单纯疱疹病毒2型ICP4基因荧光实时定量PCR检测方法的建立

目的 建立实时荧光PCR定量检测单纯疱疹病毒2型(HSV2)ICP4基因的方法.方法 依据HSV2 ICP4基因序列设计引物.PCR纯化后克隆到pMD-18T载体上进行测序,抽提重组质粒作为标准品.根据测序结果设计荧光定最PCR的引物和探针,质粒标准品10倍稀释后进行扩增,建立标准曲线,并进行灵敏度和可靠性分析.结果 测序结果显示在扩增的PCR片段中有在A-G无和T-C的无义突变.标准品101以下没有检测信号,101具有明确的检测信号,因而检测的灵敏度为10.可靠性测定结果:107-101进行10次重复Ct值的平均值分别为14.275±0.137、17.988±0.162、22.081±0.259、25.957±0.345、29.565±0.203、33.269±0.287、37.737±0.698,变异系数分别为0.965%、0.902%、1.174%、1.329%、0.686%、0.862%、1.851%.Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.回归系数为0.998.结论 成功建立了HSV2 ICP4基因实时定量荧光PCR检测的方法,灵敏度高,重复性好,可用于HSV2 ICP4基因的定量分析.     

应用荧光探针定量PCR检测生殖单纯疱疹病毒Ⅱ型的临床应用

目的:探讨荧光探针定量PCR检测生殖单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSVⅡ)在临床上的应用。方法:采用荧光探针定量聚合酶链反应(FQ-PCR)对93例临床诊断为生殖器单纯疱疹病毒感染者检测。结果:检出56例HSVⅡ阳性,阳性率60.22%。结论:FQ-PCR在检测生殖单纯疱疹病毒Ⅱ型的临床应用中具有快捷、特异性强的优点。     

鸭疱疹病毒1型实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立检测鸭疱疹病毒1型(鸭瘟病毒)的实时荧光定量PCR方法,为快速诊断、致病机理研究及抗病毒药物筛选等奠定基础。方法根据病毒DNA聚合酶基因的序列,设计引物和探针,采用TaqMan探针技术进行实时荧光定量PCR,用含有125bp扩增产物的pMD18-T载体质粒为阳性对照,构建标准曲线,对该方法的特异性、可重复性、敏感性进行评价,同时与传统PCR方法进行比较研究。结果标准曲线表明在2.3×105~2.3×10拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到23个阳性质粒,说明有很好的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为1.22~6.69以及2.09~8.84,说明有较好的重复性;对非鸭瘟病毒DNA无扩增,说明有很好的特异性;在对病毒DNA的检测方面,比传统PCR的敏感性高出104倍。结论成功建立了针对鸭瘟病毒的特异、敏感、重复性强且可准确定量的实时荧光定量PCR方法。     

荧光定量PCR检测孕妇单纯疱疹病毒的感染

目的探讨荧光定量PCR技术(Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction, FQ-PCR)检测孕妇单纯疱疹病毒(HSV)感染的临床诊断价值.方法45例怀疑HSV-Ⅱ感染的孕妇用ELISA法检测血清HSV-ⅡIgM,同时用FQ-PCR检测血清及宫颈分泌物HSV DNA.结果该组孕妇血清HSV-ⅡIgM阳性率为20.0%,血清HSV DNA阳性率为33.3%,后者检出阳性率明显高于前者(P＜0.05).宫颈分泌物标本HSV DNA阳性率为40.0%,明显高于血清ELISA检测阳性率(P＜0.05),但与血清FQ-PCR检出阳性率无显著性差异(P＞0.05).结论荧光定量PCR检测孕妇HSV DNA感染可以提高诊断率及准确率.     

