黄曲霉素产毒真菌ver-1、verB及ITS基因序列多重PCR体系的优化

目的 对黄曲霉素产毒真菌的多重PCR体系进行优化，确定最佳PCR体系。方法 以黄曲霉素产生过程中的主要调控基因ver-1、verB及通用基因片段ITS序列为目的片段，设计多重PCR引物，采用单因素和正交优化试验，对DNA模板、Mg²⁺浓度、引物用量、dNTPs用量、退火温度等因素进行考察。结果 最佳多重PCR体系为：50 µL体系中含有引物(5 µmol·L^-1)3 mL，dNTPs(2.5 mmol·L^-1)5 µL，Mg²⁺(2.5 mmol·L^-1)4 µL，DNA浓度10 ng·µL^-1，退火温度56 ℃。结论 建立的体系可用于黄曲霉素产毒真菌的多重PCR鉴定，对黄曲霉产毒菌的源头鉴定具有一定的意义。     

基于巢式PCR的紫草鉴别引物筛选

目的:基于巢式聚合酶链式反应(PCR)理念设计并筛选出可用于高效扩增与鉴别紫草市场样品真伪的特异性引物。方法:针对新疆紫草的ITS序列和紫草非《中华人民共和国药典》品ITS2序列,利用Primer Premier 5软件进行巢式引物设计;比较ITS2通用引物PCR和巢式PCR对紫草药材基因组DNA的扩增效率;基于巢式引物直接扩增紫草基因组DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳检测;基于扩增产物片段长度、变异位点覆盖情况对设计的紫草药材特异性引物进行评价。结果:经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出11对引物进行合成;巢式PCR对紫草药材基因组DNA的扩增效率明显优于ITS2通用引物PCR;基于巢式引物直接扩增紫草基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测的结果明显优于ITS2引物直接扩增紫草基因组DNA,且呈单一条带;确定AE-9S/AE-2A、AE-4S/AE-10A、AE-12S/10A、AE-29S/AE-29A共4对引物适用于紫草正伪品鉴定。结论:在DNA条形码鉴定和巢式PCR技术的基础上,确定了4对可以用于有效区分药材市场中主流的新疆紫草和紫草非《中华人民共和国药典》品的特异性...     

冬虫夏草特异性PCR鉴定方法研究

目的建立一种准确、简便的方法鉴别冬虫夏草真伪。方法采用改良CTAB法从冬虫夏草样品中提取总DNA,根据r DNA中ITS1区序列设计一对特异性引物,对虫草样品进行特异性扩增。结果冬虫夏草标准品和部分市售虫草样品能扩增出255bp大小的目的片段,其余虫草样品未能扩增出相应条带。结论改良CTAB法提取DNA所需时间短对DNA分子破坏性小。特异PCR鉴别冬虫夏草真伪的方法准确快捷,对珍贵药材的甄别具有广阔的前景。     

中日产川芎的matK、ITS基因序列及其物种间的亲缘关系

目的分析中国产川芎Ligusticum chuanxiong Hort.及日本产川芎Cnidium officinale Makino的核基因组ITS和叶绿体基因组matK序列,为探讨中日产川芎物种间的亲缘关系提供分子依据。方法采用PCR直接测序技术测定川芎和日本川芎的ITS基因和matK基因核苷酸序列并作序列变异分析。结果川芎和日本川芎的matK序列长度均为1268 bp,编码422个氨基酸。ITS1-5.8S-ITS2序列长度均为699 bp,其中18S rRNA基因3′端序列54 bp,ITS1序列215 bp,5.8S rRNA基因序列162 bp,ITS2序列222 bp,26S rRNA基因5′端序列46 bp。根据排序比较,川芎原植物与其商品药材间的matK基因和ITS基因序列完全相同,而川芎与日本川芎间matK基因则仅有1个变异位点,即在上游959 nt处1个转换替代(T→C),反映在氨基酸序列则发生一个非同义取代V(GTG)→A(GCG);ITS基因也仅有1个变异位点,即在ITS1上游54 nt处1个转换替代(T→C)。结论通过进化速率较快的基因序列同源性分析,基本可以认为中日所产川芎基原一致,日本川芎学名似应改为Ligusticum chuanxiong Hort.。     

