SO-Rb 50克隆株生物学及分子生物学特性动态观察

目的 研究SO-Rb50细胞系三个克隆株MC 2、MC 3、MC 4第11代和MC 3 -138代染色体畸变的差异及Rb-1基因突变的情况。 方法 对SO-Rb50建立的三个克隆细胞株第11代进行G-显带核型分析；用常规方法抽提三个细胞株的第11代和MC 138代基因组DNA，用PCR联合SSCP法，逐个外显子筛查其Rb1基因编码区及启动子。 结果 1. 三个克隆株细胞的染色体数目和结构均有异常，出现不同类型的染色体畸变，13号染色体畸变仅见于个别核型且在三个克隆株中畸变情况不同。发现5个标记染色体M1，M2，M3，M4和M5，其中标记染色体M1出现频率最高，是由1号染色体长臂部分重复构成［t(1;１)qter-p35∷124-ter］。M4和M5为2号染色体的变化，是在该细胞系染色体变化动态研究中首次发现。2. 外显子24的SSCP电泳结果显示，MC4-11代细胞第2条单链泳动率比正常对照标本增快，单链数相同；MC4-138代细胞比对照多一条链。 结论 SO-Rb50细胞系至少存在两个不同克隆株，同一克隆株不同代数的细胞生物学特性有动态变化。13号染色体的畸变不是RB发生的唯一原因；1号染色体的变化与本细胞系的永生关系密切，其与RB发生、发展的关系值得深入研究。 (中华眼底病杂志, 1999, 15: 146-148)     

Rb1基因第16内含子内21个碱基缺失1例

目地研究双眼视网膜母细胞瘤患者Rb1基因杂合性突变的分子生物学特性。方法应用PCR—SSCP直接测序技术检测双眼视网膜母细胞瘤患者白细胞DNA中Rb1基因杂合性突变。结果50例证实有Rb1基因杂合性突变的病例中有1例发生于第16内含子中可以用3种定位方法解释、具有相同序列的21个碱基缺失。结论这种极为少见的Rb1基因突变方式可能是由于破坏了正常拼接位点的结构而激活了“隐蔽拼接位点”，导致异常的Rb1基因mRNA产生或由此影响整个拼接过程。     

三个Rb基因突变嵌合体家系分子遗传学分析

目的：遗传型RB是一种单基因疾病，由定位在13q14的Rb基因突变所致。大多数遗传性RB表现出典型的孟德尔常染色体显性遗传特征。作者分析三个遗传性RB家系RB外显不全及表型传递规律变异的原因。 方法：RELPs和VNTRs作单体型分析，SSCP及直接DNA序列分析检测Rb基因点突变。 结果：Rb基因突充嵌合体是造成某些Rb基因突变携带者不发病以及家庭成员中RB表型遗传不符合孟德尔规则的重要原因之一。结论：直接检测致病性的Rb基因突变才能准确判断携带者，估计患病风险。 （中华眼底病杂志，1996，12：37-40）     

108例视网膜母细胞瘤Rb基因突变的特征

目的；研究RB患者肿瘤及体细胞内Rb基因的存在状态、细微结构、Rb基因突变的特征、起源与传递。 方法；DNA分子杂交、SSCP分析、DNA序列测定。结果：108例RB肿瘤标本中80例(?4％)存在Rb基因点突变，其中44例为纯合型，20例有二个独立发生的杂合型点突变，16例只检出一个杂合型点突变。通过对比分析RB患者肿瘤与白细胞DNA、RB患者家庭成员白细胞DNARlo基因的结构，揭示了Rb基因点突变的起源与遗传特征。 结论：Rb基因是与RB肿瘤形成关系最为密切的基因。RB肿瘤发生需二次突变事件导致Rb基因的二个等位基因失活，第一次突变事件突出表现为点突变；第二次突变事件主要是LOH，其次是点突变。 （中华眼底病杂志，1997，13：12-16）     

