成年大鼠海马神经前体细胞的体外培养及诱导分化

目的 建立成年大鼠海马神经前体细胞的体外培养方法并探讨其生物学特性。方法 使用加入bFGF(20ng／ml)的无血清培养基培养成年大鼠海马神经前体细胞，MTT法检测细胞生长曲线．BrdU标记和免疫荧光化学方法观察培养细胞生物学特性。结果 加入bFGF培养的成年大鼠海马组织细胞可表达Nestin，具有稳定连续的克隆增殖能力。经诱导分化后的细胞可表达神经元和胶质细胞的特异性标志物。结论 本实验分离的培养细胞具有可在体外稳定自我复制、大量增殖和多向分化潜能的特点．是理想的神经前体细胞。     

大鼠骨髓间质干细胞的BrdU体外标记和体内示踪研究

目的探讨骨髓间质干细胞(BMSCs)的体外标记和体内示踪技术。方法分离培养并鉴定大鼠BMSCs,进行5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记后,体外培养被标记的BMSCs,观察其连续传代后的BrdU可标记时间和标记效率;建立大鼠胃黏膜损伤模型,将分离纯化的BrdU标记BMSCs移植到损伤的胃黏膜下,体内观察BrdU对活体移植BMSCs的示踪作用。结果免疫组化显示体外培养大鼠BMSCs的CD44、CD90表达阳性,CD14、CD45表达阴性,显微结构表现出干细胞特征。进行BrdU标记后,标记阳性率随标记时间延长而增高,48h达高峰,72h仍维持高阳性率。终浓度为10μmol/L的BrdU孵育48h、72h阳性标记率高于5μmol/L BrdU组(P<0.05),但与15μmol/L BrdU组阳性标记率差异无统计学意义(P>0.05),并且连续传代培养21d后也可检测到。BrdU可示踪BMSCs在损伤的胃黏膜下局部定植。结论 BrdU在浓度为10μmol/L、标记时间48h至72h标记效率较高;BrdU标记可用于一定时间段内BMSCs移植入体内后定植和生长的动态示踪观察方法。     

局灶性脑缺血大鼠学习记忆能力与海马齿状回nNOS表达的关系

目的观察局灶性脑缺血再灌注大鼠学习记忆与海马齿状回神经元型一氧化氮合酶（nNOS）表达的关系。方法大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，5-溴脱氧尿核苷（Brdu）标记分裂增殖细胞，应用Y型电迷宫监测大鼠学习记忆能力，免疫组化单标和双标技术检测大鼠海马齿状回BrdU阳性细胞数和nNOS的表达。结果局灶性脑缺血再灌注对学习记忆能力损害明显，但随着再灌注时问的延长学习记忆能力有较好恢复，再灌注28d恢复明显。海马齿状回Brdu阳性细胞增加，14d达高峰；再灌注后7d nNOS表达增强，28d达高峰，BrdU／nNOS双标细胞在14d达高峰。结论局灶性脑缺血再灌注可增强大鼠海马齿状回细胞的增殖能力，增殖细胞nNOS的表达对大鼠学习记忆能力恢复有促进作用。     