基于DNA条形码技术鉴定蒙药材刺柏叶及其混淆品

目的：基于DNA条形码技术鉴别蒙药材刺柏叶及其混淆品。方法：采用国际通用的条形码序列 ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL,对刺柏叶及其混淆品圆柏叶共计11份样品进行DNA提取、扩增,采用CodonCode Aligner进行序列拼接,并用MEGA软件对拼接序列进行变异位点分析、邻接(NJ)聚类分析,并计算其平均种内、种间遗传距离。结果：4对引物的PCR扩增产物测序成功率分别为ITS2 100%、 psbA-trnH 100%、rbcL 100%、matK 0%;ITS2序列和psbA-trnH序列均可通过变异位点比较区分刺柏叶及其混淆品;NJ聚类分析的结果显示,psbA-trnH序列的NJ聚类树中刺柏叶与圆柏叶均能分别聚为一支,且psbA-trnH序列的平均种间遗传距离明显大于平均种内遗传距离。结论：psbA-trnH序列能有效区分圆柏叶与刺柏叶,可作为鉴别刺柏叶及其混淆品圆柏叶的条形码序列,为蒙药材刺柏叶及其混淆品的鉴别提供支持。     

不同产地蒺藜核糖体DNA内转录间隔区序列分析

目的通过测定核糖体DNA内转录间隔区(Ribosomal DNA internal transcribed spacer,rDNA-ITS)基因序列,确定不同产地的蒺藜在种质遗传上是否存在差异。方法利用PCR产物直接测序,测定不同产地蒺藜的rDNA-ITS基因序列。结果测得ITS碱基序列742 bp,其中ITS1全部序列267 bp,5.8 S全部序列167bp,ITS2全部序列209 bp。6个产地的蒺藜样品的ITS的碱基序列完全相同。结论不同地区的蒺藜在种质上没有发生变异。     

冬虫夏草及其发酵菌丝体的药理药效学研究

冬虫夏草Cordyceps inensis(Berk.)Sass.简称虫草(CS),为麦角菌科真菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾幼虫上的干燥子座和虫体,系名贵传统滋补强身中药,有保肺、益肾、止血、化痰等功效。1972年,中国医学科学院药物研究所开始了人工培养虫草菌丝体的研究,他们从青海化隆产新鲜冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk)Sacc]中率先分离出蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌株,经人工发酵培养,获得发酵虫草菌丝体(商品名为金水宝)。成分研究证实,冬虫夏草及其发酵虫草菌丝体含有核苷类(腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷)、虫草酸(D-甘露醇)、麦角甾醇、虫草多糖及天门冬…     

蝙蝠蛾拟青霉菌丝体化学成分研究

目的研究蝙蝠蛾拟青霉菌丝体正丁醇层的化学成分。方法通过硅胶柱色谱法和制备型HPLC等技术手段从蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中正丁醇层分离得到8个化合物,并通过NMR波谱技术等手段鉴定化合物的结构。结果从蝙蝠蛾拟青霉菌丝体正丁醇层萃取部位得到的8个化合物分别为(5S,6R,7S,8R)-5-amino-(2Z,4Z)-1,2,3-trihydroxybuta-2,4-dienyloxy-pentane-6,7,8,9-tetraol(1)、2′-O-methyladenosine(2)、5′-O-acetyl-9-β-arabinofuranosyl adenosine(3)、3′-O-(β-D-glucosyl)adenosine(4)、Cyclo(Asn-Ile)(5)、Cyclo(Asn-Phe)(6)、4″-O-methyldaidzin(7)、4″-O-methylglycitin(8)。结论化合物1～7均为首次从梗孢科(Moniliaceae)瓶梗青霉属中分离得到的化合物。     

基于matK和ITS2及二级结构对药材香薷及其混伪品的鉴别研究

目的 快速、准确鉴别药材香薷及其混伪品，保障香薷的药材质量和用药安全。方法 收集石香薷、江香薷和香薷植物材料分别进行matK和ITS2序列的扩增与测序，测序结果经Codon Code Aligner软件校对，同时从GenBank下载石香薷、江香斋及其易混品种海州香薷、香薷、密花香薷、牛至等物种的matK和ITS序列。其中，ITS序列经隐马尔可夫模型去除两端的5.8S和28S序列，共得到16个物种的ITS2序列50条；经Clustal软件校对共获得9个物种的matK序列28条。通过Mega7.0软件分析matK和ITS2序列，计算所有物种种内和种间遗传距离，构建邻接法(neighbor joining，NJ)聚类树，通过ITS2 Database预测ITS2二级结构，采用4Sale软件比对二级结构，通过ProfDistS软件构建基于联合ITS2一级序列及其二级结构的剖面邻接(profile neighbor-joining，PNJ)系统发育树。结果 基于matK和ITS2序列的遗传距离均表明香薷正品与其各种混伪品之间存在明显barcoding gap。NJ和PNJ进化树的拓扑关系一致，可以区分药材香薷及其混伪品。香薷的ITS2二级结构与其各混伪品具有显著差异。结论 建议matK和ITS2序列均可以作为鉴别香薷与其混伪品的DNA条形码，ITS2二级结构信息的加入可丰富鉴定结果，为香薷药材的准确鉴别、香薷属与石荠苎属植物的科学分类提供参考。     