RB患者肿瘤及体细胞中Rb基因点突变谱及其特征和意义

目的：研究RB患者肿瘤及体细胞巾Rb基因点突变的频率，特征及其在肿瘤遗传易感性的传递及肿瘤形成机制中所起的作用。 方法：SSCP分析及直接DNA序列分析。 结果：在302例经Southern blotting杂交证实无明显Rb基因缺失或重排的RB患者的肿瘤或外周血白细胞DNA中共发现187个Rb基因点突变。 结沦：Rb基因点突变几乎随机分布在整个编码区，常常导致氨基酸密码突变为终止密码，阅读框架移位或mRNA拼接异常，产生缩短丁的或缺乏某个外显子编码氨基酸的蛋白质。并以半个碱基取代占绝大多数。缺失或插入突变通常是一个或二个碱基的微小病变。 （中华眼底病杂志，1995，11：240-243）     

视网膜母细胞瘤病人体细胞中RB1基因突变的检测

目的检测视网膜母细胞瘤(RB)病人体细胞中RBI基因突变，探讨RBI基因突变的分子生物学机制。方法应用PCR—SSCP技术筛查RB病人白细胞基因组DNA，测序分析确定突变。结果在12例RB病人中，确定3例RBI基因生殖细胞性突变。他们分别是第10外显子中T至A杂合性突变，将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列；第10外显子1bp碱基缺失(GAT—AT)，发生阅读框架改变；第22外显子中A至T杂合性突变，将精氨酸序列变为终止密码。结论这3例RBI基因生殖细胞性突变的方式为点突变和小缺失，这些突变改变了RBI基因的遗传信息，致使异常的RBI基因蛋白产生，导致视网障母细胞瘤的发生。     

变性高效液相色谱检测视网膜母细胞瘤Rb1基因外显子

目的探讨变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC）检测视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）Rb1基因外显子突变的情况。方法收集25例RB患者的肿瘤组织和3例健康者的外周血。提取其基因组,扩增Rb1基因的第3、7、9、12和26个外显子片段,再以DHPLC和DNA直接测序法分别检测其突变情况并进行比较。结果所有模板均扩增出5个外显子片段。DHPLC分析得第3、7、9、12和26个外显子的最优化检测柱温分别为54．4、55．2、53．4、53．4和55．2℃;第3、7、9和12个外显子中,25例患者和3例健康者均呈现同样峰形;而第26个外显子中,有2例患者呈现不同峰形。对所有片段进行测序,第3、7、9和12外显子的扩增片段中未发现突变。而外显子26的扩增片段中,DHPLC峰形和其他片段不同的2个样品也未出现突变。DHPLC和直接测序结果的差异无统计学意义（P〉0．05）。结论DHPLC能快速检测出Rb1基因外显子片段的突变位点,可以用于RB的检测。     

BIGH3基因的Arg555Trp突变引起颗粒状角膜营养不良

目的　阐明颗粒状角膜营养不良(CDGGⅠ )的发病机制。 方法　采用聚合酶链式反应 -单链构象多态性(PCR SSCP)分析,对 1个CDGGⅠ病例进行BIGH3基因第 12号外显子的突变筛查,并对发现的异常泳动带进行DNA测序,以确定突变位点。 结果　CDGGⅠ患者在 12号外显子有Arg555Trp突变。 结论　BIGH3基因突变Arg555Trp是导致CDGG1的原因。     