外加直流电场对脑卒中大鼠侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖与迁移的影响

目的观察外加直流电场对脑卒中大鼠侧脑室室管膜下区(SVZ)神经干细胞增殖与迁移的影响,为将直流电场刺激法用于脑修复治疗提供理论依据。方法将60只Sprague Dawley雄性大鼠随机分为正常对照组、假手术组、假手术+直流电场组、缺血再灌注组和缺血再灌注+直流电场组,每组12只。正常对照组:不做任何特殊处理;假手术组:进行缺血手术操作,不留置线栓但放置电极;缺血再灌注组:仅进行缺血再灌注手术操作;假手术+直流电场组:进行缺血手术操作,并予以直流电场刺激,参数50μA,每天60 min;缺血再灌注+直流电场组:进行缺血再灌注手术操作,并予以直流电场刺激,参数50μA,每天60 min,各组取材时间为缺血后14 d(6只),缺血后42 d(6只)。免疫荧光细胞化学技术检测SVZ神经干细胞的增殖与迁移,尼氏染色方法检测脑缺血区神经元损伤情况,采用动物行为学实验方法检测直流电场刺激后脑卒中动物神经功能恢复状况。结果与无电场刺激的假手术组和缺血再灌注组相比,直流电场刺激明显增加假手术组和缺血再灌注组神经干细胞在SVZ的增殖(P<0.05);与无电场刺激的缺血再灌注组相比,直流电场刺激明显增加缺血再灌注组SVZ神经干细胞向缺血区(即电极负极放置方向)迁移(P<0.05);与无电场刺激的假手术组和缺血再灌注组相比,直流电场刺激明显减轻缺血区神经元损伤(P<0.05);与无电场刺激的假手术组和缺血再灌注组相比,直流电场刺激明显改善脑卒中动物的神经行为学表现(P<0.05)。结论直流电场刺激能够明显改善脑卒中动物神经功能的恢复,可用于脑修复治疗。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外的诱导分化及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记MSCs的可行性. 方法:利用密度为1.073 kg/L的percoll分离骨髓的单个核细胞,体外培养与扩增MSCs;取生长良好的第3代细胞,用成骨细胞分化培养液培养21 d,Ⅰ型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶(AKP)组化染色;分别以浓度为5,10和15 μmol/L的Brdu溶液标记MSCs,孵育12,24,48,72和96 h后免疫组化检测Brdu,确定最佳标记量和最佳标记时间. 结果:诱导分化第21日, AKP染色呈强阳色,Ⅰ型胶原免疫染色呈阳性. 10 μmol/L Brdu标记MSCs的效果最好,随着孵育时间的延长,Brdu标记率逐渐增高,标记72 h后标记率在90%以上. 结论:MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化为成骨细胞,用Brdu标记MSCs的最佳浓度为10 μmol/L,最佳时间是72 h.     

康复训练联合神经生长因子对脑出血大鼠肢体功能的影响

【摘要】 目的 观察康复训练联合神经生长因子（NGF）治疗脑出血大鼠后平衡木测评、转棒行走测评及网屏实验的变化情况。探讨康复训练联合神经生长因子治疗脑出血的作用机制。方法 将健康成年雄性SD大白鼠96只,随机分为对照组、康复训练组、NGF治疗组（腹腔内注射神经生长因子30ug/kg）和康复训练联合NGF治疗组,每组各24只。采用胶原酶诱导法建立大鼠脑出血动物模型。动物造模成功后分别按上述分组采用大鼠运动训练器材进行平衡、 旋转、抓握训练等治疗,并分别于第1、2周及第3周后采用平衡木行走测评、转棒行走测评、网屏实验评定运动功能,并观察不同治疗组对脑出血大鼠运动功能的影响。结果 康复训练联合NGF治疗组平衡木行走测试、转棒行走测评、网屏实验评定均高于康复训练组、NGF治疗组差异均有统计学意义（P均＜005）。结论 康复训练和NGF单独治疗及联合应用治疗对脑出血大鼠神经功能恢复均有改善作用,但康复训练联合NGF治疗效果更佳且具有协同作用。     

Noggin基因对成年大鼠海马神经前体细胞增殖的影响

目的 探讨noggin基因对成年海马BrdU标记细胞的调控。方法 原位杂交与RT-PCR检测noggin基因在海马的表达，免疫组化检测BrdU标记细胞数，反义技术阻断内源性noggin基因表达。结果 侧脑室注射反义寡核苷酸后，成年大鼠海马内noggin mRNA阳性细胞数明显降低，而BMP4mRNA阳性细胞数无明显变化，同时大鼠海马齿回及齿回颗粒下区的BrdU阳性细胞数均较正常对照组明显降低，正义寡核苷酸无此效应。结论 内源性noggin可促进成年内海马神经前体细胞的增殖。     

谷氨酸对NSCs向神经元分化的影响

【目的】 探讨Glu对NSCs向神经元分化的影响。 【方法】 分离培养孕15 d SD大鼠皮质NSCs,将传至第4代的NSCs行NR1细胞流式分析并以1×10⁵个/mL的密度,接种于置有包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板各孔内分化培养,分为control、Glu、Glu⁺MK-801(0 h)(0 h加MK-801)、Glu⁺MK-801(24 h)(24 h加MK-801)组培养1、3、7、14 d后行DCX/Hoechst、TUNEL/Hoechst、MAP-2/Hoechst免疫荧光双标检测。 【结果】 43%的NSCs NMDA受体主要功能亚基NR1阳性;1 d时Glu组、Glu⁺MK-801(24 h)组DCX神经元前体细胞明显多于control、Glu⁺MK-801(0 h)组,3 d时MK-801(24 h)组DCX神经元前体细胞最多,Glu组DCX神经元前体细胞数量有所下降,但多于其余两组,至7 d时MK-801(24 h)组DCX神经元前体细胞仍较多,Glu组DCX神经元前体细胞与其余两组差异无统计学意义,14 d时4组几乎未见DCX神经元前体细胞,MAP-2/Hoechst免疫荧光双标检测,MK-801(24 h)组MAP-2阳性神经元明显多于其它3组;TUNEL/Hoechst免疫荧光双标显示:3、7、14 d时Glu组TUNEL凋亡细胞明显多于其它3组。 【结论】 Glu可通过NMDA受体促进NSCs向神经元分化,并在神经元成熟过程中促进其凋亡,此作用可被MK-801阻断。     

