TLR4在脂多糖诱导肾小管上皮细胞MAPK信号通路中的作用及其机制

目的:研究Toll样受体4(TLR4)在脂多糖(LPS)诱导肾小管上皮细胞炎症反应中的作用及其可能的分子机制。方法:雄性SD大鼠8只,随机分为假手术组(Sham组)和盲肠结扎穿孔组(CLP组),各4只。CLP组大鼠采用盲肠结扎穿孔法建立脓毒血症动物模型,Sham组除不行盲肠结扎穿孔外,其余处理同脓毒血症组,造模后24h处死大鼠取肾组织。体外培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),以1μg/ml LPS刺激不同时间(5,15,30,60min),采用免疫荧光、Western blot法检测大鼠肾组织及肾小管上皮细胞TLR4的表达及分布,Western blot法检测细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路(包含p38、JNK两条主要通路)及Iκ-B磷酸化情况。TLR4抑制剂TAK-242(5mol/L)及MAPK通路抑制剂SB202190(10μmol/L)、SP600125(25μmol/L)预处理NRK-52E后,分别检测TLR4蛋白表达、MAPK信号蛋白及I-κB磷酸化水平。结果:1免疫荧光结果显示TLR4主要表达在大鼠肾小管上皮细胞;正常肾小管上皮细胞TLR4主要分布于细胞质。2Western blot结果显示随LPS刺激时间的增加,肾小管上皮细胞TLR4表达显著升高(P<0.05)。3NRK-52E细胞在受到LPS刺激后其p38、JNK MAPK蛋白及I-κB蛋白磷酸化水平增加(P<0.05)。4TLR4抑制剂预处理NRK-52E细胞,可显著降低LPS诱导的p38、JNK MAPK信号通路活化及I-κB磷酸化水平(P<0.05)。5SB202190、SP600125分别预处理NRK-52E细胞,均可显著降低LPS诱导的I-κB磷酸化(P<0.05)。结论:TLR4通过p38、JNK MAPK信号通路介导LPS诱导的肾小管上皮细胞炎症反应。     

白藜芦醇抑制TXNIP/NLRP3信号通路改善脂多糖诱导的肾小管上皮细胞炎性损伤

[目的]观察白藜芦醇对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞（HK-2）炎性损伤的保护作用,及其对TXNIP/NLRP3炎性通路的影响。[方法]采用脂多糖（LPS,1 mg/L）体外诱导HK-2细胞炎性损伤模型,将细胞分为正常对照组、LPS诱导组、LPS+低剂量（50 μmol/L）白藜芦醇组、LPS+中剂量（100 μmol/L）白藜芦醇组、LPS+高剂量（200 μmol/L）白藜芦醇组;CCK8法检测HK-2细胞相对存活率,酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测炎性因子白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平,Western Blot方法分析诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧酶-2（COX-2）、人硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）及人隐热蛋白（NLRP3）表达。[结果]与LPS诱导组比较,不同浓度白藜芦醇干预的HK-2细胞相对存活率明显升高（P<0.05）,细胞上清炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平明显降低（P<0.05）,细胞中炎性蛋白iNOS及COX-2表达水平显著降低（P<0.05）;细胞中TXNIP及NLRP3蛋白表达也显著降低（P<0.05）,并表现出剂量依赖性。[结论]白藜芦醇可以明显抑制LPS诱导的HK-2细胞炎症损伤,抑制炎症相关蛋白的表达,其作用机制可能与抑制TXNIP/NLRP3炎性通路活化相关。     

Akt信号通路对肾小管上皮细胞分泌核因子-κB的影响

目的:探讨Akt信号通路在肾小管上皮细胞(NRK-52E)分泌转化生长因子β1(TGF-β1)和核因子-κB(NF-κB)表达中的作用。方法:体外培养NRK-52E细胞,分别加入不同浓度(5,15,30g/L)白蛋白和/或Akt抑制剂Ly294002。应用RT-PCR方法测定TGF-β1mRNA表达,Western blot测定Akt和TGF-β1蛋白的表达。应用凝胶电泳迁移率(EMSA)检测NF-κB活化。两两比较用t检验。结果:白蛋白呈浓度依赖性上调肾小管上皮细胞TGF-β1mRNA表达增加。TGF-β1蛋白表达也增加。白蛋白激活NF-κB活性,增加磷酸化Akt表达。Ly294002能够抑制白蛋白引起的NF-κB活性以及TGF-β1的表达。NF-κB活化与TGF-β1表达呈显著正相关(r=0.61,P<0.05)。结论:白蛋白刺激肾小管上皮细胞分泌TGF-β1和NF-κB的活性增加,其机制部分依赖于Akt的磷酸化作用。     