遗传性Avellino角膜营养不良一家系转化生长因子β诱导基因的突变研究

背景研究发现角膜营养不良与位于染色体5q31区域转化生长因子β诱导基因（TGFBI）的突变有关,目前发现Avellino角膜营养不良的TGFBI基因突变位点为R124H。目的检测中国遗传性Avellino角膜营养不良一家系的致病基因并进行分子遗传学分析,探讨其TGFBI的基因突变类型。方法本家系先证者在北京大学第三医院确诊,共调查连续4代27名成员,收集遗传性Avellino角膜营养不良患者8例和表型正常成员2名的外周血3ml提取DNA,合成TGFBI第4、11、12外显子的特异性引物,采用聚合酶链反应（PCR）进行扩增,对PCR产物直接进行DNA测序分析并与正常GenBank中的TGFBI基因序列比对。结果该家系中Avellino角膜营养不良的遗传模式符合常染色体显性遗传,8例患者的TGFBI基因第4外显子均显示CGC〉CAC（R124H）突变杂合子,家系中的2名表型正常成员无此基因位点突变。8名家系成员存在第11外显子的472密码子CTC〉CTT的杂合性同义单核苷酸多态性（SNP）,9名家系成员存在第12外显子的540密码子TTT〉TTC的杂合性同义SNP,且SNP与疾病表现型无关。结论该Avellino角膜营养不良家系存在TGFBI基因突变,为R124H杂合突变类型。     

湖北地区原发性先天性青光眼患儿CYP1B1基因的新突变研究

目的探讨湖北地区汉族原发性先天性青光眼（PCG）患儿的基因突变情况并为基因诊断奠定基础。方法对47例无关个体PCG患儿及100例健康正常儿童进行基因分析。采取外周静脉血4ml,制备外周白细胞基因组DNA,参照文献所报道的引物序列,聚合酶链反应（PCR）分别扩增CYP1B1基因的第2、3外显子,琼脂糖凝胶电泳鉴定产物后,应用单链构象多态性（SSCP）、变性高效液相色谱分析（DHPLC）及DNA序列分析技术对患儿和对照组进行基因分析。结果7例PCG患儿呈现CYP1B1基因的第3外显子第385密码子的第1个碱基C→T碱基点突变,致对应的亮氨酸转变为苯丙氨酸（L385F）。这一变异在正常对照组成员中未检出,且检索国内外文献尚未见报道。结论湖北地区汉族PCG患者存在CYP1B1基因第3外显子突变,这一新突变位点位于P450蛋白的重要功能区,可能为病理性突变。在汉族PCG患者中进行CYP1B1基因突变的深入研究并寻找其他致病基因,对探讨PCG发病机制具有重要意义。     

人视网膜母细胞瘤细胞系SO—Rb50克隆株染色体畸变的观察

目的:研究SO-Rb_(50)细胞系三个克隆株MC_2、MC_3、MC_4染色体畸变的差异。方法:对MC_2、MC_3、MC_4的第11代进行G-显带核型分析。结果:三个克隆株细胞的染色体数目和结构均有异常,出现不同类型的染色体畸变。细胞染色体核型分析见假二倍体核型,13号染色体畸变仅见于个别核型且在三个克隆株中畸变情况不同。发现5个标记染色体,其中标记染色体M_1出现频率最高,几乎见于每个细胞,是由1号染色体长臂部分重复构成(t(1;1)qter-p35::q24-ter);另外还有几个异常标记染色体M_2,M_3,M_4和M_5分别见于各个克隆株细胞。标记染色体M_4和M_5为2号染色体的变化,是在该细胞系染色体变化动态研究中首次发现。结论:SO-Rb(50)在体外培养连续传代后仍存在不同的克隆株,结合以往对该细胞系染色体畸变的动态研究,不同代数的瘤细胞染色体结构畸变有差异,进一步证明体外培养连续传代过程中染色体结构畸变呈动态变化。我们认为13号染色体的畸变不是Rb发生的唯一原因;1号染色体的变化与本细胞系的永生关系密切,其与Rb发生、发展的关系值得深入研究;其它染色体变化为继发改变。眼科学报1998;14:220～223。     

Detection of Tumor Suppressor Gene and Oncogene in SO-Rb_(50) Human Retinoblastoma Cell Line

Retinoblastoma (Rb) is the most common malignant‘cancer of eye. So-Rb_(50) is the first Rb cell line established in China in 1988. It has passed to the 387th passage now. We collected cells of the 327th passage of SO-Rb_(50), purified its genomic DNA and detected it with Rb and c-myc cDNA probes respectively (normal human white blood cells DNA was the control). We found the Rb gene was deleted while c-myc gene was amplified three times. This provides a basis for further study of the regulation of tumor ...     