荧光定量PCR同步检测人类疱疹病毒6,7,8型方法的建立

目的:建立同步检测人类疱疹病毒6,7,8型(HHV-6,-7,-8)的多重荧光定量PCR方法。方法:分别针对HHV-6,-7,-8的U67、U36、ORF65基因设计3对引物和3种Taq Man-LNA探针,构建三重荧光定量PCR反应体系,用于同步扩增HHV-6,-7,-8。分别应用HHV-6,-7,-8质粒建立对应标准曲线,并对多重荧光定量PCR方法进行线性范围、灵敏度、特异性、重复性和扩增效率等方法学评价。以DNA测序法为参考方法,检测45例疑似HHV感染者外周血单个有核细胞(PBMC)中的HHV-6,-7,-8,对多重荧光定量PCR方法进行临床特异性和敏感性评估。结果:多重荧光定量PCR方法检测HHV-6,-7,-8的线性范围均在10⁶-106-10⁽¹¹⁾Copies/L,相关系数均>0.99,灵敏度为8×10(11)Copies/L,相关系数均>0.99,灵敏度为8×10⁵Copies/L,最低检测限为5×105Copies/L,最低检测限为5×10⁵Copies/L,无非特异性扩增,线性范围内HHV-6,-7,-8的批间、批内变异系数(CV)均<5.5%;与单重荧光定量PCR相比,检测HHV-6,-7,-8质粒含量的相关性分别为0.980,0.987,0.965。以DNA测序方法为金标准,多重荧光定量PCR检测HHV-6,-7,-8的特异性均为100%,灵敏度分别是93.1%、80%、100%。结论:多重荧光定量PCR能够对HHV-6,-7,-8进行同步、快速和准确的定量检测,将在输血安全筛查方面有着广泛的应用前景。     

荧光定量PCR法检测生殖器疱疹病毒感染患者的结果及分析

目的：了解重庆地区疑有单纯疱疹病毒（HSV）感染患者的感染情况。方法：用荧光定量PCR法对422例疑有HSV感染的门诊患者进行检测。结果：（1）3个年龄段患者，即≤25岁，＞25岁并≤35岁，＞35岁的阳性率分别为27．93％（31／111）、23．65％（48／203）、15．74％（17／108），0．05＜P＜0．1，无差异。（2）男性患者和女性患者的阳性率分别为29．5％（41／139）和19．43％（55／238），P＜0．05，相差显著。（3）妇科、泌尿科、皮肤科就诊患者的阳性率分别为18．14％（41／226）、26．44％（23／87）、29．36％（32／109），P＜0．05，相差显著。结论：（1）重庆地区HSV感染率在男性患者和低龄人群（≤25岁）中发病率较高。（2）皮肤科患者的阳性率较其他两个科室为高。说明取标本的采取集部位十分重要。（3）FQ－PCR特异性高，灵敏度强，操作简单，时间短，结果客观准确，特别适宜于门诊患者快速检测诊断的需要。     

TaqMan 探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的： 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法：选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果：支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg/L,A260/Ａ280 (Ratio)为1
.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝/ μL。10 μmol/L的引物浓度和10 μmol/L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101 拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式：Ct= －2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论：支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。     

猫疱疹病毒Ⅰ型实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

目的建立猫疱疹病毒I型(FHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,应用于实验用猫及临床患猫FHV-1的快速检测。方法根据已发表的FHV-1 TK基因序列设计特异引物和Taq Man探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立FHV-1实时荧光定量PCR方法,并对方法的线性、特异性、敏感性、及稳定性等进行测定。用建立的方法对48份猫临床样品进行检测。结果成功建立FHV-1实时荧光定量PCR方法;该方法的线性范围为(1×102~1×109)copies/μL,与单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、犬疱疹病毒(CHV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猫细小病毒(FPV)均无交叉反应,检测灵敏度可达到10 copies/μL。批内变异系数均小于5%。应用该方法从48份猫临床样本中检测出33份FHV-1核酸阳性。结论建立的FHV-1PCR检测方法具有特异、敏感及稳定的特点,适合于临床FHV-1的快速定量检测。     

实时荧光定量TaqMan-PCR检测小鼠多瘤病毒方法的建立

目的 建立一种快速、特异、敏感的小鼠多瘤病毒 (murine polyomavirus, MPyV)荧光定量 TaqMan PCR检测方法, 用于MPyV核酸的检测。 方法 根据GenBank中小鼠多瘤病毒基因组序列设计了一对特异性引物及TaqMan探针, 扩增长度为69 bp的片段, 通过优化反应体系和反应条件, 对构建的重组质粒标准品进行检测, 并绘制标准曲线, 进行特异性、敏感性和重复性试验。最后用建立的方法对人工感染MPyV的肺脏、脾脏和粪便, 及86 份小鼠临床样本进行检测, 验证在临床应用中的效果。 结果 所建立的检测方法特异性强, 只能在小鼠多瘤病毒DNA中检出荧光信号, 检测灵敏度达到100拷贝, 批内和批间重复性好, 检测结果变异系数(CV)均小于1.13%, 人工感染MPyV小鼠的肺脏、脾脏和粪便均为阳性, 对86份临床样本进行检测, 有3份样本呈阳性(阳性率为3.5%)。 结论 建立的MPyV荧光定量TaqMan-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好, 适合用于MPyV临床诊断、日常监测和流行病学调查。     

