我国患者多重耐药乙肝病毒感染的基因型和表型特点

目的分析我国大样本来源的慢性乙肝病毒(HBV)感染患者多重耐药HBV的基因型和表型特点。方法回顾性分析11 800例慢性乙肝患者血清中HBV反转录酶(RT)区与核苷(酸)类似物耐药相关的突变类型及频率,采用PCR产物直接测序法和克隆测序法(≥20个克隆/样本)对其中的46例多重耐药HBV突变株进行鉴定。采用体外表型耐药分析法检测核苷类与核苷酸类联合处理对多重耐药HBV的抑制效果。分析临床治疗方案在多重耐药HBV感染的发生及控制中的作用。结果在11 800例慢性HBV感染者中,共3658例(31.0%)检出核苷(酸)类耐药相关突变,其中拉米夫定(LAM)耐药突变2592例(70.9%),阿德福韦酯(ADV)耐药突变665例(18.2%),恩替卡韦(ETV)耐药突变293例(8.0%),替比夫定(LdT)耐药突变62例(1.7%),同时针对核苷类和核苷酸类的多重耐药(MDR)突变46例(1.3%)。对46例多重耐药感染样本的克隆测序显示,40例样本在同一病毒基因组上检出MDR突变,其他6例样本的MDR突变则存在于不同的HBV基因组中。基因型分析显示共有15种病毒变异形式,同时耐LAM(或LdT)和ADV,以及同时耐ETV和ADV的MDR株分别为10种和5种。体外表型耐药分析结果显示,ETV(或LAM)和ADV联合用药可有效抑制HepG2细胞内MDR HBV的复制,但对野生株无类似效果。临床用药方案分析显示,多重耐药HBV感染常出现在LAM(或)LdT、ADV、ETV序贯治疗的患者,以LAM→ADV(22例)和LAM→ADV→ETV(10例)最多见,发生多重耐药后大多出现病毒学和(或)生化学突破。LAM+ADV或ETV+ADV联合挽救治疗可成功将大多数多重耐药HBV的DNA复制控制在检测不到的水平。结论我国MDR HBV株具有多样性和复杂性,表型分析和临床观察均证实核苷与核苷酸类似物联合使用可有效控制MDR HBV复制。多重耐药HBV感染的发生与临床长期应用核苷(酸)类似物序贯治疗有关,密切监测病毒应答及耐药突变对于临床尽早制定最优的抗病毒策略具有重要意义。     

1121例慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区的耐药突变分析

目的 分析大样本慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶基因上的多位点核苷(酸)类似物的耐药相关突变情况及其临床意义.方法 提取1 121例患者血清HBV DNA,采用巢式PCR方法 扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对12个位点上的耐药相关突变进行检测,并结合临床资料进行分析.结果 检出拉米夫定(LAM)耐药突变228例,阿德福韦(ADV)耐药突变32例,恩替卡韦(ETV)耐药突变13例,替比夫定(L-dT)耐药突变4例.多药耐药5例.LAM耐药突变中以M204V和M2041最常见,前者通常伴随U80M突变,后者常单独出现;ADV耐药突变中以N236T±A181位碱基替换为主;ETV耐药突变发生在LAM耐药基础上,以T184位碱基替换为主;L-dT的耐药突变为M2041.结论 用基因序列测定法检测HBV RT基因多位点耐药相关突变,有助于临床及时发现乙肝患者是否存在HBV基因耐药,合理进行抗病毒治疗.     

