿瘤的生长情况的大体形态学观察。结果：LipoAON组在静脉给药期间及停药后的短期内其肿瘤生长被明显抑制,c-myb表达下调，而AON组，Lipo组与NS组相比，其肿瘤生长未见抑制现象，c-myb表达亦未见下调，但随着停药时间的延长，LipoAON对肿瘤的抑制作用下降，结论：（1）阳离子脂质体LipofectAMINE作为c-myb AON转移载体，使水溶性c-myb AON容易透过BBTB进入瘤内发挥治疗作用，且具有操作简单，安全，转染率高等特点；（2）LipoAON对C6胶质瘤生长有明显抑制作用，用反义技术抑制c-myb的表达在胶质瘤的治疗中具有研究前景，（3）LipoAON对胶质瘤生长的抑制作用随时间延长而下降，如何让c-myb AON在瘤内高效，持久，稳定地表达和发挥治疗作用，是值得进一步探讨的课题。     

HIFU联合化疗对裸鼠皮下胶质瘤细胞凋亡及增殖的影响研究

目的:探讨高强度聚焦超声(High intensity focused ultrosound,HIFU)联合化疗对裸鼠皮下胶质瘤靶区周围细胞凋亡和增殖的影响.方法:建立人(U251)胶质瘤移植模型,随机分入3组,局部分别行单HIFU治疗、单盐酸尼莫司汀(Nimustine,ACNU)及HIFU联合ACNU治疗.治疗24 h后切取肿瘤组织,行HE染色观察组织病理变化,免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达和TUNEL法检测细胞凋亡.治疗7d后分别测量3组瘤块体积.结果:HIFU联合化疗组靶区周围组织凋亡细胞数较单HIFU组及单化疗组高(P＜0.01);而PCNA阳性细胞数较后两者降低(P＜0.01).联合治疗组肿瘤体积较单HIFU组及单化疗组缩小(P＜0.01).结论:HIFU治疗及化疗在胶质瘤的治疗中具有协同作用.HIFU联合化疗能明显提高HIFU治疗疗效,诱导靶区周围胶质瘤细胞凋亡并抑制其增殖发挥抗肿瘤作用,有利于胶质瘤的治疗.     

氯通道ClC-2反义寡核苷酸对顺铂作用下神经胶质瘤U251细胞侵袭力的影响

目的：探讨氯通道ClC-2 反义寡核苷酸(AON)抑制ClC-2基因表达对顺铂(DDP)作用下神经胶质瘤U251细胞侵袭力的影响,为ClC-2成为神经胶质瘤综合治疗的新基因靶点提供理论依据。方法：U251细胞按处理方法不同分为对照组（转染无义寡核苷酸）、AON组（转染ClC-2反义寡核苷酸）、DDP组（无义寡核苷酸与顺铂联用）和AON +DDP组（ClC-2反义寡核苷酸与顺铂联用）。应用RT-PCR检测相关基因ClC-2、cyclin D1 、MMP-2、MMP-9 mRNA表达;Transwell 小室侵袭实验检测各组细胞侵袭力;Transwell 小室迁移实验检测各组细胞迁移率。结果：与对照组比较,AON组、DDP组和AON +DDP组ClC-2、cyclin D1 、MMP-2、MMP-9 mRNA表达率降低（P＜0.05）;Transwell 小室侵袭实验中对照组、AON组、DDP组和AON +DDP组侵袭细胞数分别为81.00±4.58、42.01±4.36、48.33±2.52和12.67±5.13;与对照组比较,AON组、DDP组和AON +DDP组穿透细胞数明显降低（P＜0.05）。Transwell 小室迁移实验中AON 组、DDP组、AON +DDP组细胞迁移率（%）分别为72.40±2.20、51.48±1.29、37.87±1.50,与对照组比较均明显降低（P＜0.05）。结论：①转染ClC-2反义寡核苷酸能有效抑制ClC-2 mRNA表达;②抑制ClC-2 mRNA能降低U251细胞的迁移力和侵袭力;③ClC-2 mRNA表达降低可促进顺铂对U251细胞迁移力和侵袭力的抑制作用。     

