梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd的基因型分析及其重组蛋白的免疫原性鉴定

目的　构建梅毒螺旋体 (Treponemapallidum ,Tp)外膜蛋白Gpd基因的原核表达载体 ,检测其表达产物的免疫原性 ,并比较梅毒螺旋体各菌株Gpd基因序列的同源度。方法　从TpNichols株基因组模板中PCR扩增Gpd基因 ,与GenBank登录的序列做blast比较 ,定向克隆构建原核表达重组体pET2 8b( + ) -Gpd ,转入大肠杆菌ril表达菌 ,SDS -PAGE分析重组蛋白的表达 ,Western -blot检测重组蛋白的免疫原性。结果　载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的Nichols株Gpd基因序列完全一致 ,同其他病原性密螺旋体菌株登陆序列比较同源度为 98%～ 1 0 0 %。SDS -PAGE检测诱导产物显示有一Mr约为 41kDa的特异蛋白带 ,免疫印迹技术检测其能与梅毒阳性标准血清反应。结论　Tp原核表达重组体pET2 8b( + ) -Gpd成功构建 ,且能够在ril表达菌中融合表达 ,为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了一定的实验基础。     

梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd在Hela细胞中的表达及鉴定

目的 构建梅毒螺旋体（Tp）外膜蛋白甘油磷酸二酯磷酸二酯酶基因（Gpd）的真核表达载体peDNA3．1（＋）-Gpd，鉴定其在Hela细胞的表达，为开展TpDNA疫苗动物实验打下基础。方法 用PCR从TpNichols株基因组中扩增Gpd基因，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-Gpd，脂质体介导转染入Hela细胞，以免疫组化及跳tern-blot检测在Hela细胞中的表达。结果 双酶切及DNA测序显示重组质粒含有1059bp的目的基因片段，读码框架正确，无突变。该重组质粒在Hela细胞能有效表达分子量为41kDa的目的蛋白，重组蛋白能-9梅毒螺旋体阳性血清反应。结论 构建的质粒peD-NA3．1（＋）-Gpd成功地在体外真核细胞中表达。     

梅毒螺旋体0751基因的克隆、表达及鉴定

目的 构建梅毒螺旋体0751基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达及进行免疫学鉴定.方法 以梅毒螺旋体基因组DNA为模板,PCR扩增梅毒螺旋体0751基因,构建其重组原核表达载体,并采用Western-blot方法初步鉴定该蛋白的特异性.结果 成功扩增出梅毒螺旋体0751基因,该基因在大肠杆菌表达系统中得到表达,并且特异性识别梅毒患者血清.结论 在大肠杆菌中成功表达梅毒螺旋体0751基因,为梅毒螺旋体的诊断提供了新的特异性抗原.     

海毒螺旋体外膜蛋白Gpd的基因型分析及其重组蛋白的免疫原性鉴定

目的构建梅毒螺旋体（Treponema pallidum，Tp）外膜蛋白Gpd基因的原核表达载体，检测其表达产物的免疫原性，并比较梅毒螺旋体各菌株Gpd基因序列的同源度。方法 从Tp Nichols株基因组模板中PCR扩增Gpd基因，与 GenBank登录的序列做blast比较，定向克隆构建原核表达重组体pET28b( )-Gpd，转入大肠杆菌ril表达菌，SDS-PAGE分析重组蛋白的表达，Western-blot检测重组蛋白的免疫原性。结果 载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的Nichols株Gpd基因序列完全一致,同其他病原性密螺旋体菌株登陆序列比较同源度为98%～100%。SDS-PAGE检测诱导产物显示有一Mr约为41 kDa的特异蛋白带，免疫印迹技术检测其能与梅毒阳性标准血清反应。结论 Tp原核表达重组体pET28b( )-Gpd成功构建，且能够在ril表达菌中融合表达，为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了一定的实验基础。     

