外周血内皮祖细胞磁探针标记及体外磁共振成像的实验研究

目的应用纳米磁探针三氧化二铁（Fe2O3）-多聚赖氨酸（PLL）复合物体外标记兔外周血内皮祖细胞（EPCs）,磁共振（MR）对标记细胞成像。方法合成Fe2O3-PLL复合物。分离兔外周血单个核细胞,贴壁法筛选出EPCs,传代培养,Fe2O3-PLL标记祖细胞,普鲁士蓝染色、电子显微镜显示细胞内铁,四氮噻唑蓝（MTT）比色试验评价不同浓度Fe2O3-PLL标记EPCs后对细胞生长状况的影响,流式细胞分析检测标记、未标记细胞的细胞周期、细胞凋亡,应用MR的不同序列进行细胞群成像。结果普鲁士蓝染色、电镜观察均可见铁颗粒位于细胞质内,标记率接近100％,MTT比色试验示10μg／ml至200μg／ml7个铁浓度组,Fe2O3-PLL标记后细胞的光吸收值与未标记者比较,差异无统计学意义,流式细胞分析结果显示Fe2O3-PLL标记后细胞周期、细胞凋亡与未标记细胞间差异无统计学意义。磁共振成像（MRI）显示标记Fe2O3-PLL的细胞群较未标记者信号降低,以T2^＋加权像（FWI）信号强度变化率最大;标记后7d的信号强度变化率均较标记1d者下降。结论Fe2O3-PLL可以有效标记兔外周血EPCs,其对细胞的活力、增殖等生物学特性无明显影响。临床应用型1．5TMR可在体外进行标记细胞群成像,间接反映于细胞的数量和分裂增殖状态。     

菲立磁标记猪骨髓间充质干细胞自体肝内移植的MR成像

目的:探索标记细胞肝内移植后磁共振威像技术.方法:获取猪自体骨髓间充质干细胞,分离、培养.应用菲立磁(Feridex)标记细胞,普鲁士蓝染色鉴定,标记细胞组n=6)和未标记细胞组(n=4)行经门静脉行肝内移植,分别于移植前,移植后6h、3 d、7d行磁共振T1WI,T2WI,T2*WI序列成像,同时行组织切片普鲁士蓝染色结果:普鲁士蓝染色表明MSCs的标记率达接近100%,磁标记MSCs肝内移植后行磁共振T2*WI序列呈明显低信号改变,并持续至细胞移植后7 d,组织切片普鲁士蓝染色显示7 d后肝内仍有移植的磁标记细胞存在于肝实质及肝血窦中.结论:利用Feridex可以在体外成功标记猪骨髓间充质干细胞,肝脏移植后行磁共振可以对标记细胞进行活体成像.     

小鼠脾源性内皮祖细胞培养及7.0T磁共振单细胞成像初探

目的 建立一种小鼠脾源性内皮祖细胞的培养方法,探讨7.0T磁共振(7.0T MR)系统对磁标记单细胞成像的可行性.方法 密度梯度离心法分离脾脏单个核细胞,诱导培养得到内皮祖细胞(EPC).免疫化学、荧光染色鉴定细胞特性.Fe_2O_3-PLL标记细胞,普鲁士蓝染色,MTT法评价Fe_2O_3-PLL对细胞生长的影响,邻菲啰啉法定量分析细胞内铁含量.7.0T MR不同序列体外单细胞成像.结果 小鼠脾脏单个核细胞经体外诱导培养呈内皮细胞形态,表达EPC表面标志物CD31、CD34、vWF,显示内吞乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)、结合凝集素1(UEA-1)等内皮细胞的功能.MTT检测Fe_2O_3-PLL标记对细胞增殖活力影响不明显,标记组与未标记组吸光度(A)值比较第4天至第7天差异均无统计学意义(第4天,t=2.81;第5天,t=-1.87;第6天,t=-0.298;第7天,t=-0.115;P均＞0.05).磁标记单细胞能够在7.0T MR检测中成像,自旋回波序列(MSME)图像中标记细胞显示灰度高于梯度回波序列(2D-FLASH),MSME序列图像标记细胞平均导致信号缺失体素个数为20.2个,而2D-FLASH序列图像为30.1个,差异具有统计学意义(t=15.2,P＜0.05).结论 小鼠脾脏单个核细胞可诱导分化为EPC.在7.0T MR检测中Fe_2O_3-PLL标记的EPC能够实现体外单细胞成像.     