结合基因型耐药突变检测与表型耐药分析探索乙肝病毒耐药的新认识

核苷(酸)类似物是临床上治疗慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染最常用的药物,但长期应用可引发病毒耐药,导致治疗失败。基因变异检测及表型耐药分析是发现和鉴定HBV耐药的基本方法,前者主要是应用基因测序或线性反向探针杂交等方法,检出已知的病毒耐药相关突变,后者则是在体外细胞水平确定携带有变异基因的HBV毒株对病毒复制力及核苷(酸)类药物敏感性的影响,是鉴定复杂与特殊HBV耐药变异的基本手段。我们通过技术创新,建立了敏感、特异、经济、高效的HBV基因型检测方法,进而建立了可靠的HBV复制力和表型耐药分析方法,广泛应用于临床样本分析,实现了对HBV耐药的早期发现及对新的非典型HBV耐药相关突变株的鉴定。我们近期在核苷(酸)类似物耐药和应答不佳的患者中检测到多种特殊和复杂HBV耐药相关突变,并结合临床资料,进一步对代表性变异株进行病毒复制力和表型耐药分析,取得了多项重要发现:①从大样本中检出和鉴定了多种多重耐药HBV变异株,并发现联合用药可协同抑制多重耐药HBV变异株的体外复制;②HBV rtL229替换可作为补偿变异,恢复拉米夫定耐药变异株rtM204I的病毒复制力;③rtM204Q是一种新的拉米夫定耐药相关突变;④rtA181C+rtL180M+rtM204V与恩替卡韦耐药相关;⑤同一耐药患者血清HBV虽检出耐药变异,但外周血单个核淋巴细胞(PBMCs)中的HBV cccDNA仍以原始野生株为优势种群,提示PBMCs为体内HBV野生株的"存储库",参与HBV肝外感染。上述发现对深入揭示HBV耐药变异的临床特点和发生机制,辅助临床合理制定并优化抗病毒治疗方案具有重要作用。     

拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者HBV聚合酶基因的突变模式分析

目的 分析慢性乙型肝炎患者在拉米夫定(LAM)治疗过程中出现LAM耐药后,HBV聚合酶基因的突变模式及临床特征.方法 对2005年12月-2007年12月于第二军医大学长海医院住院或感染科门诊诊治的慢性乙型肝炎LAM耐药患者进行HBV聚合酶基因测序,回顾性分析LAM耐药时HBV聚合酶基因的不同突变模式及患者临床特征.结果 215例患者诊断为LAM耐药,192例患者检测到LAM相关的HBV聚合酶基因突变.患者血清HBV DNA水平为6.25±1.31(log10拷贝/ml),ALT中位水平为75U/L(19～821U/L),72.4%(139/192)的患者出现ALT升高、肝炎发作.99.0%(190/192)的患者存在YMDD基序突变,其中4种主要突变类型是:rtM204I(33.9%),rtL180M rttM204V(26.0%),rtLl80M rtM204I(21.9%)rtV173L rtL180M rtM204V(11.5%).与rtM204I相比,rtM204V多以联合rtL180M突变的形式存在(P<0.05).LAM耐药时,4种突变类型患者的血清HBVDNA、ALT岍差异均无统计学意义(P>0.05).结论 YMDD基序突变是LAM耐药后HBV聚合酶基因突变的主要模式,LAM耐药后患者临床病情轻重可能与HBV聚合酶基因突变类型无关.     

HIV感染者/AIDS患者肝组织中HIV核酸的检测

目的 检测HIV核酸在肝脏组织中的分布情况,初步探讨HIV引起肝损害的机制.方法 选取12例HIV感染者和5例AIDS患者,取其肝脏标本(其中15例活检,2例尸检),使用4条3'末端生物素标记的HIV gag区保守序列的寡核苷酸探针混合后进行原位杂交实验,由2名病理科医生和2名传染病科医生共同读取结果,衬染后蓝色为阳性信号.结果 所有17份标本的单个核细胞和窦壁细胞胞质中均有阳性信号,此外有4份标本(标本6、11、15、17)的肝细胞胞质中有阳性信号,其中2例免疫组化结果显示肝细胞内也有HIV p24抗原,而血清抗HIV阴性患者肝组织和未加探针的阴性对照均未见阳性信号.AIDS患者肝组织中阳性杂交信号较HIV感染者明显.结论 HIV可能直接感染了肝脏组织的多种细胞,包括Kupffer细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞以及肝细胞等.HIV感染肝组织的情况可能与免疫抑制的程度相关.     