实时荧光定量PCR鉴别检测单纯疱疹病毒方法的建立

目的:建立快捷、灵敏、特异的单纯疱疹病毒(HSV)的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测及分型方法。方法:选择HSV1和HSV2的糖蛋白B基因设计一对通用引物和对应的探针组建2个FQ-PCR反应体系,应用克隆的质粒建立系列标准品制作标准曲线,进行重复性和敏感性试验,以其他种类的细菌、病毒、真菌进行特异性分析,并用于检测生殖器疱疹患者的HSV1和HSV2。结果:HSV1和HSV2两标准曲线的线性检测范围均为105到1011Copies/L,相关系数均大于0.99,其他种类的细菌、病毒、真菌均未出现特异性扩增;48例生殖器疱疹患者疱液中HSV1和HSV2的检出率分别为6.3%(3/48)和87.5%(42/48)。结论:实时FQ-PCR法鉴别检测HSV1和HSV2,具有快速、特异、灵敏、便捷的特点,有助于HSV感染的流行病学和病理机制的研究;生殖器疱疹患者以HSV2感染为主。     

猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。     

胆汁螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立快速、敏感、特异的胆汁螺杆菌(Helicobacter bilis,H.bilis)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对胆汁螺杆菌进行定量检测。方法 PCR扩增H.bilis保守基因P17序列全长ORF435 bp,进行TA克隆,构建质粒标准品pMD-HBP17。通过对pMD-HBP17标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性及重复性;用所建立的qPCR方法检测77份临床样品,并与普通PCR的检测结果作比对。结果 所建立的qPCR检测方法,质粒DNA浓度在10⁸~10¹拷贝之间表现出较好的线性和相关性,所得标准曲线的斜率为-3.46,相关系数为0.999,检测灵敏度达到20个拷贝,对77份临床样品的检出率为14.3%,较普通PCR(7.8%)的检出率高。结论 建立的H.bilis qPCR检测方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可用于胆汁螺杆菌的定量及定性检测。     

多探针荧光定量PCR法用于慢性前列腺炎病原菌学诊断的建立

目的建立一种新的改良的TaqMan荧光定量PCR方法，能高度敏感地同时检测并鉴定多种细菌．该方法有一套独特的多探针设计：一对由16SrDNA基因编码的高度保守序列作为引物；引物之间的一个高度保守区域被用来设计通用探针，一个高度可变区域被用来设计特异性探针．方法通过对10种慢性前列腺炎病人细菌培养常见的病原菌的DNA提取物进行FQ-FCR（荧光定量PCR）检测，用通用探针检测这10种细菌的DNA含量，在此同时用金黄色葡萄球菌特异性探针（SA probe）和大肠杆菌特异性探针（EC probe）分别特异性检测金黄色葡萄球菌（S．aureus）和大肠杆菌（E．coil）的DNA含量．[第一段]     

应用FQ-PCR方法检测单纯疱疹病毒-Ⅱ型DNA的研究

目的:了解广东省深圳市某区人群单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)的感染状况。方法:采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术测定HSV-ⅡDNA。结果:性传播疾病(性病)患者的HSV-ⅡDNA阳性检出率:35.34%( 464/1 313);正常对照组的HSV-ⅡDNA检出率:12.20%(15/123)两组的HSV-ⅡDNA检出率,患者组明显高于对照组(P<0.01)。结论:不同人群HSV的感染状况不同,正常人群中存在HSV-Ⅱ感染,HSV-Ⅱ是性病的重要病原体之一。     

结核分枝杆菌自身淬灭探针荧光定量PCR检测方法的建立

目的利用自身淬灭探针技术建立敏感、特异、快速、价廉且能广泛应用的结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法。方法构建重组质粒PET-32a（＋）-16srRNA作为标准品,自行设计自身淬灭探针,建立、优化定量PCR体系。并进行方法学评价及临床应用。结果所建立方法的线性检测范围为102～109copies／μL,灵敏度为lcopy／μL,特异性为100％。高拷贝样品的天问CV为2．65％、批内CV为1．86％,低拷贝样品的天间CV为2．12％、批内CV为0．78％。该方法比培养方法更快速、灵敏。结论以自身淬灭探针技术为平台的结核分枝杆菌荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,对结核病的早期快速诊断有较高价值。     

