卵巢癌紫杉醇耐药细胞株的建立及其耐药机制探讨

目的 为探讨卵巢癌细胞多药耐药的发生机制,寻找克服卵巢癌耐药的方法而建立人卵巢癌紫杉醇(TAX)耐药细胞株SKOV3/TAX.方法 选用卵巢癌细胞株SKOV3,以浓度为300ug/ml的TAX反复大剂量冲击用药,培养8个月后建立TAX耐药细胞株,命名为SKOV3/TAX.该细胞已反复传代3个月以上.结果 SKOV3/TAX细胞耐药性稳定,耐药指数(RI)为10.57.除对紫杉醇耐药外,对环磷酰胺(CTX)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、足叶乙甙(VP-16)有明显的交叉耐药,与亲本细胞相比,细胞倍增时间明显缓慢(P<0.01),G2/M期明显高于亲本细胞,S期比例明显降低(P<0.05),细胞内P糖蛋白(P-gp)表达增加.产生耐药的机制可能与细胞周期改变、细胞凋亡及P-gp的表达增加,导致细胞内TAX聚集量减少有关.结论 SKOV3/TAX细胞耐药性稳定,具有典型的多药耐药表型.     

拓普替康耐药卵巢癌细胞基因的表达变化及意义

目的 探讨人卵巢癌获得性拓普替康（TPT）耐药的相关基因。方法 采用大剂量间歇诱导法，用拓普替康（TPT）反复冲击诱导培养人卵巢癌SKOV3细胞株，建成SKOV3／TPT耐药株。用Affymetrix人类基因组U133A基因表达谱芯片，比较SKOV3／TPT及SKOV3细胞基因表达的差异。选择高表达的基因进行RT—PCR验证。结果 基因芯片检测发现，二者有283种基因表达有显著性差异。有7个差异表达基因可能参与了SKOV3／TPT细胞的耐药机制，其中上调最明显的基因为MRP3，其次为MRP7、钠离子通道蛋白及固醇异构酶基因；明显下调的基因有MRP4、假设蛋白和免疫球蛋白基因。RT—PCR检测MRP3mRNA在耐药细胞中呈高表达，与基因芯片结果一致。结论 MRP3、MRP4、MRP7、钠离子通道蛋白、固醇异构酶、假设蛋白和免疫球蛋白基因为人卵巢癌获得性TPT耐药相关基因。     

卵巢癌细胞卡铂耐药相关肿瘤抑制基因的表达变化及其启动子区甲基化观察

目的观察卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因的表达变化及其启动子区甲基化状态。方法应用分子生物信息学方法,从卵巢癌卡铂耐药基因表达谱芯片中筛选13个肿瘤抑制基因（VHL、COPS2、NOL7、GGNBP2、RBL1、S100A2、PARG1、PERP、TCF3、DNAJA3、ING1、RARRES3、RBBP8）,并采用RT-PCR法检测这些基因在卵巢癌卡铂耐药细胞系（SKOV3-CB）及其亲本细胞系（SKOV3）的表达;分析肿瘤抑制基因启动子区CPG岛并设计出8个基因（VHL、COPS2、NOL7、RBL1、PARG1、PERP、DNAJA3）的引物,采用甲基化特异性PCR法检测SKOV3-CB、SK-OV3细胞8个基因启动子区甲基化状态。结果与SKOV3相比,除GGNBP2基因外,其余12个基因均在SKOV3-CB中表达下调。SKOV3-CB、SKOV3的ING1、DNAJA3、VHL甲基化引物均能够扩增出产物,未甲基化引物均不能扩增出产物;COPS2、PERP甲基化引物均不能够扩增出产物,未甲基化引物均能够扩增出产物;PARG1、NOL7、RBL1甲基化引物与未甲基化引物均能够扩增出产物。结论卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达下调,其启动子区无甲基化;甲基化机制与卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因的表达下调无关。     