人视网膜母细胞瘤SO-Rb_(50)细胞系单克隆方法探索

目的:为了使培养细胞的遗传性状、生物学特性相似,利于多种实验研究,而对视网膜母细胞瘤SO-Rb_(50)细胞系进行克隆。方法:用多孔塑料板克隆细胞法,对SO-Rb_(50)细胞进行克隆及分离培养。结果:没有菊花团形成的Rb细胞克隆成功,而有菊花团的Rb细胞、连续三次克隆均不能成功。结论:提示分化好的Rb细胞难以克隆成功。眼科学报 1996;12:79—82。     

视网膜母细胞瘤细胞株SO-Rb50及SO-Rb70对六种抗癌药物敏感性测定

目的 利用体外培养的视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,Rb）细胞株筛选对Rb敏感的化疗药物。方法 采用噻唑蓝（3,-4,5 Dimethyliazol tetrazolium bromide,MTT）法对SO-Rb50和SO-Rb70瘤细胞株进行更生霉素、长春新碱、鬼臼噻吩甙、柔红霉素、顺氯氧铂、平阳霉素6种药物体外敏感实验．结果 6种药物作用于SO-Rb5048小时50％抑制浓度（50％ inhibitory concenrtation,IC50）值（μg／ml）分别为0.0004、0.0016、0.0389、0.047、0.29、0.44．72小时分别为0.00025、0.00081、0.0151、0.0192、0.097、0.11,作用于SO-R5048小时IC50值分别为0.00065、0.00149、0.0282、0.043、0.37、0.215,72小时分别为0.00042、0.00082、0.0146、0.0176、0.035、0.084．结论 SO-Rb50和SO-RS70瘤细胞对于上述6种化疗药物均敏感,根据其IC50值．药物敏感性顺序依次为更生霉素、长春新碱、鬼臼噻吩甙、柔红霉素、顺氯氨铂、平阳霉素。     

视网膜母细胞瘤SO-Rb_(50)瘤细胞对眼内组织侵袭的体外观察

目的:研究视网膜母细胞癌瘤细胞对眼内各组织的侵袭能力。方法:将视网膜母细胞瘤SO-Rb_(50)瘤细胞与眼内各组织块及细胞共同培养,形态学观察瘤细胞与眼内正常组织及细胞的粘附能力。结果:视网膜母细胞瘤SO-Rb_(50)瘤细胞能粘附到眼内各组织块上;对眼内不同组织的细胞,SO-Rb_(50)癌细胞粘附能力不一,SO-Rb(50)瘤细胞能粘附到角、巩膜的纤维细胞、虹膜及脉络膜色素细胞及纤维细胞、晶体上皮细胞上,但与角膜上皮细胞、视网膜色素上皮细胞均不发生粘附。结论:我们认为肿瘤细胞转移对器官及组织的选择性除与细胞外基质相互作用外,肿瘤细胞与宿主细胞表面结构的相互作用也起了重要的作用。视网膜色素上皮细胞与肿瘤细胞不粘附,形成一道天然的屏障阻挡了Rb瘤细胞对脉络膜的侵犯。Rb瘤细胞对视神经组织粘附能力虽然没有比其它组织强,但瘤细胞粘附在视神经胶质细胞上成片生长,瘤细胞体积增大,形态变成梭形,伸出一些细胞突起,与实体瘤转移到视神经弥漫浸润生长相一致,这种生长方式是造成一旦瘤细胞侵犯视神经,较容易扩展到全身的主要原因。眼科学报1996;12:173～177。     

视网膜母细胞瘤细胞的体外培养及建系

对60例视网膜母细胞瘤进行体外培养,其中10例生长期超过3个月,1例已建成连续视网膜母细胞瘤系(SO-Rb50)我们认为视网膜母细胞瘤体外培养能否成功,除与Rb细胞的恶性程度有关外,尚与取材方法,培养基的成分、接种及传代细胞的优选及密度等有密切关系。