HIV/AIDS患者中弓形虫感染情况的调查

目的了解HIV/AIDS患者中弓形虫的感染情况。方法采用ELISA法检测HIV/AIDS患者、静脉吸毒者及正常对照组中的弓形虫特异性抗体IgG、IgM,流式细胞仪计数HIV/AIDS患者的CD4＋T淋巴细胞,依据CD4＋T淋巴细胞数值分为免疫功能正常、损伤、严重损伤和AIDS晚期4组。结果静脉吸毒者及正常对照组的弓形虫特异性抗体IgG、IgM阳性率分别为2.2%、0和4.7%、1.2%;HIV/AIDS患者中弓形虫特异性抗体IgG、IgM阳性分别为9.7%和1.2%,IgG阳性率以免疫功能损伤组的13.2%为最高,AIDS晚期组为0,且80.7%的患者出现不同程度的免疫功能损伤。结论在HIV/AIDS患者中存在着较高的弓形虫机会性感染,可结合CD4＋T淋巴细胞计数对患者进行预防性服药。     

阿德福韦酯单药或联合拉米夫定治疗拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者的临床研究

目的 评价拉米夫定(LAM)耐药慢性乙型肝炎患者给予阿德福韦酯(ADV)单药治疗或ADV+LAM联合治疗的有效性与安全性. 方法 124例LAM耐药的慢性乙型肝炎患者,其中74例接受ADV+LAM联合治疗,50例接受ADV单药治疗,两组患者基线特征无差异.在基线或治疗期间发现病毒学突破的任一时间点上,进行HBV聚合酶基因测序以明确LAM和ADV的相关耐药突变情况,治疗期间监测所有患者的临床及实验室相关指标. 结果 ADV单药治疗组患者HBV DNA下降的对数值,在第12周(1.99±0.64)和第24周(2.61±0.80)均明显低于ADV+LAM治疗组(2.55±0.74,3.19±0:82,P＜0.01).ADV单药治疗组患者的病毒学应答率,在第12周(52.0%)和第24周(78.0%)时明显低于ADV+LAM治疗组(78.4%,P＜0.01;91.9%,P＜0.05).在开始ADV治疗24周后,ADV+LAM治疗组中,血清HBV DNA下降到检测限以下的患者占70.3%,明显高于ADV单药治疗组的48.0%(P＜0.05).治疗第48周时,ADV+LAM治疗组43例患者疗效稳定,未出现ADV耐药,而ADV单药治疗组27例治疗时间达到48周的患者中,有4例(14.8%)出现了ADV耐药,两者之间差异显著(P＜0.05). 结论 ADV联合LAM治疗与ADV单药治疗相比,可使患者获得更好的病毒学应答,ADV联合LAM治疗可作为LAM耐药患者的首选治疗方案.     

流感病毒耐药机制研究进展

流行性感冒一直是世界上高发的传染病之一,每年全球约10%的人口感染流感.仅20世纪,就爆发了3次世界性的流感大流行,导致数亿人感染.2009年甲型H1N1流感全球大流行再一次引起各国对流感的重视.     

乙型肝炎病毒耐药的检测方法与临床意义

核苷(酸)类似物是目前临床进行抗乙型肝炎病毒(HBV)治疗的主要药物,但长期使用可引起病毒突变产生耐药。基因型耐药和表型耐药分析是病毒耐药性检测的两种基本手段,前者主要通过基因测序和线性反向探针杂交等方法检测HBV基因组中已知与耐药相关的病毒变异;后者则是确定"新发"与复杂HBV耐药变异的必要方法 ,其基本策略是构建HBV变异株与野生株基因组重组载体,转染细胞系后定量检测HBV复制中间体,比较在不同药物浓度下病毒复制力的受抑制程度。建立敏感、特异、经济、高效的检测方法是基因型耐药和表型耐药分析应用于临床的基础。我们近期的研究发现临床存在恩替卡韦和阿德福韦多药耐药突变病毒株,HBV基因型/亚型与耐药突变类型相关,耐药病毒株可以传播引起急性肝炎,rt229变异可以增强耐药变异病毒株的复制力等,这些发现对深入揭示HBV耐药变异的临床特点、加强HBV耐药管理具有重要意义。     

烧伤创面耐药金黄色葡萄球菌的分离及其norA基因突变分析

目的 探讨野生型耐药金黄色葡萄球菌的norA基因及其启动子的突变情况.方法 分离并筛选出10株烧伤刨面的耐药性金黄色葡萄球菌,对norA基因及其启动子进行测序并分析其改变.结果 共分离出金黄色葡萄球菌87株,它们对万古霉素100%敏感,对奎奴普汀和呋喃妥因也有很高的敏感性,而对其余抗生素的耐药率则非常高;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的阳性率达到91.7%.所有10株实验菌的norA基因编码区都有1 349位G→A的点突变,也就是氨基酸的291位处存在Gly(甘氨酸)→A8p(天冬氨酸)的突变.利血平逆转实验提示10株细菌对三种抗生素的MICs值均存在不同程度的下降.结论 norA基因突变是金黄色葡萄球菌耐药的机制之一.