大鼠NSCs向多巴胺能神经元分化研究

目的：探讨IL-1β对神经干细胞（NSCs）分化为多巴胺能神经元作用：方法：体外培养和鉴定中脑来源NSCs，用免疫学方法检测分化细胞酪氨酸羟化酶（TH）表达.结果：血清组、IL-1β10pg／ml组、IL-1β120pg／ml组、IL-1β150pg／ml组、IL-1β200pg／ml组诱导7d后TH细胞分别平均为0,45％、0．6％、7.2％、12．5％、8．75％：结果显示IL-1β诱导NSCs明显提高TH细胞表达率，与血清组比较有显著性差异（P〈0，05），在IL-1β150pg／ml剂量范同内TH细胞表达率与剂量呈正相关。结论：IL-1β有诱导NSC向多巴胺能神经元分化的显著作用：     

神经干细胞脑出血大鼠脑内移植对T淋巴细胞亚群的影响

目的 探讨神经干细胞（neural stem cells,NSCs）移植入脑出血大鼠模型脑内后,观察脑组织内和血液中T淋巴细胞亚群的变化。方法 选择成年雄性SD大鼠作为模型动物,采用Ⅳ型胶原酶诱导法建立脑出血模型,脑出血后3h移植神经干细胞,3天进行各项指标检测。应用流式细胞仪分析脑组织与血液中的T淋巴细胞亚群变化。应用酶联免疫吸附试验检测脑组织与血液中细胞因子的变化。通过组织免疫荧光了解T淋巴细胞与NSCs在脑出血大鼠脑内的分布情况。结果 在血液中,与对照组相比较,NSCs移植组能够增加调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）与CD4⁺T细胞表达,减少γδT与CD8⁺T细胞表达。在脑组织中,NSCs移植组能够增加Treg细胞表达,减少γδT、CD4⁺T和CD8⁺T细胞表达。与对照组比较,NSCs移植组增加血液与脑组织中IL-4（interleukin-4）、IL-10（interleukin-10）和TGF-β（transforming growth factor-β）的表达,并且减少IL-6（interleukin-6）与IFN-γ（interferon-γ）的表达。结论 脑出血早期NSCs脑内移植促进保护性的T细胞亚群和抑制破坏性的T细胞亚群表达,提示移植的NSCs可能通过发挥免疫调节作用起到神经保护作用。     

胰岛素样生长因子-1对神经干细胞增殖分化的影响

目的 寻找影响神经元和胶质细胞分化的外在因素，探素胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对神经干细胞（NSCs）增殖和分化的影响。方法 从E14的SD大鼠大脑中分离神经干细胞，分别用IGF-1、EGF和bFGF处理，台盼蓝染色确定活细胞数量，BrdU标记并分析细胞增殖能力，免疫细胞化学法鉴定神经干细胞、新生细胞和分化细胞。结果 分离得到的细胞表现出NSCs特性，用IGF-1、EGF和bFGF处理后均显示增殖效应，并能分化为神经元和胶质细胞样细胞。结论 IGF-1能促进NSCs增殖，并诱导其向神经元样和胶质细胞样细胞分化。     

Combined Transplantation of Neural Stem Cells and Olfactory Ensheathing Cells Improves the Motor Function of Rats with Intracerebral Hemorrhage

Objective To investigate the effects of combined transplantation of neural stem cells （NSC） and olfactory ensheathing cells （OEC） on the motor function of rats with intracerebral hemorrhage. Methods In three days after a rat model of caudate nucleus hemorrhage was established, NSCs and OEC, NSC, OEC （from embryos of Wistar rats） or normal saline were injected into bematomas of rats in combined transplantation group, NSC group, OEC group, and control group, respectively. Damage of neural function was scored before and in 3, 7, 14, 30 days after operation. Tissue after transplantation was observed by immunocytochemistry staining. Results The scores for the NSC, OEC and co-transplantation groups were significantly lower in 14 and 30 days after operation than in 3 days after operation （P〈0.05）. The scores for the NSC and OEC groups were significantly lower than those for the control group only in 30 days after operation （P〈0.05）, while the difference for the NSC-OEC group was significant in 14 days after operation （P〈0.05）. Immunocytochemistry staining revealed that the transplanted OEC and NSC could survive, migrate and differentiate into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The number of neural precursor cells was greater in the NSC and combined transplantation groups than in the control group. The number of neurons differentiated from NSC was significantly greater in the co-transplantation group than in the NSC group. Conclusion Co-transplantation of NSC and OEC can promote the repair of injured tissue and improve the motor fimction of rats with intracerebral hemorrhage.     