梅毒螺旋体免疫逃逸机制的研究进展

梅毒螺旋体(Tp)感染过程中,宿主通过固有免疫与适应性免疫应答清除Tp,Tp则试图通过多种机制来逃避免疫清除并导致慢性感染。宿主的体液免疫应答有时可能不能完全抵抗Tp感染,Tp可通过抗原变异、毒力变异或下调宿主免疫应答等方式导致持续感染和晚期梅毒损害,也有可能存在高度致神经梅毒的Tp菌株类型。本文综述Tp的部分生物学特性以分析其与持续性感染的相关性。了解Tp的免疫逃逸机制有助于阐明其致病机制,为梅毒疫苗研发提供依据。     

重组梅毒螺旋体黏附素在小鼠模型中的免疫原性及免疫保护性研究

目的观察重组梅毒螺旋体(Tp)黏附素Tp0751(rTp0751)、Tp0136氨基端(rTp0136N)、Tp0435(rTp0435)诱生C57BL/6小鼠适应性免疫应答水平及免疫后抑制Tp在小鼠体内播散情况,为筛选梅毒疫苗候选分子提供依据。方法表达和纯化重组蛋白rTp0751、rTp0136N和rTp0435。将C57BL/6小鼠随机分为PBS对照组、rTp0751组、rTp0136N组、rTp0435组,分别以PBS、rTp0751、rTp0136N及rTp0435免疫各组小鼠3次;ELISA检测各组小鼠免疫血清特异性IgG抗体水平;流式细胞术(FCM)检测末次免疫后2周小鼠脾细胞胞内白细胞介素-4(IL-4)与干扰素-γ(IFN-γ)含量;实时荧光定量PCR(qPCR)检测Tp攻击6周后小鼠心、脾、脑组织中Tp的DNA载量。结果各免疫组小鼠血清特异性IgG抗体随免疫时间增加而逐渐升高并于首次免疫第6周达到峰值。FCM检测结果显示各免疫组淋巴细胞胞内CD4＋IFN-γ＋与CD8＋ IFN-γ＋含量均高于PBS对照组(P＜0.01),CD4＋T细胞产生IL-4水平均极低。qPCR检测结果显示,在脾脏、心脏和脑组织中,rTp0751与rTp0136N组Tp-DNA载量均低于PBS对照组(P＜0.05),rTp0435组与PBS对照组之间无明显差异。结论rTp0751、rTp0136N、rTp0435均具有良好的免疫原性,Tp0751、Tp0136N有望为梅毒候选疫苗分子。     

梅毒螺旋体Tp0993重组蛋白的表达及鉴定

目的表达、鉴定梅毒螺旋体（Tp）重组蛋白Tp0993（rTp0993）,为进一步评价其在梅毒血清学诊断中的意义奠定基础。方法 PCR扩增去除信号肽核苷酸序列的Tp0993基因,构建原核重组体pET-28a/Tp0933并诱导表达蛋白;Ni-NTA法纯化重组蛋白,Western blot检测表达产物的抗原性。结果成功构建了原核重组体pET-28a/Tp0993,经诱导表达了一分子量大约为40 Ku的重组蛋白;Western blot结果显示纯化蛋白能被梅毒患者血清特异性识别。结论 rTp0993有较好的抗原性,为进一步研究其在梅毒血清学诊断中的作用奠定了基础。     

梅毒螺旋体Tp0751重组蛋白的表达及鉴定

目的表达梅毒螺旋体粘附蛋白Tp 0751,纯化表达产物并对其抗原性进行鉴定。方法通过生物信息学分析,去除Tp 0751信号肽序列,构建原核表达体并在大肠埃希菌（E.coli）R2566中进行诱导表达;Ni-NTA法纯化重组蛋白;蛋白质印迹法（WB）鉴定重组蛋白。结果成功构建了PET-28a（＋）/Tp 0751原核表达载体;经表达、纯化后获得了相对分子量约为26 kD的融合蛋白;经WB分析能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应。结论重组表达的Tp 0751重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步研究Tp 0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白的原核表达、纯化、鉴定及活性初步测定