干预Hedgehog信号对肾小管上皮细胞增殖细胞核抗原表达的影响

目的:探讨Hedgehog(HH)信号通路的活化和抑制对肾小管上皮细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法:根据干预措施将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E分为对照组、活化组(10μg/L Shh)和干预组(10μg/L Shh加5μmol/L环杷明)。细胞培养24 h后,细胞免疫荧光染色检测HH信号关键分子Ptch1、Smo和Gli1,以及细胞增殖标志物PCNA的表达,real-time RT-PCR检测Ptch1和Smo m RNA的表达。结果:免疫荧光染色显示,对照组细胞维持一定的增殖状态,HH信号活性较低,PCNA表达水平较低;当外源性重组蛋白Shh活化NRK-52E细胞24 h后,Smo和Gli1 m RNA和蛋白表达显著升高,Ptch1的表达显著下调,这提示Shh可激活HH信号(P<0.05)。在此过程中,PCNA表达水平显著升高,NRK-52E细胞数量增加,同时伴随细胞形态的改变;在Shh的基础上加入环杷明干预后,HH信号被抑制(P<0.05),PCNA表达下降,NRK-52E细胞增殖被抑制,出现凋亡或坏死。结论:HH信号与肾小管上皮细胞的增殖密切相关。通过药物调控HH信号的活化,可影响PCNA的表达,进而影响细胞增殖效应。     

表面活性蛋白A不同亚型在脂多糖诱导肾小管上皮细胞IL-8表达中的作用

目的探讨表面活性蛋白A(surfactant protein A,SP-A)不同亚型(SP-A1,SP-A2)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)IL-8表达的影响。方法体外培养HK-2细胞,分别转染SP-A1、SP-A2及阴性对照siRNA,实时定量PCR检测SP-A1及SP-A2 mRNA表达水平,并给予1μg/ml LPS刺激8h,ELISA观察转染不同siRNA后IL-8蛋白表达变化。结果转染SP-A1、SP-A2 siRNA可分别显著下调转染SP-A1、SP-A2的mRNA表达水平(P<0.05);1μg/ml LPS刺激8h可引起HK-2细胞IL-8蛋白表达显著增加(P<0.05),低表达SP-A2可下调LPS诱导的IL-8表达(P<0.05)。结论 LPS刺激下肾小管上皮细胞IL-8表达增加与SP-A2的表达有关,SP-A2可能在肾脏炎性反应中发挥重要作用。     

槲皮素通过抑制TLR4/NF-κB通路缓解脂多糖诱导的急性肾损伤

目的分析槲皮素对脂多糖诱导小鼠急性肾损伤的保护作用,并初步探讨其机制。方法将40 只BALB/c小鼠随机分 为4 组：对照组（无脂多糖及槲皮素）,脂多糖组（15 mg/kg 脂多糖）,低剂量组（25 mg/kg 槲皮素+15 mg/kg 脂多糖）,高剂量组 （50 mg/kg槲皮素+15 mg/kg脂多糖）。槲皮素予以胃灌注预处理,1次/d,连续3 d,对照组同时予以相同体积的生理盐水。最后 1次灌胃后1 h予以腹腔注射15 mg/kg的脂多糖,脂多糖干预24 h后结束实验,处死小鼠。观察小鼠肾脏组织病理变化和血肌 酐、尿素氮评估肾脏损伤情况,ELISA 法检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的表达情况,Western blot 检测肾脏胞浆中TLR-4、 MyD88、TRAF-6以及核内NF-κB p65蛋白的表达。结果槲皮素可以降低脂多糖诱导的急性肾损伤的肌酐、尿素氮水平以及肾 脏损伤的评分（P<0.05）,降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达（P<0.05）,槲皮素抑制肾脏组织中TLR4、MyD88、TRAF-6及核 内NF-κB p65蛋白的表达（P<0.05）。结论槲皮素预处理可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路保护脂多糖诱导的小鼠急性肾损伤。     

牛蒡子苷元调节Notch/Hes-1信号通路对LPS诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的 观察牛蒡子苷元(ARC)调节Notch/Hes-1信号通路对脂多糖(LPS)诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法 将HK-2细胞分为对照组,脂多糖组,牛蒡子苷元低、中、高剂量组,牛蒡子苷元高剂量+Notch/Hes-1激活剂组(高+Jagged1组),分别检测细胞活力、细胞凋亡、活性氧(ROS)水平、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)含量、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)含量及Notch1、Hes-1蛋白表达和Notch1 mRNA、Hes-1mRNA水平。结果 与对照组比较,脂多糖组细胞活力、SOD、CAT含量、Bcl-2蛋白表达显著降低,细胞凋亡率、ROS荧光强度、TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA含量和Cleaved-caspase3、Bax、Notch1、Hes-1蛋白表达及Notch1 mRNA、Hes-1 mRNA水平显著增加(P<0.05);与脂多糖组比较,牛蒡子苷元低、中、高剂量组细胞活力、SOD、CAT含量及Bcl-2蛋白表达以浓度依赖性增加,细胞凋亡率、ROS荧光强度、...     