体外培养大鼠胚胎脊髓神经干细胞的增殖和分化

目的探讨大鼠胚胎脊髓神经干细胞的体外培养生长及分化情况,为神经干细胞的临床应用提供实验依据。方法取孕13d SD大鼠胚胎脊髓,在条件培养基中培养获得神经干细胞,应用免疫荧光法鉴定。神经干细胞在含血清的培养基中传代培养,应用免疫细胞化学法检测神经干细胞的分化情况。结果从大鼠胚胎脊髓可获得具有自我增殖分化能力的神经干细胞,培养7d即可获得神经球。用免疫细胞化学和免疫荧光法鉴定干细胞分化,可检测到神经元和星形胶质细胞。结论从大鼠胚胎脊髓能分离获得神经干细胞,并可向神经元和星形胶质细胞方向分化。     

肠与脑来源神经干细胞的增殖和分化特性比较

目的探索肠神经干细胞(ENSCs)的增殖和分化特性,寻找神经干细胞移植治疗肠道神经元缺陷性疾病的合适干细胞源。方法采用神经干细胞培养和分离技术,对来自同一大鼠肠道及大脑的神经干细胞(CNS-NSCs)进行体外培养,通过神经球生长直接观察法、CCK-8细胞增殖测定法、流式细胞仪测定,比较研究两者的生长和增殖情况及成熟分化特性。结果与CNS-NSCs相比,ENSCs神经球增殖速度较慢;ENSCs神经球表面常有长突起,并相互连接成网络状,显示早期成熟分化的迹象;CCK-8法测得ENSCs的吸光度明显低于CNS-NSCs(P<0.05),提示其增殖速度慢于CNS-NSCs。流式细胞仪测得EN-SCs和CNS-NSCs的TUJ-1阳性细胞比例分别为12.3%和11.4%(P>0.05)、GFAP阳性细胞比例分别为21.7%和22.5%(P>0.05)、Nestin阳性细胞比例分别为10.8%和10.8%(P>0.05)。结论 ENSCs与CNS-NSCs具有类似的增殖、分化特性,但ENSCs增殖速度较慢,易于成熟分化。     

胎鼠、新生鼠和成年鼠神经干细胞的体外增殖和分化

目的比较个体发育不同阶段所得神经干细胞的体外增殖和分化情况。方法常规的神经干细胞分离培养方法，用免疫细胞化学方法鉴定细胞。结果从胎鼠所得的神经干细胞增殖能力最强，新生鼠的次之，成年鼠的较差。神经干细胞的分化更多地决定于培养条件。结论个体发育不同阶段所得的神经干细胞有不同的生物学特性。     

传代对大鼠胚胎神经干细胞增生、凋亡和分化影响

目的探索传代对胚胎神经干细胞的增生、分化和凋亡等生物学性状的影响。方法原代培养后(P0)和经过两次传代后(P2)的神经干细胞用BrdU细胞增生检测试剂盒检测增生能力;用Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测早期凋亡率;诱导分化7天后,分别进行MAP2和GFAP免疫荧光标记和Hoechst 33342核染色,计算MAP2 细胞和GFAP 细胞占Hoechst 细胞的各自比例。结果P0神经干细胞的OD值是:1.1899±0.0485(n=13),P2为0.3526±0.1053(n=11,P=0.000);P0的早期凋亡率为40.91%±12.74%(n=8),P2为24.31%±13.01%(n=9,P=0.018);P0和P2的神经元细胞比例分别为:58.81%±9.69%(n=10)和27.84%±5.70%(n=10,P=0.000),星形胶质细胞比例分别为22.85%±4.36%(n=10)和49.32%±6.95%(n=10,P=0.000)。结论传代后的神经干细胞的增生能力和早期凋亡率都会变弱,分化为神经元细胞的比例会降低,而星形胶质细胞的比例增大。     

Effect of Acupuncture on Proliferation and Differentiation of Neural Stem Cells in Brain Tissues of Rats with Traumatic Brain Injury