lncRNA XIST预警卵巢癌耐药和不良预后的应用价值探讨

［摘要］　目的　探讨lncRNA XIST在预警卵巢癌耐药及临床不良预后的应用价值,为其作为肿瘤标志物应用于临床提供理论依据。方法　基于Oncomine数据库卵巢癌表达谱芯片分析卵巢癌组织与正常卵巢组织的lncRNA XIST表达差异。基于GEO和TCGA数据库独立表达谱芯片,应用Kaplan-Meier plotter和ROC plotter分析lncRNA XIST与患者预后的关联性及其在预警化疗药物耐药的价值。应用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）法检测lncRNA XIST在卵巢癌亲本细胞HeyA8及SKOV3、紫杉醇耐药细胞HeyA8-R及SKOV3-R和卡铂耐药细胞HeyA8-CBP和SKOV3-CBP中的表达情况。结果　与正常卵巢组织相比,卵巢癌组织lncRNA XIST表达水平显著下调（P<0.05）。与lncRNA XIST高表达组相比,lncRNA XIST低表达组在总生存期（OS）、无进展生存期（PFS）和进展后生存期（PPS）方面的预后更差（P<0.05）。RT-qPCR检测结果显示,与卵巢癌敏感细胞HeyA8及SKOV3相比,lncRNA XIST在紫杉醇耐药细胞HeyA8-R和SKOV3-R及卡铂耐药细胞HeyA8-CBP和SKOV3-CBP中均显著下调（P<0.05)。与敏感组织相比,lncRNA XIST在耐药组织中的表达也显著下调,且其低表达潜在预警卵巢癌耐药（P<0.05）。进一步的ROC plotter分析结果显示,对于所有药物耐药,lncRNA XIST的预警截断值为8 977;对于铂类药物耐药,lncRNA XIST的预警截断值为8 977;对于紫杉醇耐药,lncRNA XIST的预警截断值为8 245;对于铂类药物+紫杉醇耐药,lncRNA XIST的预警截断值为8 245,均具有一定的预警价值（P<0.05）。结论　lncRNA XIST有望作为卵巢癌化疗药物耐药和患者预后的预警标志物,具有临床应用价值。     

基因芯片技术筛选卵巢癌紫杉醇耐药差异表达基因的研究

目的应用基因芯片技术研究人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/Tax300与其敏感细胞系OC3之间的基因表达谱差异,筛选耐药相关基因.方法分别提取OC3/Tax300与OC3细胞的总RNA并纯化mRNA;将等量的mRNA逆转录,以Cy5和Cy3标记的cDNA做探针,在BiostarH140S基因表达谱芯片上进行杂交.扫描芯片荧光信号图像,用基因图像分析软件对扫描图像进行数字化处理和分析.结果共筛选出显著表达差异基因234种,其中217种基因表达水平下调,17种基因表达上调;下调基因主要为EB病毒编码核蛋白（EBNA-3）、信号蛋白（COP9）,上调的基因主要是酪氨酸激酶（JAK2）、热休克蛋白（HSPs）、还原型辅酶烟胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）等.结论本研究筛选出的基因可能为进一步探讨卵巢癌肿瘤细胞耐药机制提供新的途径.     

卵巢癌耐药细胞株体外模型的建立及相关研究

目的探讨人卵巢癌细胞多药耐药（MDR）的发生机制。方法以浓度梯度诱导法建立卵巢癌阿霉素（ADM）耐药细胞亚株OVCAR／AR。人多药耐药基因（MDRl）转染OVCAR-3细胞建立多药耐药亚株OVCAR／MDR细胞。流式细胞术检测P-糖蛋白（P-gp）的表达,罗丹明试验检测P-gP的药物转运功能;MTT法检测细胞对化疗药的抵抗性。结果成功地建立了人卵巢癌MDR细胞株0VCAR／AR和OVCAR／MDR。与亲代细胞OVCAR-3相比,两株耐药细胞P-gP的表达水平显著增加,转运功能增强。OVCAR／AR细胞对ADM、泰素（TAX）和顺铂（DDP）产生交叉耐药,而0VCAR／MDR细胞只对前两者产生耐药。结论0VCAR／AR细胞和OVCAR／MDR细胞具有典型的MDR表型,其机制主要是MDR1基因过度表达致细胞内药物浓度减少。     

沉默GRP78基因对人卵巢癌SKOV3细胞侵袭力的抑制作用

目的 探讨RNA干涉技术(RNAi)沉默葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因对人卵巢癌SKOV3细胞侵袭力的影响,阐明GRP78基因沉默对SKOV3细胞侵袭力抑制作用的生物学机制.方法 设计并构建pSilencerTM3.0-H1-GRP78 siRNA重组质粒,脂质体介导转染至SKOV3细胞.RT-PCR和Western印迹法检测GRP78基因表达;RT-PCR检测MMP-2、MMP-9 mRNA表达;Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭力;Transwell小室迁移实验检测细胞迁移率.结果 RT-PCR及Western印迹检测转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞GRP78基因表达抑制;RT-PCR结果显示与对照组相比转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞MMP-2、MMP-9 mRNA表达降低;Transwell小室侵袭实验和迁移实验结果显示转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞穿透细胞数(P＜0.05)和迁移率均明显降低(P＜0.05).结论 ①转染GRP78 siRNA重组质粒有效抑制SKOV3细胞GRP78基因表达;②抑制GRP78基因表达能降低SKOV3细胞的侵袭力和迁移力,有望为抑制卵巢癌转移基因治疗提供新的靶点.     