目的:在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白,并对其进行纯化、鉴定和活性初步测定. 方法:将构建的pGEX-Ag85B/IL-2重组菌BL21扩增后接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,筛选最适诱导剂浓度和最适诱导时间;梯度浓度尿素复性包涵体,经GST-Sepharose亲和层析、凝血酶切、阴离子交换层析和反相-高效液相(RP-HPLC)层析纯化Ag85B/IL-2融合蛋白,免疫印迹(Western blot)鉴定,并测定其N-末端氨基酸序列和IL-2比活性. 结果:成功在大肠杆菌中高效表达带有GST的Ag85B/IL-2融合蛋白,占菌体总蛋白的30%,主要以包涵体形式表达,于诱导后6 h表达量达最高峰. 对包涵体复性,纯化获得纯度为98.32%的Ag85B/IL-2融合蛋白,Western blot鉴定阳性,N-末端氨基酸测序与理论预期完全一致,IL-2比活性为2500 u/mg. 结论:高效表达并纯化了Ag85B/IL-2融合蛋白,为进一步研究其在膀胱肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础.     

重组IL-33融合表达载体的构建、蛋白表达及纯化

目的：构建人白介素-33（IL-33）硫氧还蛋白融合表达载体,高效表达IL-33蛋白。方法：采用RT-PCR从健康志愿者外周血单核细胞（PBMC）mRNA中扩增IL-33 cDNA;将扩增的IL-33目的基因与融合表达质粒pET102/D-TOPO连接,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化鉴定。结果：扩增的IL-33 cDNA大小为800bp左右。表达的IL-33融合蛋白大小为45kDa左右,Western blotting鉴定显示表达的蛋白正确,为IL-33目的蛋白。但表达的大部分蛋白为无生物学活性的包涵体,在后续对表达蛋白进行纯化的同时对蛋白进行了复性,得到了复性后具有生物学活性的IL-33蛋白。结论：成功制备了具有生物学活性的IL-33蛋白。     

牛淑会为并列第一作者.梅毒螺旋体重组蛋白Tp0608的表达与鉴定

目的表达梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0608(rTp0608)并鉴定其抗原性,为深入探讨其在梅毒血清学诊断中的价值奠定基础。方法PCR扩增Tp0608全长基因,构建原核表达重组体pET-28a(+)/Tp0608,转化宿主菌诱导表达rTp0608,Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,SDS-PAGE分析蛋白表达形式与纯度,Western blot鉴定rTp0608的抗原性。结果原核表达重组体pET-28a(+)/Tp0608在宿主菌内经诱导表达了分子量大约为38 kDa的重组蛋白,以包涵体表达形式为主,纯化蛋白的纯度>95%;Western blot结果显示纯化蛋白能被梅毒患者混合血清特异性识别。结论PET-28a（+）表达载体高效表达了rTp0608,该重组抗原有良好的抗原性。     

梅毒螺旋体粘附素Tp0751重组菌影的构建与鉴定

目的 构建梅毒螺旋体(Tp)粘附素Tp0751的重组大肠埃希菌菌影(E.coli bacterial ghosts,EBG),为深入评价其在抗Tp感染中的潜在免疫保护作用奠定基础。方法将含有噬菌体PhiX174裂解基因E的质粒pHH43转化E.coli DH5α,42 ℃温控诱导使其形成EBG并计算裂解效率,用琼脂糖DNA电泳和透射电镜(TEM)鉴定EBG。构建含有裂解基因盒E-box、膜锚定序列E′-linker及Tp0751目的基因的原核双表达重组质粒pET28a-E′-Tp0751-E-box,28 ℃诱导重组E.coli BL21表达Tp0751并用Western Blot鉴定;42 ℃诱导形成重组EBG(rEBG),计算裂解效率并用DNA电泳和TEM鉴定。结果构建的EBG裂解率为98.13%,DNA电泳未观察到DNA条带,TEM显示绝大部分细菌都裂解成缺乏胞浆成分的细胞空壳并保持活菌基本形态。rEBG在28 ℃时高效表达重组Tp0751蛋白,且仅与梅毒患者血清特异性结合; 42 ℃下其rEBG裂解率为96.37%,电泳和TEM鉴定结果与EBG的相似。结论成功构建表达Tp粘附素Tp0751的rEGB,其所表达目的蛋白具有良好免疫反应性。     

