乙型肝炎病毒反转录酶区rtI233V变异的演变及病毒学特点分析

目的 分析乙型肝炎病毒(HBV)反转录酶区rtI233V变异的演变规律及其与阿德福韦酯(ADV)耐药的相关性.方法 分析9830例慢性HBV感染者血清样本中HBV rtI233V变异的检出率.选择其中2例代表性患者,动态收集血清样本,扩增HBV RT基因并克隆测序(＞20个克隆/样本),观察rtI233V变异的演变过程.构建pTriEx-HBV(C)1.1倍野生株和3种变异株(rtI233V、rtN236T、rtI233V+rtN236T)复制子,瞬时转染HepG2肝癌细胞,分别加入不同浓度的拉米夫定(LAM)、ADV、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦(TDF).采用实时荧光定量PCR去检测不同浓度药物作用后细胞培养上清中HBV DNA的水平,分析变异病毒复制力与表型耐药的变化特点.结果 9830例慢乙肝患者血清样本中共检出rtI233V位点变异28例,检出率0.28％,其中rtI233V单独变异19例,与rtN236T等经典耐药变异联合出现9例.该变异的检出患者均有ADV治疗史,其中16例(57.1％)接受ADV单药治疗6个月以上,12例(42.9％)接受包括ADV的多药序贯联合治疗1年以上.病毒复制力与表型耐药分析显示,rtI233V变异株的复制力与野生株接近,rtN236T变异株的复制力较野生株显著降低;rtI233V变异株对LAM、ADV、ETV和TDF均敏感,rtI233V+rtN236T联合变异对耐药性的影响不大,但rtI233V变异可明显恢复rtN236T变异株受损的复制力.结论 rtI233V位点变异与ADV应答不佳相关,虽不直接降低病毒对ADV的敏感程度,但可增加经典ADV耐药病毒株的复制力,是一种复制力补偿变异.     

慢性乙肝患者HBV反转录酶区新变异rtL180M+A181C+M204V的鉴定及表型耐药特点分析

目的鉴定经核苷(酸)类似物序贯治疗的慢性乙肝患者HBV反转录酶(RT)区的新变异rtA181C,并分析其表型耐药特点。方法 2010年6月解放军302医院确诊的慢性乙肝患者1例,提取血清HBV DNA,巢式PCR扩增HBVRT全基因,采用PCR产物直接双向测序结合克隆测序分析HBV RT区12个耐药相关突变位点。构建代表性克隆重组表达载体pTriEx-HBV1.1,瞬时转染人肝癌细胞系HepG2细胞,转染4h后加入不同浓度拉米夫定(LAM,终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)、阿德福韦(ADV,终浓度为0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L)、恩替卡韦(ETV,终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L)和替诺福韦(TDF,终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L),4d后采用实时荧光定量PCR检测不同药物浓度作用下培养细胞上清中HBV DNA的复制水平并分析其表型耐药特点。结果此例慢性乙肝患者序贯接受LAM治疗36个月→ADV治疗14个月→ETV治疗29个月,而后发生病毒学突破,HBV DNA由阴性升高至1.1×106IU/ml,ALT由正常升高至235U/L。直接测序显示HBV RT基因rtL180M+A181V+M204V变异,克隆测序得到18个克隆,其中9个为rtL180M+A181V+M204V变异株,7个为rtL180M+A181C+M204V变异株,1个为rtV173L+L180M+A181V变异株,1个为野生株。病毒复制力检测结果从高到低依次为:野生株>rtV173L+L180M+A181V>rtL180M+A181C+M204V>rtL180M+A181V+M204V。表型耐药分析显示,与野生株比较,rtL180M+A181V+M204V变异株和rtV173L+L180M+A181V变异株对LAM和ADV不敏感,rtL180M+A181C+M204V变异株对LAM和ETV不敏感。结论长期核苷(酸)类似物序贯治疗可引起多重耐药;rt181位点新的变异rtA181C与ETV长期用药有关,可能是新的ETV耐药变异位点。     