Ser3位点的Cofilin1磷酸化与老年女性卵巢癌患者紫杉醇耐药的相关性研究北大核心CSCD

目的研究cofilin1的Ser3位点磷酸化与卵巢癌紫杉醇耐药的相关性,并在临床标本中研究磷酸化cofilin对卵巢癌患者生存的预后价值。方法采用分子生物学技术构建野生型cofilin1过表达（wT）、抑制Ser3位点磷酸化活性的cofilin1过表达（S3L）和cofilin1降调（SiRNA-C）质粒,分别转染SKOV3和SK-TR30细胞,比较细胞瞬转后生物学特性和耐药性的改变;收集临床病理证实的且术后接受紫杉醇＋顺铂（TC）化疗的51例初治老年女性卵巢癌患者,其中化疗敏感组30例、耐药组21例,采用免疫组织化学方法检测化疗敏感和耐药组病理切片中cofilin1和磷酸化cofilin两种蛋白的表达差异,以及对卵巢癌患者的预后价值。结果过表达cofilin1的SKOV3细胞,与对照组细胞比较,G0／G1期细胞显著增多（P=0．034）,S期细胞显著减少（P=0．031）,细胞凋亡率明显降低（P=0．020）;但当Ser3位点磷酸化活性被抑制后,以上生物学特性消失。当SK-TR30细胞cofilin1表达下调时,G0／G1期细胞减少（P=0．020）。cofilin1在化疗敏感组和耐药组卵巢癌组织病理切片中的阳性表达率为56．7％（17／30）与57．1％（12／21）,差异无统计学意义（χ2=0．332,P=0．943）;磷酸化cofilin则分别为53．3％（16／30）与85．7％（18／21）,差异有统计学意义（χ2=5．829,P=0．016）。同时,磷酸化cofilin高表达的患者,尤其是对化疗敏感的患者,与低表达组比较,无进展生存时间（PFS）显著缩短（χ2=21．440,P〈0．01,95％CI：0．068-0．883）。结论Ser3位点的cofilin1的磷酸化与卵巢癌紫杉醇耐药相关,但相关调控机制有待于进一步研究。     

LAMC3低表达对卵巢癌细胞紫杉醇耐药的影响

目的 探讨层粘连蛋白γ3亚基(LAMC3)低表达对卵巢癌细胞紫杉醇耐药的影响。方法 采用Western blot检测卵巢癌紫杉醇耐药细胞HeyA8-R(H-R)及其亲本细胞HeyA8(H)中LAMC3的表达水平。通过慢病毒转染H-R细胞构建LAMC3低表达的稳定细胞株H-R-C3 shRNA3及其对照细胞株H-R-C3 Scramble。通过CCK-8法检测细胞对紫杉醇的半数抑制浓度(IC₅₀),通过平板克隆形成实验验证细胞克隆形成能力。通过Western blot实验检测多药耐药、铁死亡、细胞周期、凋亡等关键通路蛋白的表达情况。结果 与卵巢癌亲本细胞H和对照细胞H-R-C3 Scramble相比,LAMC3在卵巢癌紫杉醇耐药细胞H-R和H-R-C3 shRNA3中的表达显著降低。敲减LAMC3表达可降低卵巢癌紫杉醇耐药细胞对紫杉醇的耐药性及其平板克隆形成能力。Western blot实验结果显示,在梯度浓度紫杉醇药物处理下,与H-R-C3 Scramble细胞相比,H-R-C3 shRNA3细胞的多耐药蛋白多重耐药1/ATP结合盒亚族B1(MDR1/ABCB1)...     