小型猪骨髓间充质干细胞超顺磁氧化铁、增强型绿色荧光蛋白双标记及体外磁共振成像示踪的研究

目的 探讨超顺磁氧化铁(SPIO)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)体外双标记、磁共振成像(MRI)示踪1型糖尿病(T1DM)小型猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可行性和标记方法.方法 采集T1DM小型猪骨髓,密度梯度离心和贴壁培养法分离BMSCs.选用携带EGFP慢病毒(LV)颗粒转染BMSCs.选用SPIO和左旋多聚赖氨酸(PLL)复合物标记LV-EGFP转染的BMSCs.对SPIO标记细胞进行普鲁士蓝染色、透射电镜观察和体外MRI.结果 LV-EGFP与BMSCs转染复数(MOI)为30∶1转染后96 h荧光表达最强,阳性转染率43.2%.Fe3+标记浓度为25 mg/L BMSCs阳性标记率93.1%.透射电镜检测发现,SPIO粒子密集于BMSCs细胞质,次级溶酶体内多见.MRI显示,Fe3+标记浓度为25 mg/L、1×104/ml细胞浓度标记后3周和6周在快速自旋回波序列(TSE)T1WI、TSET2WI及快速小角度激发成像(FLASH)T2*WI信号强度变化率(△SI)依次为12%、41%、63%和7%、28%、46%,均为后二者大于前者(分别P＜0.01和P＜0.05),提示SPIO该标记浓度和细胞密度标记后3周和6周在T2WI及T2*WI呈现较明显的信号变化.结论 采用体外EGFP和SPIO双重标记的方法,结合MRI和细胞化学染色法可以稳定地对T1DM小型猪BMSCs进行体外示踪.

Abstract：

Objectives To track bone marrow stem cells (BMSCs) labeled by enhanced green fluorescent protein (EGFP) and superparamagnetic iron oxide ( SPIO ) -poly-L-lysine (PLL) compound by MRI in vitro for autotransplantation into pancreas of type 1 diabetes miniature pigs. Methods The BMSCs were isolated by density gradient centrifugation and attachment culture from type 1 diabetes minipigs' bone marrow. Expressional intensity of EGFP in BMSCs transfected lentivirus-EGFP with a multiplicity of infection Different magnetic resonance scanning protocols were carried out on various density BMSCs labeled by different concentration of SPIO in various time-point in vitro. Results When SPIO concentration was 25mg/L (count in Fe3 + ), the positive Fe3+ -labeling rate of BMSCs was 93. 1%. Most of SPIO particles in BMSCs' cytoplasm were observed in secondary lysosomes, but they were not detected in important organelle as cell nucleus. Comparing with gelatin the MRI of BMSCs labeled with SPIO in the condition with 1 ×104/ml cells density and 25 mg/L Fe3+ concentration in vitro, the signal intensity changes (△SI) after BMSCs labeled with SPIO 3 weeks and 6 weeks in TSE T1WI, TSE T2WI and FLASH T2 * WI sequences were 12%, 41%, 63% and 7%, 28%, 46% respectively (P ＜ 0.01 and P ＜ 0.05, respectively).Conclusions The data showed that the porcine BMSCs labeled with SPIO and EGFP could be traced successfully in vitro by MRI in the suitable sequences.     

Mesothelin抗体修饰的纳米探针对人胰腺癌细胞BxPC3的体外靶向研究

目的 探讨间皮素（Mesothelin）抗体修饰的荧光纳米Fe3O4@SiO2探针对人胰腺癌细胞BxPC3的靶向性能.方法 经St（o）ber法制备Fe3O4@SiO2磁核,再依次交联CdTe量子点和Mesothelin抗体,获得靶向荧光Fe3O4@SiO2纳米探针.在体外将荧光纳米Fe3O4@SiO2探针与BxPC3细胞共孵育30 min,以低表达Mesothelin的HepG-2和K562细胞作为对照,通过电荷耦合器件（CCD）成像系统和磁分离技术评估探针与癌细胞的靶向吸附性能.结果 制备的荧光纳米Fe3O4@SiO2探针颗粒大小均匀,粒径主要为120 ～ 140 nm.未交联抗体的探针与BxPC3、HepG-2、K562细胞的吸附效率均低于20％,为非特异性吸附.交联Mesothelin抗体的探针与BxPC3、HepG-2、K562细胞的吸附效率分别为（53.9±1.8）％、（8.0±2.1）％、（8.9±2.3）％,其与BxPC3细胞的吸附能力显著提高.结论 Mesothelin抗体修饰的纳米探针可有效识别高表达Mesothelin的BxPC3细胞.     