锝-99m标记survivin反义寡核苷酸肝细胞癌显像的实验研究

目的研究放射性核素锝99m(99mTc)标记survivin反义寡核苷酸(ASON)显像诊断肝细胞癌的价值。方法用DNA合成仪合成18碱基单链survivinASON,在5′末端经氨基修饰后,以S乙酰基N羟基琥珀酰亚胺巯基乙酰基三甘氨酸(SacetylNHSMAG3)作为螯合剂对survivinASON进行99mTc标记,并对99mTcsurvivinASON在荷瘤(SMMC7721)裸鼠模型体内的生物学分布、肿瘤反义基因显像、肿瘤反义基因抑制显像进行了分析。结果肿瘤组织显像时间早,0.5h即已开始显影。99mTcsurvivinASON在肿瘤组织内的聚集程度随时间延长而逐渐增加,于4h时达到最大,肿瘤/对侧肢体肌肉比值分别为2.48±0.44(体外显像)和3.35±0.57(生物学分布)。正义寡核苷酸(SON)在肿瘤组织内的聚集各时间点均明显低于ASON,差异有统计学意义(P<0.01)。用未标记的survivinASON进行抑制后,99mTcsurvivinASON在肿瘤组织中的聚集明显减少,4h时的肿瘤/对侧肢体肌肉比值降为0.93±0.23,与抑制前的2.48±0.44相比有明显减低(P<0.01)。结论99mTcsurvivinASON可在荷瘤裸鼠模型的肿瘤组织中特异性聚集,为肝细胞癌的特异性诊断提供了一种可能的新方法。     

Enhanced sensitivity to mitomycin C by abating heat shock protein 70 expression in human bladder cancer cell line of BIU-87

Background Bladder cancer is a relatively common tumor in the urinary system, in which mitomycin C (MMC)-based chemotherapy or combination chemotherapy has been mainly used to treat patients with advanced bladder cancer. The prognosis of patients with advanced bladder cancer is still extremely poor in spite of recent therapeutic advances. To improve the prognosis, the sensitivity of tumor cells to mitomycin C by the induction of apoptosis with the abating heat shock protein 70 (HSP70) expression in human bladder cancer cell lines of BIU-87 was investigated. Methods HSP70 expression was abated in BIU-87 cells by HSP mRNA antisense oligomers. MTT assay and the clone-forming test were used for evaluating the sensitivity of cells to MMC. Apoptosis was assessed using both fluorescent microscopy after staining the cells with Hoechst 33258 and DNA fragment ladder agarose electrophoresis. Thirty-two male six-week-old BALB/c nude mice, at the beginning of the experiment, were used to evaluate the effect of antisense oligomers (ASO) on the tumor formation in vivo. Results HSP70 expression in BIU-87 was effectively abated by HSP70 mRNA antisense oligomers. The percentage of apoptotic cells in ASO group was greater than in sense oligomers (SO) ［P&lt;0.05, （18.31±2.89）% vs （1.89±0.74）%］, nonsense oligomers (NO) ［P&lt;0.05, （18.31±2.89）% vs （1.78±0.92）%］ and blank groups ［P&lt;0.05, （18.31±2.89）% vs （1.87±0.84）%］, while the sensitivity of tumor cells to mitomycin C was enhanced. The in vivo tumor inhibition rate of ASO plus MMC (&gt;50%) was more than that of ASO or MMC group alone (all P&lt;0.05). Conclusions The abating level of HSP70 expression can strengthen the sensitivity of BIU-87 to MMC. One of this effect might be related to the induction of apoptosis by abating HSP70 expression. Chin Med J 2005; 118(23):1965-1972     