快速免疫结合试验检测梅毒螺旋体抗体方法的评价

目的：使用两种快速免疫结合试验检测梅毒螺旋体抗体，可使假阳性降到极低。方法：使用目前国内最常用的快速检测试剂，TP-ELISA试剂筛检临床阳性标本，TPPA法作为确证试验，从而得出快速试剂的假阳性和假阴性率。结果：在初筛检出的阳性标本中，TP-ELISA法无假阳性和假阴性。快速试剂1假阴性率1．69％，假阳性率7．27％，快速试剂2假阴性率1．69％，假阳性率4．65％，但如果两种试剂结合使用在本实验中可使假阳性率降为零。结论：在检测门急诊患者时，可用两种快速试剂结合检测梅毒螺旋体抗体。     

对比分析三种不同方法检测梅毒螺旋体的结果准确性

目的：探究对比三种不同方法检测梅毒螺旋体的结果准确性。方法：选自笔者所在疾病预防控制中心和人民医院2006年2月-2012年2月所收治的梅毒患者共80例作为观察组,再选取同期的健康无梅毒人员80例作为对照组,两组患者都通过梅毒螺旋体明胶颗粒凝剂实验、甲苯胺红不加热血清试验以及梅毒螺旋体双抗原夹心试纸条三种不同的方法进行梅毒螺旋体的检测,探究比较这三种不同方法检测结果的准确率。对于以上三种方法,笔者分别以TPPA、TRUST和胶体金实验检验来称呼。结果：相对于TRUST,TPPA和胶体金实验检验的阳性检出率与隐性检出率都明显要高,它们之间的数据差异有统计学意义（P〈0.05）。对于早期梅毒还有Ⅰ期梅毒的阳性检出率,以TPPA最高,接着是胶体金实验检验、TRUST。结论：胶体金法比较适用于检验检疫系统实验室加急标本筛查或现场快速检测,对于梅毒疗效的观察检测,TRUST检测方法比较适合,而TPPA则比较适合对于胶体金实验检验、TRUST检出标本做一个验证测试。检测的结果,胶体金实验检验明显是要高于TRUST,两者之间有明显差异,但是它和TPPA之间的检测结果并没有明显的差异性,所以对梅毒的检测,胶体金实验检验不但准确率比TRUST高,而且操作比TPPA要简便快速,成本也比较低。     

两种检测梅毒螺旋体抗体方法的比较

目的:比较ELISA TP-IgG和快速血浆反应素试验(rap id p lasm a reagin c irc le card test,RPR)梅毒检测试剂的敏感性和特异性。方法:采用ELISA TP-IgG和RPR 2种试剂同时对56份临床疑似标本进行检测,结果阳性者采用梅毒螺旋体特异性抗体乳胶凝集试验(Toreponem a pallidum latex immuno assay,TPLA)方法进行验证。结果:ELISA TP-IgG检测率高于RPR,且与TPLA确证实验完全吻合。结论:ELISA TP方法在敏感性和特异性方面均好于RPR方法,是临床检测梅毒感染和筛选献血员的首选方法。     

梅毒螺旋体的实验室检测技术及临床应用

梅毒螺旋体的实验室检测方法主要为血清学试验,分为特异性和非特异性梅毒抗体检测。这些方法对于各期梅毒的诊断具有极其重要的价值。本文对当前梅毒螺旋体的检测状况及其临床应用作一综述。