超顺磁性氧化铁标记间充质干细胞心肌移植的磁共振成像研究

目的探讨应用磁共振（MR）进行干细胞活体心肌内成像的可行性。方法从猪骨髓抽取、分离、培养间充质干细胞（MSC）,用含超顺磁性氧化铁纳米颗粒（铁羧葡胺）的DMEM培养液孵育24h,并用二脒基苯基吲哚（DAPI）和PKH。进行荧光标记。然后将MSC经心外膜直接注入猪急性梗死心肌内,每头猪注射3点。根据每注射点细胞数量以及细胞是否铁标记,12头猪随机分成4组：2×10^6标记细胞组（n=3）、1×10^6标记细胞组（n=3）、5×10^5标记细胞组（n=3）和1×10^6未标记细胞组（n=3）。细胞移植后20—24h行猪心脏1．5TMR成像,1h后处死并根据MR成像图像切取心肌组织行普鲁士蓝染色和免疫荧光检查。结果（1）体外标记：普鲁士蓝染色见标记MSC内大量蓝色颗粒,标记率为100％,电镜证实含铁囊泡位于胞质内。（2）MR成像：注射铁标记细胞的三组（9头猪）进行活体心脏快速小角度翻转梯度回波（T2·WI—Flash 2d）序列成像,发现移植部位均呈明显的低信号,而且注射点信号缺失区的面积大小与回波时间和移植细胞数量有关;而快速自旋回波（T2WI—FSE）序列成像仅隐约可见低信号区甚至难以辨认,但显示梗死病灶和猪心脏结构比T2·WI-Flash 2d序列清晰。未标记细胞组（3头猪）的9个注射点心肌壁均未显示MR低信号区。（3）组织学检查：MR成像低信号区心肌病理学检查见普鲁士蓝染色、DAPI和PKH26三重阳性细胞存在。结论应用磁共振对超顺磁性氧化铁标记的干细胞进行活体心肌内成像是可行的。     

VEGFR-2靶向超顺磁性氧化铁磁性纳米探针构建及肝癌细胞磁共振分子成像

目的制备血管内皮生长因子受体(VEGFR)-2靶向磁共振(MR)分子探针,探讨其对肝癌细胞的特异性靶向作用。方法采用共沉淀法制备超顺磁性氧化铁(SPIO),用壳聚糖对其表面进行修饰,耦联anti-VEGFR2抗体,制备VEGFR-2靶向MR分子探针(anti-VEGFR2-CS@SPION),以未修饰的SPIO纳米粒作为对照组。DLS法测量粒径大小、分布及Zeta电位,3.0T MR检测T2弛豫率。MTT法评价探针的安全性,通过激光共聚焦显微镜检测以及普鲁士蓝染色的方法验证探针与肝癌细胞结合的特异性。3.0T MR观察探针的体外MR成像能力。结果 SPIO和antiVEGFR2-CS@SPION的粒径分别为20.6 nm和38.4 nm;Zeta电位分别为-(20.3±1.32)m V、(3.58±1.28)m V。T2弛豫率分别为0.179×10~6M~(-1)S~(-1)、0.201×106M~(-1)S~(-1)。细胞毒性实验表明探针在高浓度下对细胞没有毒性;激光共聚焦显微镜检测显示,抗体探针与Hep G2细胞特异性结合;antiVEGFR2-CS@SPION与Hep G2细胞孵育后经普鲁士蓝染色,细胞内见较多的蓝染颗粒,而单纯SPIO组细胞内未见蓝色颗粒。体外MR成像显示,anti-VEGFR2-CS@SPION组、单纯SPIO组和空白对照组的T2值分别为(55.6±1.4)ms、(99.8±0.77)ms和(110.8±0.95)ms,差异有统计学意义(F=317.547,P<0.01)。结论壳聚糖修饰和SPIO标记的anti-VEGFR2抗体探针具有良好的生物学特性和体外肝癌细胞MR显像能力。     