甲基莲心碱对人卵巢癌顺铂耐药逆转的体外研究

目的研究甲基莲心碱（Nef）在人卵巢癌耐药细胞SKOV3／顺铂（DDP）对DDP敏感性中的作用,初步探讨其化疗增敏的作用机制。方法采用MTT比色法筛选Nef对细胞株的无毒剂量,并测定Nef干预后SKOV3／DDP对DDP耐药性的变化;免疫细胞化学法检测Nef对SKOV3／DDP细胞GST-π竹蛋白表达的影响;RT—PCR法分析Nef作用SKOV3／DDP细胞株不同时间GST-π mRNA水平表达的差异。结果不同浓度DDP与Nef联合应用使DDP对SKOV3／DDP细胞IC50明显下降,且逆转倍数随药物作用时间延长而增大,24h、48h、72h分别为1．15、1．91、2．28倍（P〈0．01）;镜下SKOV3／DDP细胞较SKOV3细胞高表达GST-π,经Nef作用72h后其GST-IT表达明显下降（P〈0．01）;无毒剂量Nef作用1、3、5d后SKOV3／DDP细胞内GST-π mRNA转录水平随作用时间延长而降低（P〈0．01）。结论Nef能有效逆转SKOV3／DDP细胞的耐药性,其逆转机制可能与下调GST-π基因高表达有关。     

Pim-3慢病毒质粒构建及其表达鉴定

目的 构建Pim-3慢病毒质粒,鉴定其在卵巢癌SKOV3细胞中基因及蛋白水平的表达.方法 RT-PCR法提取Pim-3 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP重组;酶切鉴定及基因测序后,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中;收集病毒上清液转染SKOV3细胞,荧光显微镜下观察转染情况,应用RT-PCR及Western blot法分别检测Pim-3 mRNA及其蛋白.结果 RT-PCR法获得Pim-3基因,重组质粒酶切后片段大小及基因测序结果显示pCDH/Pim-3重组质粒构建成功.将感染重组质粒及空载体的293T细胞生产的病毒上清分别感染SKOV3细胞,感染重组质粒的SKOV3细胞中Pim-3 mRNA及蛋白表达水平均高于空载体细胞.结论 成功构建了pCDH/Pim-3重组慢病毒质粒,建立了Pim-3高表达SKOV3瞬转细胞模型,为探讨Pim-3在卵巢癌发生、发展中的作用及机制奠定实验基础.     

67kD层粘连蛋白受体在三种卵巢癌细胞株中表达的研究

目的 检测三种不同来源卵巢癌细胞株中67kD层粘连蛋白受体（67k DLN-R）的表达,探讨其在卵巢癌侵袭转移中的作用。方法 体外培养腹水来源的人卵巢癌细胞株HRA、SKOV3及性实体瘤来源的人卵巢腺癌细胞株3AO。以免疫组化和逆转录-聚合酶链反应技术（RT-PCR）检测各细胞株中67kD LN-R蛋白表达及其mRNA水平。结果 三种细胞的胞膜及胞浆中67kD LN-R蛋白均呈阳性表达,但HRA、SKOV3明显强于3AO细胞,差异有显著性（P均〈0．05）;HRA、SKOV3均可见明显的474bp的67kD LN-R特异性条带,其mRNA分别为1．156、1．081;3AO特异性条带极弱,其mRNA为0．358;前两者与后者相比,差异有显著性（P均〈0．05）。结论 67kD LN-R在卵巢癌侵袭转移中发挥重要作用。     

全反式维甲酸对卵巢癌SKOV3细胞增殖、分化的影响

目的 探讨全反式维甲酸（ATRA）对卵巢癌SKOV3细胞增殖、分化的影响.方法 以1×10^-6 mol/L的ATRA处理人卵巢癌SKOV3细胞为实验组,细胞不加ATRA处理为对照组.应用MTT法测定细胞增殖抑制率,流式细胞仪测定细胞周期分布,免疫组化法检测鼠抗人分化相关基因1（NDRG1）表达,显微镜观察细胞形态变化.结果 与对照组比较,实验组细胞增殖抑制率、NDRG1表达升高（P均＜0.05）;随着作用时间延长,实验组G/G0期细胞增多、S期细胞减少,显微镜下可见细胞生长差,增殖缓慢,分裂像少见.结论 ATRA有较强的抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖和诱导其分化作用.     