双氢青蒿素通过下调NICD-1抑制胶质瘤生长

目的 探讨双氢青蒿素(dihydroartemisinine,DHA)对人神经胶质瘤生长的影响及机制.方法 人胶质瘤U251细胞株传代培养,设置空白对照组、二甲基亚砜(DMSO)组、DAPT组和DHA(10、20、40、80 μmol/L)实验组,应用CCK-8和FCM检测细胞增殖、周期及凋亡,Western blot检测Notch1的胞内区域(NICD-1)及其下游靶蛋白Hes1的表达水平.建立裸鼠皮下胶质瘤模型(n=20),按随机数字表法分为DMSO组、DAPT组、DHA(50、100 mg/kg)治疗组,每组5只,根据时间体积曲线计算各组抑瘤率,免疫组化法检测裸鼠皮下移植瘤组织中NICD-1表达水平变化.结果 与空白对照组和DMSO组相比,实验组U251细胞增殖率显著下降,G1期细胞所占百分比显著上升,S期细胞所占百分比显著下降,早期凋亡率显著上升(P＜0.05),NICD-1及Hes1蛋白表达水平显著低于空白对照组(P＜0.05),均呈浓度依赖关系;DHA各治疗组的裸鼠皮下移植瘤生长速率及移植瘤组织内NICD-1表达显著低于DMSO对照组(P＜0.05).结论 DHA有效抑制人神经胶质瘤的生长,其作用机制可能与通过下调NICD-1表达抑制Notch信号通路有关.     

靶向HER-2 mRNA反义寡核苷酸抗乳腺癌增殖的体内研究

目的观察以HER-2mRNA为靶点的反义寡核苷酸HA6722体内抗乳腺癌的作用及其与细胞毒药物多西紫杉醇联合应用时抗肿瘤活性的变化。方法以SK-BR-3乳腺癌细胞株为移植实验细胞株,以BALB/C裸鼠为移植动物,建立HER-2过表达乳腺癌动物模型,观察不同剂量反义寡核苷酸HA6722及其对照序列单用或/和细胞毒药物多西紫杉醇联合应用时的抗肿瘤活性,并设空白对照组。结果在5mg·kg-1·d-1的剂量下单药反义寡核苷酸HA6722连续多次注射(1次/d,×12)可对乳腺癌的体内生长具有显著的抑制作用,抑瘤率达76·3%;联合应用多西紫杉醇时抗乳腺癌增殖作用明显加强,中等剂量HA6722(5mg·kg-1·d-1)联合多西紫杉醇(7·5mg·kg-1·d-1)与高剂量多西紫杉醇(15mg·kg-1·d-1)单独注射具有可比拟的抑瘤活性,两组抑瘤率分别为88·3%和88·7%(P>0·05);而中剂量的Scramble6722+多西紫杉醇(7·5mg·kg-1·d-1)则未见抗肿瘤活性有进一步的增强(P>0·05)。结论中等剂量的HA6722与多西紫杉醇联合应用,可以明显增强后者的抗肿瘤活性,其抗瘤活性可与高剂量的多西紫杉醇相比拟。     

微小RNA-155反义寡核苷酸对乳腺癌MDA—MB-157细胞及裸鼠移植瘤的作用

目的：探讨微小RNA-155（microRNA．155,miR-155）反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotide,AS0）对乳腺癌MDA-MB-157细胞增殖、凋亡及裸鼠移植瘤的作用。方法：设计合成化学修饰的miR-155ASO,通过Lipofectamine^TM 2000转染MDA-MB-157细胞,激光共聚焦检测转染率,real-timePCR测定转柒后miR-155表达水平的变化,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,观察miR-155ASO对裸鼠成瘤能力的影响,免疫组织化学法检测瘤体组织Caspase-3的表达。结果：激光共聚焦检测转染率达80％以上。转染miR-155AS0后,miR-155表达明显下降,细胞增殖能力降低,凋亡增加。miR-155AS0能明显抑制裸鼠移植瘤生长,抑制率为52．98％,并且能显著增加Caspase-3的表达。结论：miR-155AS0能显著下调miR-155的表达水平,继而抑制乳腺癌MDA-MB-157细胞的增殖,促进其凋亡;并且通过增加靶基因Caspase-3的表达,抑制裸鼠移植瘤的生长,为miR-155作为乳腺癌治疗靶点提供了实验依据。