焦磷酸测序法在HBV阿德福韦酯耐药检测中的应用

目的 评价焦磷酸测序法在慢性乙型肝炎(CHB)患者阿德福韦酯(ADV)耐药检测中的应用.方法 选取ADV治疗失败的CHB患者,采用PCR产物焦磷酸测序法检测ADV耐药相关的rtA181V/T和rtN236T变异,并与PCR产物双脱氧测序法进行比较.计算两种方法的耐药检出率及采用焦磷酸测序法检出的变异株在病毒群中所占的比例.结果 共入选患者210例,经双脱氧测序法与焦磷酸测序法检测共确认耐药变异患者67例,耐药变异位点92个,其中焦磷酸测序法检出耐药患者64例(95.52%)、变异位点86个(93.48%),双脱氧测序法检出耐药患者52例(77.61%)、变异位点71个(77.17%),两种方法结果符合率为83.8%.焦磷酸测序法检出44例发生单位点变异的患者,其中变异株比例＜50%的患者26例,最低耐药株比例为6.5%.rtA181T、rtA181V、rtN236T变异的平均变异株比例分别为34.12%、61.23%、59.69%.其中mA181V与rtN236T的变异株比例无明显差异(P=0.909),但均高于rtA181T的变异株比例(P＜0.01,P＜0.05).结论 焦磷酸测序法的ADV耐药检出率优于双脱氧测序法,前者可进一步计算患者体内变异株的比例;在大部分患者中检出耐药时变异株不一定是优势株.     

96例急性乙型肝炎患者HBV多聚酶区的耐药变异分析

目的检测未接受过核苷(酸)类似物(NA)治疗的急性乙型肝炎患者感染的HBV是否存在耐药变异。方法收集96例急性乙型肝炎患者住院早期血清,提取HBV DNA,采用巢式PCR方法扩增HBV反转录酶(RT)全基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对RT/S基因序列进行分子进化树分析反基因分型,对rt80、rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt236和rt250等位点上的耐药相关变异进行分析,并用克隆测序法进行验证,每个样本测定10～20个克隆。结果用直接测序法检出NA耐药变异8例(8.3%),C型6例,B型2例。其中6例为拉米夫定(LAM)耐药变异,包括4例rtM204I、1例rtL80I+rtM204I和1例rtL180M+rtM204I;另2例检出与阿德福韦酯(ADV)耐药相关的rtA181V变异。变异株多数与野生型病毒株共存。克隆测序法的结果与直接测序法的结果大体相符,部分样本中有2种或多种耐药变异株共存,其中1例患者的样本中除LAM变异株外,还检出了ADV和恩替卡韦(ETV)耐药变异株,变异形式分别为rtA181T+rtN236T和rtL180M+rtS202G+rtM204V。结论未接受过NA治疗的急性乙型肝炎患者可以感染NA耐药株病毒,NA耐药病毒可以在人群中传播引起急性乙型肝炎,变异病毒的传播致病不只局限于LAM耐药株。     