阳春砂的荧光定量PCR检测与鉴定

摘 要 目的： 分析研究阳春砂基因序列特征,建立基于DNA分子的快速甄别阳春砂的荧光定量PCR技术。方法: 收集阳春砂及同科其他样品,经专家鉴别后,提取DNA。根据阳春砂ITS序列两端相对保守区设计引物和探针,优化反应条件,建立阳春砂的荧光定量PCR检测方案。 结果:基于阳春砂ITS序列两端相对保守区设计了引物和探针,通过条件优化,建立的荧光定量PCR检测方法能成功对阳春砂样品进行检出,而同科其他非阳春砂样品无扩增曲线。结论: 阳春砂药材能够通过除传统专家鉴定方法以外的荧光定量PCR方法快速检出。     

浙龟甲的PCR鉴别研究

目的 建立聚合酶链式反应（PCR）技术鉴别浙龟甲[来源为龟黄喉水龟Clemmys mutica（Cantor）的背甲及腹甲]真伪的方法。方法 提取浙龟甲及其混淆品的基因组DNA,从NCBI网站上检索黄喉水龟及其混淆品的线粒体基因,进行分析比对,根据黄喉水龟细胞色素b（cytochrome b gene,Cytb）基因上的特异位点应用Oligo软件设计引物,对浙龟甲及其混淆品样本进行PCR扩增。结果 所设计的引物能特异性扩增黄喉水龟,扩增片段长度为357 bp,能有效区分浙龟甲及其混淆品种。结论 建立的PCR技术鉴别浙龟甲方法,具有特异性高、方法简便快捷、实用性较强的特点,在快速准确鉴别浙龟甲方面具有良好的应用前景。     

球花石斛的位点特异性PCR鉴别研究

为建立球花石斛的DNA分子标记鉴别方法，本文根据测定及GenBank上登录的109种共计164个石斛样本的rDNA ITS序列，设计了特异性鉴别引物QH-JB1 和QH-JB2，并对球花石斛进行了位点特异性PCR鉴别研究。结果表明，当复性条件为63.5 ℃，1 min时，只有球花石斛的模板DNA能被扩增出约300 bp的阳性扩增带，而其他种石斛均为阴性。证明用本法鉴别球花石斛简便、省时，也适用于干燥球花石斛药材的鉴别，具有广泛的应用前景。     

东南亚燕窝的12S rRNA和Cytb基因序列分析

目的 对实地采集的25份未进行任何加工的东南亚燕窝样品的12SrRNA和cytb基因序列进行分析,确定东南亚地区燕窝来源物种的真实身份,其中包括两份珍贵的采集自马来西亚燕洞的洞燕和血燕标本。方法 25份未经过任何加工的样品采集自马来西亚、新加坡和越南地区的燕洞和燕屋,以直接提取自燕窝的基因组DNA为模板,利用重新设计的引物扩增得到12SrRNA和cytb 基因序列,并进行克隆测序。结果 测序结果与GenBank中的同源序列进行BLAST比对分析并构建亲缘关系树,结合样品采集地的金丝燕种类信息初步确定爪哇金丝燕(Aerodramus fuciphagus)和大金丝燕(Aerodramus maximus)。结论 分析结果证实扩增的均为正确的来自对应金丝燕属的线粒体基因序列,结合金丝燕种源地的物种分布资料和基因序列信息,为制定进口燕窝的质量标准提供了依据。     

不同产地白及遗传多态性的RAPD分析

目的 研究国内不同产地白及的遗传多样性和亲缘关系。方法 利用随机扩增多态DNA （random amplified polymorphic DNA,RAPD）引物,RAPD分子标记技术分析国内50个不同产地的白及。结果 RAPD技术扩增产物经琼脂凝胶电泳检测,从50条引物中筛选出10条（S8,S9,S14,S19,S23,S25,S28,S29,S30,S31）条带清晰的引物,10条引物共扩增出88条DNA条带,其中多态性的DNA条带数目为81条,占总数的92.05%。每个引物能扩增出5~11条DNA条带,平均可扩增出8.8条;扩增最少的引物为S19,扩增出5条DNA条带;扩增最多的引物为S29,扩增出11条DNA条带。而每个引物能扩增的多态性DNA条带数为3~11条,平均可扩增出8.6条。结论 不同产地的白及具有较丰富的遗传多样性,RAPD可有效应用于白及的遗传多样性研究。     