Abstract：

Objective To investigate the genetic mutation of the norA gene and its promotor from the wild-type drug-resistance Staphylococeus aureus(S.aureus)strains. Methods A total of 10 antibiotic-resistant S.aureus strains were isolated and screened from the burn wound for the sequencing and analysis of the nora gene and its promoter. Results There isolated 87 S.aureus strains from the burn wound flora,which were completely sensitive to vacomycin,highly sensitive to Quinupristin and Nitrofurantoin,but highly resistant to the other antibiotics,even up to91.7% of MRSA.There found the same point mutation(G→A) located at 1 349 sites of the norA gene coding region in all the S.aureus strains,saying that the amino acid was changed from Gly(glycin)to Asp(agpartic acid) in 291 sites.The resetpine reverse test showed that the MICs value of three antibiotics was lowered at various degrees in all 10strains.Conclusion NorA gene mutation is one of the mechanisms for antibiotic-resistance of S.aureus.     

21例HIV感染者/艾滋病患者HIV载量及CD4细胞数分析

目的 :分析我国HIV感染者 艾滋病患者CD4细胞数和HIV载量的演变过程、相互关系及其与病程发展的关系。方法 :分别用NASBA方法和流式细胞仪绝对计数法检测 2 1名HIV感染者 艾滋病患者的HIV病毒载量和CD4细胞数。对 15名病例随访 4次以上 ,随访时同样检测HIV病毒载量和CD4细胞数 ,并观察临床变化。结果 :在全部 81组数据中 ,CD4细胞数小于 10 0 mm3的 34组数据HIV载量全部大于 10 4 cp ml,而CD4细胞数大于 4 0 0 mm3的 2 7组数据 ,6 3.6 %HIV载量小于 10 4 cp ml(P <0 .0 5 )。HIV载量越高、CD4细胞数越低 ,二者呈明显的负相关关系 (r=0 .974 )。CD4细胞数低于 30 0 mm3的 9例患者中有 5例在随访过程中出现HIV载量的上升和CD4细胞数的下降 ,2例患者死亡。CD4细胞数大于 4 0 0 mm3的 6名患者HIV载量和CD4细胞处于波动状态 ,临床情况较好。结论 :HIV病毒载量较低和CD4细胞数较高 ,患者的预后较好 ,二者均为评估疾病进程的有效指标     

Activation-induced pyroptosis contributes to the loss of MAIT cells in chronic HIV-1 infected patients

Background: Mucosal-associated invariant T(MAIT) cells are systemically depleted in human immunodeficiency virus type 1(HIV-1) infected patients and are not replenished even after successful combined antiretroviral therapy(cART).This study aimed to identify the mechanism underlying MAIT cell depletion.Methods: In the present study, we applied flow cytometry, single-cell RNA sequencing and immunohistochemical staining to evaluate the characteristics of pyroptotic MAIT cells in a total of 127 HIV-...     

血液病血小板输注疗效分析

目的分析血液病患者血小板输注无效（platelet transfusion refractoriness,PTR）原因,以提高血小板输注率。方法分析血液病患者胛R的临床特征,比较输注单采血小板＋少白细胞红细胞（少白组）、单采血小板＋悬浮红细胞（悬浮组）、单采血小板（单采组）患者的血小板输注疗效。结果93例血液病患者盯R率平均为25．0％。少白组、悬浮组、单采组的胛R率分别为21．2％、32．7％、26．7％（X2=5．66）,结果无统计学意义,但少白组有低于其他两组的趋势。结论影响血液病患者PRT原因虽然有非免疫性因素,而减少输入白细胞数量可提高血小板输注。