脂多糖诱导成骨细胞增殖的Notch信号通路研究

目的:探讨脂多糖(LPS)对成骨细胞增殖的Notch信号通路的诱导激活作用.方法:以MC3T3-E1细胞为模型,设计正常对照组、LPS浓度梯度组(5、10μg组)、DAPT组(先加入DAPT,随后加入10μg LPS)和DMSO组(先加入DMSO,随后加入10μg LPS).分别于OBDM培养基中诱导分化5d和15d时加入不同浓度的脂多糖、DAPT和DMSO,培养3d后进行MTT实验,随后采用PCR检测各组细胞中HES1mRNA表达量.结果:与对照组相比,加入脂多糖5μg组第5天,脂多糖10 μg组第5、6、7天时细胞吸光度显著降低(P＜0.01);与正常对照组相比,5μg组和10 μg组脂多糖均能够使MC3T3-E1细胞和成骨细胞前体细胞增殖能力降低(P＜0.01),而仅5μg组LPS能够使成骨细胞增殖分化能力降低(P＜0.01);不同浓度LPS均能够诱导HES1mRNA的表达,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);随着LPS浓度增加,HES1mRNA表达量显著增加(P＜0.01);与对照组相比,DM-SO组HES1mRNA量显著较高,差异具有统计学差异(P＜0.05).结论:脂多糖抑制骨头发育和愈合,可能是通过激活经典的Notch信号通路,诱导HES1mRNA的表达,抑制成骨细胞及其前体细胞的增殖分化造成.     

半夏泻心汤通过介导MAPK信号通路抑制巨噬细胞炎症因子的分泌

目的:观察半夏泻心汤体外抑制巨噬细胞分泌炎症因子的作用及对MAPK炎症信号通路的影响,以探讨其治疗胃炎的可能机制。方法:取小鼠8只,提取小鼠腹腔巨噬细胞,原代培养;用家兔制备半夏泻心汤含药血清和对照血清。小鼠腹腔巨噬细胞分为空白对照组、脂多糖(LPS)组、地塞米松组及半夏泻心汤5%含药血清组、10%含药血清组和20%含药血清组,各组分别给予对照血清、LPS、地塞米松和各浓度含药血清。作用6 h后收集细胞,用qRT-PCR方法检测细胞内IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA相对表达量;作用24 h后,用ELISA方法检测细胞培养上清中炎症因子IL-1β、IL-8和TNF-α的蛋白含量。收集20%含药血清作用30 min、60 min和2 h后的细胞,用Western blot方法检测细胞外调节蛋白激酶(ERK)和P38的磷酸化水平。结果:qRTPCR结果显示,与不含药血清对照组比较,LPS能明显促进小鼠腹腔巨噬细胞IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA表达(P0.01);与LPS组比较,地塞米松能明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA表达(P0.01);5%含药血清能明显抑制巨噬细胞TNF-α的mRNA表达(P0.01),10%和20%含药血清均能明显抑制IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA表达(P0.01)。ELISA结果显示,5%含药血清能明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞IL-1β的分泌(P0.01),10%、20%含药血清能明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞IL-1β、IL-8和TNF-α的分泌(P0.05,P0.01)。Western blot结果显示,半夏泻心汤含药血清作用30 min、60 min均能抑制小鼠腹腔巨噬细胞MAPK信号通路中P38磷酸化水平(P0.05、P0.01);含药血清作用2 h能抑制巨噬细胞的ERK和P38的磷酸化水平(P0.01)。结论:半夏泻心汤可能通过调节巨噬细胞内MAPK炎症信号通路中ERK、P38的磷酸化水平,抑制巨噬细胞分泌炎症因子IL-1β、IL-8和TNF-α而起到治疗胃炎的作用。     