吉西他滨对人SKOV3卵巢癌细胞株细胞增殖和Skp2的影响

目的探讨不同浓度吉西他滨对体外培养人SKOV3卵巢癌细胞株细胞增殖和S期激酶相关蛋白2（Skp2）表达的影响。方法不同浓度（0、10、20、40和60μmol/L）吉西他滨作用于人SKOV3卵巢癌细胞株后72h,通过细胞计数试剂盒CCK-8检测各组卵巢癌细胞增殖情况,采用免疫细胞化学染色法和RealTime PCR技术检测各组Skp2蛋白及其mRNA水平。结果不同浓度吉西他滨作用于人SKOV3卵巢癌细胞株72 h后,随着浓度增加细胞增殖明显受限,Skp2蛋白及其mRNA水平降低,并且上述结果与吉西他滨浓度均呈负相关。结论吉西他滨能够抑制SKOV3卵巢癌细胞株的增殖,机制可能与抑制Skp2表达有关。     

卵巢癌CD90^＋肿瘤细胞的分离及其肿瘤干细胞生物学特性观察

目的：分离人卵巢癌细胞系SKOV3和原代卵巢癌细胞中的CD90^＋细胞,并观察其肿瘤干细胞的生物学特性。方法从卵巢癌患者腹水中分离原代卵巢癌细胞,采用流式细胞术检测人卵巢癌细胞系SKOV3和原代卵巢癌细胞的CD133、CD90阳性率。流式分选得到CD90^＋、CD90^-细胞后,采用RT-PCR法检测其干细胞及上皮间质化（EMT）相关基因mRNA相对表达,Transwell小室侵袭试验观察细胞侵袭力,克隆形成试验观察细胞增殖分化能力,悬浮成球试验观察干细胞潜能,免疫缺陷小鼠体内有限稀释成瘤试验观察成瘤时间和成瘤率。结果人卵巢癌细胞系SKOV3的CD133和CD90阳性率均低于原代卵巢癌细胞,P均＜0．05。在人卵巢癌细胞系SKOV3和原代卵巢癌细胞中,CD90^＋细胞干细胞相关基因（CD133、OCT4）和EMT间质标志相关基因（N-cadherin、Vimentine、MMP9）相对表达、穿到膜背面的细胞数、细胞克隆数、悬浮成球数均高于CD90^-细胞,EMT上皮标志相关基因E-cadherin相对表达均低于CD90^-细胞,P均＜0．05。随着接种细胞数目的增加,CD90^＋、CD90^-细胞的成瘤率和成瘤时间均升高,CD90^＋细胞升高更明显。结论卵巢癌细胞中,CD90^＋细胞高表达间质属性基因和干细胞相关基因,具备更高的侵袭力、增殖分化能力、体内成瘤能力和干细胞潜能,CD90^＋细胞分离可能成为卵巢癌干细胞分离的新方法。     

细胞间黏附分子-1对卵巢癌单克隆细胞侵袭能力的影响

目的探讨细胞间黏附分子（ICAM）-1对卵巢癌单克隆细胞侵袭能力的影响。方法通过克隆技术和细胞电泳。从卵巢癌SKOV3细胞分离出具有高侵袭能力（S1）和低侵袭能力（S2I）的单克隆细胞亚系，并接种于裸鼠体内。用免疫组化法观察裸鼠移植瘤组织中ICAM-1的表达。通过MTT法细胞黏附实验和Boyden小室法体外侵袭实验检测ICAM-1在S1细胞黏附侵袭过程中的作用。结果S1细胞株成瘤率高，瘤块与周围组织粘连明显；S1瘤块的ICAM-1表达高于S21瘤块。ICAM-1抗体对S1细胞黏附及侵袭人工基底膜能力的抑制率分别为41．9％和55．0％。结论ICAM-1在卵巢癌侵袭转移过程中发挥重要作用。     

槲皮素对卵巢癌细胞HO-8910增殖的抑制作用及机制

目的观察槲皮素体外对卵巢癌HO-8910细胞增殖的抑制作用,并探讨其机制。方法将体外培养卵巢癌HO-8910细胞用0、10、20、40、80、160μmol／L的槲皮素处理。用MTF法测定细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡率,细胞免疫化学染色法检测细胞内Fas及HSP70的表达,分光光度计法检测细胞内Caspase-3和Csapase-8的活性。结果浓度10～160μmol／L的槲皮素均能抑制人卵巢癌HO-8910细胞的增殖,并有明显的时间和剂量依赖性（P〈0．05）。不同浓度的槲皮素作用48h后各组细胞凋亡率随槲皮素浓度增高,HSP70表达下调,FAS表达增强,Caspase-3、8活性上调,均呈剂量依赖性（P均〈0．05）。结论槲皮素能抑制卵巢癌细胞的增殖。其机制可能与槲皮素通过提高细胞内Fas的表达,降低HSP70的表达及诱导Caspase-3、8的活化及诱导卵巢癌细胞凋亡有关。