葡萄糖受体介导的肿瘤靶向2-DG修饰超顺磁性氧化铁的制备及体外实验

目的 合成一种2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)包被γ-Fe2O3纳米探针,检测其性质特征及对前列腺癌PC3细胞葡萄糖受体的靶向性摄取.方法 运用化学共沉淀法合成γ-Fe2O3@二巯基丁二酸(DMSA),再与2-DG共轭生成γ-Fe2O3@DMSA-DG,红外光谱和透射电镜检测粒子结构特征;噻唑蓝试验(MTT)法进行细胞毒性实验,分别加入含无糖DMEM的探针培养基γ-Fe2O3@DMSA、γ-Fe2O3@DMSA-DG、γ-Fe2O3@DMSA-DG+ 2-DG(4.5 mg/mL),将探针在不同时间( 10 min、20 min、1h、2h)孵育PC3细胞,运用普鲁士兰染色法和铁三嗪法分析PC3细胞对探针的吸收情况,并以体外MRI观察T2WI信号强度变化.结果 2-DG以酰胺键连接γ-Fe2O3@DMSA,粒子平均直径10 mm;探针未见明显毒性;γ-Fe2O3@DMSA-DG可被PC3细胞靶向摄取,并可在早期被2-DG抑制.结论 本研究成功合成γ-Fe2O3@DMSA-DG探针,其对PC3细胞葡萄糖受体有较好的靶向性,使用临床型MR仪可对其进行监测.     

磁共振成像R2*map示踪超顺磁性氧化铁标记的内皮祖细胞

目的 探讨R2*map在超顺磁性氧化铁(SPIO)标记内皮祖细胞(EPCs)定量检测中的价值.方法 分离和培养Balb/c小鼠后肢骨髓来源的EPCs,培养7 d,用细胞膜红色荧光探针标记的乙酰低密度脂蛋白和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素-1双阳性染色法,以及异硫氰酸荧光素标记干细胞抗原1和藻红素标记的血管内皮细胞生长因子受体2的方法上流式细胞仪进行鉴定.用50 μg/ml SPIO及6 μl/ml lipofectamine 2000与EPCs共孵育进行标记后透射电子显微镜观察;制成不同细胞浓度(0～2.0×106/ml)标记及未标记SPIO的细胞琼脂糖模型,进行3.0T磁共振扫描,包括T2*map和T2map扫描,得到R2*map和R2map图像.结果 培养7d后细胞呈现内皮祖细胞特征.SPIO标记的EPCs细胞结构与未标记细胞相比较,无明显改变.R2*和R2值与标记SPIO的细胞浓度呈线性相关(r值分别为0.955,0.922,P值均<0.05);R2*效应明显高于R2效应(t=23.23,P<0.05).结论 磁共振成像R2*map扫描可准确定量示踪SPIO标记的EPCs.     

内皮祖细胞磁性标记及MR示踪在大鼠脑胶质瘤血管生成研究中的应用

目的探讨内皮祖细胞磁性标记及磁共振成像(MR)示踪在大鼠脑胶质瘤血管生成研究中的应用。方法通过C6胶质瘤细胞株系定位注射建立大鼠脑胶质瘤模型。结果未磁性标记的内皮祖细胞T2*map序列下肿瘤区见线状针道信号,肿瘤组织在T2*map序列未见明显异常的信号,而磁性标记的内皮祖细胞T2WI和T2*map扫描下发现瘤周异于针道信号的间断线状低信号,并可见信号变弱的趋势,迁移后的内皮祖细胞在血管生成处定位。结论 USPIO对于内皮祖细胞磁性标记和MR示踪是一种有效的标记物,而MRI也是活体示踪观察USPIO标记脑胶质瘤血管生成的有效手段。     

磁共振成像示踪观察脑缺血大鼠脑室内移植神经干细胞的实验研究

目的探讨MRI示踪观察脑缺血大鼠脑室内移植的标记神经干细胞的分布和迁移的可行性。方法选取16只雄性SD大鼠制做脑梗死模型,随机分为标记组和未标记组,每组8只,分别于脑梗死对侧侧脑室内立体定向移植超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记和未经标记的神经干细胞。移植细胞后,不同时间点分别进行MRI连续成像观察,之后进行大鼠脑组织冷冻切片的普鲁士蓝染色。结果标记组移植后即刻的MRI即可观察到大鼠侧脑室内的移植标记细胞,移植后7天脑梗死皮质下即可见到低信号影,各对应时间点组织切片的普鲁士蓝染色与MRI结果相符。结论MRI能够在活体内连续无创的示踪观察大鼠侧脑室移植的标记神经干细胞的迁移及分布情况。     