丹皮酚抑制脂多糖诱导的血管内皮细胞TNF-α释放对共培养体系中血管平滑肌细胞凋亡及p38 MAPK信号通路的影响

目的 观察丹皮酚（Paeonol,Pae）对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）损伤的大鼠血管内皮细胞（vascular endothelial cells,VECs）炎性因子释放及对血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）凋亡的影响,阐明Pae抑制VSMCs凋亡是否通过影响VECs释放的炎性因子调控p38 MAPK信号通路。方法 组织块预消化贴壁法原代培养VECs和VSMCs;Transwell小室建立VSMCs和VECs共培养体系;LPS诱导VECs损伤;MTT方法检测细胞存活率;ELISA检测VECs分泌肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）的水平;流式细胞仪检测VSMCs凋亡率;Western blotting检测VSMCs中p38 MAPK信号通路及凋亡相关蛋白表达。结果 与正常对照组比较,LPS可显著提高VECs分泌的TNF-α水平（P＜0.05）,明显升高共培养体系中VSMCs p38 MAPK信号通路蛋白及凋亡相关蛋白（p-MKK3/6、p-p38、p53和Cleaved caspase-3）水平（P<0.05）,显著提高VSMCs凋亡率（P<0.05）;与LPS刺激组比较,Pae可显著抑制VECs分泌的TNF-α（P＜0.05）,明显降低共培养体系中VSMCs p38 MAPK信号通路蛋白及凋亡相关蛋白（p-MKK3/6、p-p38、p53和Cleaved caspase-3）水平（P＜0.05）,显著降低VSMCs凋亡率（P＜0.05）。结论 Pae可抑制VECs释放TNF-α,从而抑制p38 MAPK信号通路,进而减少VSMCs凋亡。     

黄芪甲苷通过调控Keap1-Nrf2-ARE信号通路减轻PM2.5诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤

目的 探讨黄芪甲苷减轻细颗粒物2.5(particulate matter 2.5,PM2.5)所致肾小管上皮细胞氧化损伤的作用及分子机制。方法 将HK-2细胞分为5组：对照组（仅磷酸盐缓冲液处理）、模型组（200 μg/mL PM2.5处理24 h）、黄芪甲苷低剂量组（200 μg/mL PM2.5及10 nmol/L黄芪甲苷共同处理24 h）、黄芪甲苷中剂量组（200 μg/mL PM2.5及100 nmol/L黄芪甲苷共同处理24 h）、黄芪甲苷高剂量组（200 μg/mL PM2.5及200 nmol/L黄芪甲苷共同处理24 h）。采用流式细胞术和TUNEL检测不同方法处理的HK-2细胞凋亡情况,采用EdU实验和CCK8实验检测细胞增殖情况,采用Western blot检测不同方法处理的HK-2细胞中Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1）-核因子红细胞相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)-抗氧化反应元件（antioxident response element, ARE）信号通路相关蛋白的表达水平。结果 流式细胞术和TUNEL染色结果显示,黄芪甲苷显著抑制PM2.5导致的肾小管上皮细胞凋亡,其抑制效果随黄芪甲苷浓度的增加而增加。CCK8检测结果和EdU细胞增殖检测结果显示,黄芪甲苷显著促进肾小管上皮细胞增殖,细胞活力随黄芪甲苷浓度的增加而增加。进一步检测显示,黄芪甲苷显著抑制PM2.5导致的肾小管上皮细胞活性氧和丙二醛水平升高,并显著促进超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平的升高。Western blot结果显示,与模型组比较,黄芪甲苷处理显著提高总Nrf2、核Nrf2、血红素氧化酶-1以及NAD（P）H醌脱氢酶1（NQO1）水平（P＜0.05）。结论 黄芪甲苷通过调控Keap1-Nrf2-ARE信号通路减轻PM2.5导致的肾小管上皮细胞氧化损伤。     

细菌脂多糖诱导THP1细胞丝裂原信号传导通路活化及细胞因子释放

丝裂原活化的蛋白激酶(ＭＡＰＫ)系列包括一蛋白激酶瀑布群,即癌基因ｐ21ｒａｓ和或蛋白激酶Ｃ(ＰＫＣ),ｒａｆ1蛋白激酶,丝裂原活化蛋白激酶的激酶1和2(ＭＥＫ)以及ＭＡＰＫ(也称细胞外信号调节的蛋白激酶ＥＲＫ)。细菌脂多糖是巨噬细胞的强力活化剂,能刺激巨噬细胞释放多种细胞因子和二十烷类免疫反应介质。已有报道,细菌内毒素脂多糖(ＬＰＳ)刺激ＭＡＰＫ磷酸化及活化并诱导肿瘤坏死因子(ＴＮＦα)和ＩＬ1β产生[1]。为明确ＬＰＳ及癌基因ｒａｓ和蛋白激酶ｒａｆ在调节丝裂原信号传导通路活性中的作用,更好了解ＬＰＳ激活单核巨噬细胞的…     