猪基源的肝素粗品及混淆品的AS-PCR及ARMS分子检测

本文建立了一种简便、准确的鉴别猪基源的肝素粗品及其混淆品的DNA分子鉴定方法。在对家猪、野猪及其他7种动物(均用于加工猪肝素粗品的混淆品)的mtDNA D-loop区进行序列分析的基础上，设计了专门用于鉴别猪基源肝素钠的AS-PCR(allele-specific PCR)引物及ARMS(amplification refractory mutation system)引物，对家猪、野猪及其他7种动物来源的肝素、肌肉或血液共49个样品的基源进行了分子检测。结果表明：AS-PCR及ARMS方法均可用于猪基源肝素粗品的快速鉴别。AS-PCR鉴别时的复性温度为54～56 ℃，ARMS引物鉴别时的复性温度更宽，为52～58 ℃。在用两种引物对肝素样品进行鉴别时，仅猪来源的肝素DNA模板能扩增得到约170 bp的扩增条带，而其他动物来源的肝素DNA模板在同样条件下无扩增产物。     

冬虫夏草的分子鉴定方法

目的 建立专属性强的冬虫夏草分子鉴定方法.方法 通过在ITS1区设计冬虫夏草的特异性引物,并进行不同条件的优化试验,建立冬虫夏草的酶联免疫吸附法(PCR)鉴别体系.结果 建立的酶联免疫吸附法(PCR)体系对冬虫夏草有164bp条带的扩增,而伪品无扩增现象.结论 所建立的PCR体系能够准确、快速的鉴别冬虫夏草及其伪品.     

Sequencing and phylogenetic analysis of neurotoxin gene from an environmental isolate of Clostridium sp.: comparison with other clostridial neurotoxins

A Clostridium sp. isolated from intestine of decaying fish exhibited 99% sequence identity with C. tetani at 16S rRNA level. It produced a neurotoxin that was neutralized by botulinum antitoxin (A+B+E) as well as tetanus antitoxin. The gene fragments for light chain, C-terminal and N-terminal regions of the heavy chain of the toxin were amplified using three reported primer sets for tetanus neurotoxin (TeNT). The neurotoxin gene fragments were cloned in Escherichia coli and sequenced. The sequences obtained exhibited approximately 98, 99 and 98% sequence identity with reported gene sequences of TeNT/LC, TeNT/HC and TeNT/HN, respectively. The phylogenetic interrelationship between the neurotoxin gene of Clostridium sp. with previously reported gene sequences of Clostridium botulinum A to G and C. tetani was examined by analysis of differences in the nucleotide sequences. Six amino acids were substituted at four different positions in the light chain of neurotoxin from the isolate when compared with the reported closest sequence of TeNT. Of these, four were located in the β15 motif at a solvent inaccessible, buried region of the protein molecule. One of these substitutions were on the solvent accessible surface residue of α1 motif, previously shown to have strong sequence conservation. A substitution of two amino acids observed in N-terminal region of heavy chain were buried residues, located in the β21 and β37 motifs showing variability in other related sequences. The C-terminal region responsible for binding to receptor was conserved, showing no changes in the amino acid sequence.Nucleotide sequence data reported are available in the EMBL database under the accession numbers CAI79619, AM076940, and CAI79618.’     

当归黄芪半仿生提取物对腹部术后大鼠胃肠运动功能障碍的影响

目的 观察当归黄芪半仿生提取物对腹部术后大鼠胃肠运动功能障碍的影响。方法 SD大鼠结肠2处横向切口,原位缝合,建立腹部手术模型,随机分为模型组、阳性对照组(西沙比利0.003 5 g·kg^-1)、当归黄芪水提物组(AEA,生药5.2 g·kg^-1)、当归黄芪半仿生提取物(SEA)高、中、低剂量组(生药10.5,5.2,2.6 g·kg^-1),设假手术组,每组10只,术后24 h灌胃给药,连续10 d。观察大鼠一般状态,记录首次排便时间和粪便量;测定大鼠摄食量,胃肠推进指数和血浆胃动素(motilin,MTL)和血清胃泌素(gastrin,GAS)水平;观察结肠组织形态Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)结构,检测结肠肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)、肌动蛋白和肌球蛋白含量。结果 术后大鼠排便减少、体质量减轻、胃肠推进指数减小(P<0.05),血浆MTL和血清GAS含量均降低(P<0.01),结肠平滑肌细胞间隙变大,数量减少,ICC结构明显损伤;MLCK、肌动蛋白和肌球蛋白含量明显下降(P<0.01)。给药第9天,SEA高、中剂量组体质量增加(P<0.05,P<0.01),首次排便时间缩短、排便量增多(P<0.05),且24 h食量增加(P<0.05,P<0.01);胃肠推进指数增加、血浆MTL和血清GAS含量均升高(P<0.05,P<0.01),结肠ICC细胞数量较多,结构完整;结肠MLCK、肌动蛋白和肌球蛋白含量均有上升(P<0.05,P<0.01)。结论 当归黄芪半仿生提取物对腹部术后大鼠胃肠运动功能障碍具有一定的治疗作用,作用机制与升高血液MTL和GAS及结肠平滑肌收缩相关蛋白的含量有关。