In vivo imaging of bone marrow mesenchymal stem cells transplanted into myocardium using magnetic resonance imaging: a novel method to trace the transplanted cells

Background: In vivo imaging of the cells transplanted into the beating heart is very important for the study of the cell's retention, migration. This study was designed to find a new labeling agent to trace and visualize the transplanted cells in vivo. Method: BMMSCs were incubated with SPIO for 48 h. The labeling efficiency was tested through Prussian blue staining, the growth ability was evaluated through MTT, and the cells viability was tested through Trypan blue rejection method, the migratory ability was assessed with Costar Transwell plates. After 10 days of coronary ligation of the Chinese mini swine, the labeled or unlabeled cells were transplanted into the myocardium. The MRI was carried out immediately and 1–4 weeks, respectively. After MRI the hearts were excised, the segment in which injections were performed were thin cut and stained with hematoxylin-eosin and Prussian blue staining. Results: There were intracytoplasmatic blue particles in nearly every cell in the Prussian blue staining. SPIO had no poison effect on the cells' growth and proliferation. The cells' viability was more than 95%. The migratory ability was not affected. The injected sites containing labeled cells could all be detected through MRI and were confirmed on pathology. After 4 weeks the injected labeled cells could still be detected through MRI. The pathology showed the injected cells could survive in the MI area, and parallel in the same direction. Conclusion: The cells could be efficiently and safely labeled with SPIO and the labeled cells could be reliably detected by MRI in vivo.     

细胞磁共振成像不能区分磁标细胞的存活状态

目的探讨不同状态下磁标记间充质干细胞(MSCs)的体内外磁共振(MR)成像特点,明确MR对细胞存活状态是否有鉴别诊断价值。方法分离培养猪骨髓MSCs,用超顺磁性铁纳米颗粒(SPIO)标记细胞24h。对未标记MSCs、存活的SPIO-MSCs、死亡的SPIO-MSCs、单纯SPIO进行体外凝胶内1.5TMR成像;开胸结扎前降支建立猪心肌梗死模型,于梗死交界区心肌内直接注射未标记MSCs、存活的SPIO-MSCs、死亡的SPIO-MSCs和单纯SPIO,然后进行体内T2*WI-flash序列MR成像。结果存活的SPIO-MSCs、死亡的SPIO-MSCs和单纯SPIO在体内外T2*WI-flash序列MR图像上均显示为低信号区,单凭图像无法区分。结论细胞MR成像无法区分组织磁标细胞、游离铁和含铁病变,因此对长期细胞示踪结果的解读应该慎重。     

内皮祖细胞促动脉内皮损伤修复的研究

目的评价骨髓源性内皮祖细胞(progenitor endothelial cells,EPCs)移植促动脉损伤内皮修复的效果。方法将菲立磁(superparam agnetic iron oxide,SPIO)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)双标记的EPC局部注入损伤颈动脉段腔内。术后1d、7d和28d行磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)扫描、组织学检查及内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)检测。结果MRI扫描发现移植部位出现低信号区。移植组HE、普鲁士蓝、vWF免疫组化染色、GFP荧光、偶氮蓝(Evans blue)染色均提示EPC可粘附于内膜损伤处,并随时间分化为内皮细胞;同时eNOS表达随时间变化而增多。结论菲立磁标记内皮祖细胞可促进动脉损伤内皮的修复,并可为MRI示踪。     

磁标记大鼠间充质干细胞肝脏移植的磁共振成像活体示踪

目的探讨1.5 T MRI活体示踪磁标记干细胞经门静脉肝脏移植的可行性。方法大鼠间充质干细胞以菲立磁和DAPI标记后,经门静脉注入大鼠肝脏,分别于移植前及移植后1 h、3 d、7 d和14 d行MRI扫描,并与组织荧光显像和铁染色对照。结果移植后1 h、3 d、7 d及14 d肝脏信噪比分别为1.10±0.26、8.18±1.55、11.08±1.30、14.15±1.02,7 d以内肝脏信噪比与移植前比较均有明显降低(P<0.05)。各时相肝组织铁染色与荧光显像的空间分布一致。结论1.5 T MRI活体示踪经门静脉移植的磁标记干细胞是可行的,MRI示踪时间可持续7 d。