Objective:To observe the effect of acupuncture on proliferation and differentiation of neural stem cells in brain tissues of rats with traumatic brain injuny.Methods:Thirty SD rats were randomly and equally allocated to the sham-operated,the model and the acupuncture groups.The traumatic brain injury model was established by the free drop method.For the rats in the acupuncture group,acupuncture was applied once a day for 7 days.Brain histotomy was carried out when treatments were completed.Immunohistochemical techniques were adopted to detect the cells that express nestin,neurofilament proteins(NF)-200 and glial fibrillary acidic proteins(GFAP),the markers of neural stem cells,neurons,astrocytes respectively.Results:Compared to the sham-operated group,the number of nestin-positive cells and NF-200-positive cells in brain tissues was decreased significantly in the model group(P<0.01),whereas the number of GFAP-positive cells was significantly increased (P<0.01).Compared to the model group,the positive cells of nestin,NF-200,GFAP in brain tissues in the acupuncture group were increased obviously(P<0.01).Conclusions:Acupuncture can significantly increase the number of nestin-positive cells,NF-200-positive cells and GFAP-positive cells,indicating the significant increase of neural stem cells,neurons and astrocytes in number.Acupuncture can improve neuranagenesis by promoting the proliferation and differentiation of neural stem cells in brain tissues.This might be one of the mechanisms for acupuncture to treat traumatic brain injury and to promote the repair of nervous function.     

靳三针疗法对窒息脑瘫幼鼠神经干细胞增殖与分化的实验研究

[目的]观察靳三针疗法对脑瘫大鼠神经干细胞(NSCs)增殖与分化的影响.[方法]选用SD新生大鼠,随机分为假手术组、模型组、靳三针疗法治疗组(治疗组,针刺百会、颞Ⅰ针、曲池、内关、足三里、涌泉),模型组与治疗组均采用结扎单侧颈总动脉法复制脑瘫大鼠模型,其中治疗组于手术后24 h开始针刺,共14 d.各组于造模后15 d处死大鼠制备脑组织提取液.另取健康SD新生大鼠,取大脑海马部位,分离、扩增NSCs,采用免疫细胞化学法检测NSCs特征性标记Nestin与Brdu表达,以鉴定培养的细胞及体外分化能力.培养细胞分为正常对照组,低、高浓度组(分别加入100、300μL/mL.的治疗组脑组织提取液),培养1、3、5 d后,采用免疫细胞化学法和免疫荧光法检测各组神经元样细胞和星形胶质样细胞的特征性标志物神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,观察各组NSCs分化情况.采用流式细胞术检测各组NF、GFAP阳性细胞数,观察脑组织提取液促进NF、GFAP表达的时效和量效关系.[结果]扩增后的细胞球Nestin与Brdu均呈阳性,证实体外培养的细胞为NSCs,并处于分裂增殖旺盛期.细胞培养1、3、5 d后,NF、GFAP染色均呈阳性,且正常对照组阳性细胞少,低、高浓度组明显增多,呈浓度依赖性,表明NSCs已分化为神经元细胞和星形胶质细胞.同一时间段内低、高浓度组NF、GFAP阳性细胞数均较正常对照组显著增高(P<0.05或P<0.01),高浓度组在培养1、3、5 d后,NF、GFAP阳性细胞数也显著增高(P<0.05或P<0.01),表明治疗组脑组织提取液可促进NF、GFAP表达,且呈一定的量效和时效关系.[结论]靳三针疗法治疗脑瘫可能是通过促进NSCs的增殖和定向分化,从而达到修复脑损伤的目的.     

神经干细胞接种密度对其增生和分化的影响

为探讨神经干细胞不同接种密度对其增生和分化的影响,取10～12周龄胎儿的大脑皮质用胰酶消化获得单细胞,分别以1×10~2/mL、1×10~4/mL和1×10~6/mL的细胞密度接种,用无血清培养基DMEM/F12、上皮细胞生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白血病抑制因子(LIF)培养;用MTT法测OD值并观察神经干细胞的存活和增生情况。从培养基中剔除生长因子,继尔以10％胎牛血清诱导分化,用免疫细胞化学(ICC)方法,研究不同细胞密度培养后神经干细胞的分化能力。结果:在1×10~6/mL细胞密度下培养,神经干细胞增生活跃,形成神经球,Nestin表达阳性,10％胎牛血清诱导后神经干细胞可分化为神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞;低细胞密度(低于1×10~4/mL)培养不利于神经干细胞的存活和增生,血清诱导未见分化的细胞。提示:适宜的神经干细胞接种密度有利于其增生和分化。