ELISA法检测单纯疱疹病毒Ⅱ型特异性抗体的临床应用研究

目的 探讨单纯疱疹病毒Ⅱ型（ＨＳＶ－２）感染的早期特异检测手段。方法 对５２例性病门诊的生殖器疱疹患者改良的ＥＬＩＳＡ方法进行了ＨＳＶ－ｇＤ２ＩｇＧ检测并同细胞分离方法进行对比观察。结果 病毒分离的阳性率为６９．２％,ＥＬＩＳＡ法检测抗体的阳性率６５％,两种方法检测结果差异无显著性。结论：ＥＬＩＳＡ法检测血清疱疹病毒ＩｇＧ抗体具有简便,快速,特异的优点,适合于临床大规模检测之有     

荧光定量PCR检测献血人员外周血白细胞中人疱疹病毒DNA

目的 调查献血人员外周血白细胞中8种人疱疹病毒的DNA分布情况,为我国献血者健康标准要求的完善提供参考性实验数据.方法 收集献血人员外周血标本427例,分离外周血白细胞后提取DNA,使用Taqman探针法荧光定量PCR检测方法对8种疱疹病毒DNA的阳性率和病毒载量进行检测.结果 427例标本中未检测到单纯疱疹病毒1型(HSV1)、HSV2、水痘-带状疱疹病毒(vZv)和人疱疹病毒8型(HHV-8)的DNA,EB病毒(EBV)、人巨细胞病毒(HCMV)、HHV-6、HHV-7阳性率分别为51.4％、6.5％、50.6％、21.1％,其中HCMV、EBV和HHV-6均阳性的标本占6.5％,EBV和HHV-6均阳性的标本占25.1％,EBV与HHV-7均阳性的标本占4.0％,HHV-6和HHV-7均阳性的标本占6.9％.EBV、HCMV、HHV-6、HHV-7的病毒载量中位数分别为559、336、4 683、1 126 gqe/ml外周血.在不同性别和年龄组中EBV、HHV-6和HHV-7在三个年龄组中的检出率差异无统计学意义,但CMV的检出率随年龄的增加逐渐升高,差异有统计学意义(P＜0.05).市区与郊区人群相比EBV、HCMV、HHV-6和HHV-7的检出率均显著较低(OR=0.657、0.798、0.889、0.721,95％ CI:0.147 ～2.451、0.224～2.196、0.221 ～2.703、0.194 ～ 2.445,P ＜0.05).结论 在献血人员外周血白细胞中可以检出多种疱疹病毒DNA,提示我国献血者健康标准要适时考虑献血者疱疹病毒感染的情况.     

荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒的临床意义

目的 :对荧光定量 PCR(FQ- PCR)测定的 10 2例 HBV- DNA结果进行分析 ,以探讨其临床价值。方法 :对 10 2份临床血清标本用 FQ- PCR方法进行 HBV- DNA定量测定 ,并和 EL ISA两对半结果以及 AL T结果进行比较分析。结果 :2 5份 HBs Ag(+)、HBe Ag(+)、HBc Ab(+)的标本 HBV- DNA均为阳性 ,L og DNA平均值± 2 sd为 7.45± 2 .5 4;34份 HBs Ag(+)、HBe Ab(+)、HBc Ab(+)的标本 HBV- DNA阳性 15份 ,L og DNA平均值± 2 sd为 6 .33± 1.86 ;9份HBs Ag(+)、HBc Ab(+)的标本 HBV- DNA阳性 4例 ,L og DNA平均值± 2 sd为 5 .2 3± 4.6 0 ;14份 HBs Ab(+)的标本 HBV- DNA阳性 1例 ,18份全阴性的标本 HBV- DNA无阳性。以上五种两对半结果其相对应的 HBV- DNA值基本呈下降趋势 ,而且前二者之间有显著性差异 (P<0 .0 1)。急性乙型病毒性肝炎、慢性乙型病毒性肝炎、肝癌、肝硬化患者之间的 HVB- DNA定量结果无显著性差异。HBV- DNA和 AL T之间无相关性 (r=0 .17)。结论 :FQ- PCR定量测定HBV- DNA可以真实反应 HBV的感染和复制情况 ,可以用于临床治疗和疗效观察 ,但它在急性乙型病毒性肝炎、慢性乙型病毒性肝炎、肝癌、肝硬化的鉴别诊断上无帮助 ,和病情的轻重也无相关性。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型宫内感染的前瞻性研究

单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV—Ⅱ)感染是性传播疾病，由于我国性病发病率现呈上升趋势，故由感染母亲垂直传播引起的胎儿、新生儿HSV—Ⅱ感染已受到围产医学界的关注。本研究采用PCR和ELISA等方法，前瞻性观察HSV-Ⅱ对孕妇感染、母婴传播及先天感染患儿的近期影响，现报道如下。