MAPK信号通路在乳腺癌中的研究进展

乳腺癌是常见恶性肿瘤中女性高发的疾病,雌激素在乳腺肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号转导通路是雌激素受体介导的通路中的一条重要的参与基因组效应和非基因组效应的信号通路。近年来,存在很多有关MAPK信号通路调控乳腺细胞异常增殖的研究,本文从乳腺癌发病率、危险因素、雌激素对MAPK信号通路的调节和MAPK信号通路在乳腺癌中的作用等角度进行综述,以推动乳腺癌的研究。     

支架蛋白JLP调控B细胞上CD40诱导的MAPK信号通路活化及细胞增殖

目的 对支架蛋白JLP在小鼠B细胞上CD40诱导信号通路活化及细胞增殖中的作用进行研究,探索支架蛋白JLP在CD40诱导小鼠B细胞信号通路及后续生物学效应中的作用.方法 磁珠分选法分选出jlp野生型和jlp基因敲除小鼠模型脾脏B细胞,使用免疫印迹法检测在接受CD40配体（CD40L）刺激后jlp野生型和jlp基因敲除型小鼠脾脏B细胞p38、Erk和Jnk MAPK,磷酸化c-Jun以及NF-κB信号通路及的活化情况,并使用CFSE检测两种基因型小鼠B细胞在接受CD40L刺激后细胞增殖情况.结果 jlp基因敲除小鼠B细胞在受到CD40L刺激后其p38、Erk、Jnk MAPK信号通路以及c-Jun活化情况均较jlp野生型小鼠B细胞明显减弱,而NF-κB信号通路的激活情况在两种基因型B细胞中并无明显差异,jlp基因敲除小鼠B细胞中CD40诱导的细胞增殖水平较jlp野生型B细胞明显降低.结论 支架蛋白JLP参与调控B细胞上CD40诱导的MAPK信号通路活化及细胞增殖.     

FOXM1通过靶向上调PHB2的转录改善线粒体功能障碍保护脂多糖诱导的肾小管上皮细胞损伤

目的:探究FOXM1在脂多糖(LPS)诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用及其可能的作用机制.方法:体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,qRT-PCR和Western blot检测细胞FOXM1和PHB2表达;CCK-8检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;JC-1染色检测线粒体膜电位;试剂盒检测细胞ATP含量;荧光素酶报告...     

白细胞介素-35介导p38 MAPK/NF-κB信号对脂多糖诱导的急性肺损伤的保护作用

目的 研究白介素-35(IL-35)介导p38MAPK/NF-κB信号对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)的保护作用.方法 将40只小鼠随机分成4组,分别为对照组、LPS组、LPS+NC组和LPS+pcDNA3.1-IL-35(pIL-35)重组质粒组,每组10只.除对照组外,其余3组均复制ALI模型.LPS+...     

自噬在肾小管上皮细胞损伤中的研究进展

<正>自噬(autophagy)是细胞依赖溶酶体途径,是高度保守地对胞内蛋白和部分细胞器(如线粒体、内质网)进行降解的过程,对维持细胞增殖、分化,稳定细胞内环境及促进异常细胞凋亡有重要作用。研究发现,肾缺血-再灌注(Ischemic reperfusion,I/R)损伤、脓毒症肾损伤、肾间质炎症、纤维化和慢性肾脏病等肾小管间质疾病的发病机制与凋亡有不同程度的关系,而自噬与凋亡在某些方面有一定关系,由此,自     

地塞米松对脂多糖激活的核因子-κB信号通路作用机制研究进展

脂多糖（LPS）是重要的炎症诱导因子,可通过与炎症相关细胞膜表面的Toll样受体4（TLR4）结合入胞并激活下游信号通路,促使核因子（NF）-κB进行核转位从而启动目标基因的转录,合成促炎因子推动炎症反应的进行。地塞米松作为强效的糖皮质激素可通过一系列"基因组效应"调控LPS-TLR4/NF-κB信号通路中的多个组分,影响炎症因子的合成,改变炎症转归。文章综述了LPS通过TLR4激活NF-κB通路的机制以及地塞米松对LPS-TLR4/NF-κB通路的作用机制相关研究进展,并列举了影响地塞米松对该通路作用的因素。该方面研究的深入可能有望指导地塞米松临床应用的安全剂量范围并为脓毒症等疾病提供新的治疗思路。