接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者HBV反转录酶区新变异rtM204Q的表型特点分析

目的分析乙肝病毒(HBV)反转录酶(RT)区YMDD功能域新变异rtM204Q的表型特点。方法从1例接受拉米夫定(LAM)治疗的慢性乙肝患者血清中提取HBV DNA,扩增HBV全长RT区基因,PCR产物直接克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选40个克隆进行DNA序列测定并分析耐药相关变异。将Xho I/Sph I双酶切后的RT片段与载体连接成含HBV 1.1倍基因组长度的重组载体。采用FuGENE HD试剂盒,将构建的含野生株和变异株的重组载体转染至人肝癌细胞系HepG2细胞。转染4h后加入不同浓度的核苷(酸)类药物[LAM终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L;阿德福韦酯(ADV)终浓度为0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L;恩替卡韦(ETV)终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L;替诺福韦酯(TDF)终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L],隔天换药,连续作用4d后收集细胞上清,采用实时荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下HBV DNA的复制水平,以分析变异株的表型特点。结果对从患者血清获得的37个克隆进行测序分析,结果显示13个(35.1%)为野生型,11个(29.7%)为rtM204Q突变型,2个(5.4%)为rtM204I突变型,10个(27.0%)为rtA181T突变型,1个(2.7%)为rtA181T+rtM204Q突变型。后4种变异株的复制力分别是野生株复制力的89.95%、46.28%、55.77%和34.44%(P<0.05)。前2种变异形式的表型耐药分析结果显示,rtM204Q对LAM的敏感性为野生株的1/75.68,而rtM204I对LAM的敏感性不及野生株的1/1000。rtM204Q和rtM204I株对ADV、ETV和TDF均敏感。结论 HBV RT区新的YQDD基序变异在一定程度上抑制病毒复制力,对LAM的敏感性降低,提示这可能是一个新的LAM耐药相关变异。     

乙型肝炎病毒反转录酶区新型多重耐药突变的鉴定

目的分析乙型肝炎病毒(HBV)反转录酶区rtA181S相关新型多重耐药突变的临床发生特点及表型特征。方法回顾性分析2012-2017年就诊于解放军总医院第五医学中心(原解放军第302医院)并接受核苷(酸)类似物(NAs)耐药检测的16 443例慢性HBV感染者的临床资料和序列信息,统计经典NAs耐药突变以及rtA181S相关突变类型;对检出率最高的rtA181S+T184I+M204I突变样本进行克隆测序(≥20个克隆/样本);通过表型分析了解病毒的复制力及药物敏感性。结果 16 443例慢性HBV感染者中共检出124例rtA181S突变,其中21例与拉米夫定(LAM)耐药突变共存,74例与恩替卡韦耐药突变(ETVr)共存,rtA181S+T184I+M204I突变占rtA181S+ETVr突变的77.0%(57/74)。对有动态临床诊疗信息患者的分析显示,rtA181S+T184I+M204I突变可在使用阿德福韦酯(ADV)、ETV和(或)LAM/替比夫定(LdT)后出现,并伴随病毒学突破或应答不佳。体外表型耐药分析显示rtA181S+T184I+M204I突变株对LAM、ADV和E...     

拉米夫定耐药的HBV再感染者阿德福韦酯治疗前后HBV多聚酶基因区序列演变的研究

目的 探讨原位肝移植(OLT)后对拉米夫定(LMV)耐药的乙型肝炎复发者应用阿德福韦酯(ADV)治疗前后HBV多聚酶(P)基因区序列的演变,为肝移植后乙型肝炎复发的抗病毒治疗,以及针对病毒逃逸株的疫苗研制提供一定的理论依据.方法 8例LMV耐药的HBV再感染者接受了ADV治疗,对2例治疗无效的患者服药前后HBV P基因区进行PCR扩增及TA克隆,随机选取10个阳性克隆进行DNA序列测定及分析.结果 核酸序列分析未发现目前已证实的与ADV耐药性变异有关的A181V/T及rtN236T变异体,但有多个目前未报道的氨基酸替换位点,且服药前均有与LMV耐药性变异有关的rtL180M变异体存在.结论 rtL180M替换可能影响ADV的抗病毒疗效;ADV耐药性变异很可能还存在于A181V/T及rtN236T以外的位点,抑或ADV耐药性变异株出现较晚.     

我国患者多重耐药乙肝病毒感染的基因型和表型特点

目的分析我国大样本来源的慢性乙肝病毒(HBV)感染患者多重耐药HBV的基因型和表型特点。方法回顾性分析11 800例慢性乙肝患者血清中HBV反转录酶(RT)区与核苷(酸)类似物耐药相关的突变类型及频率,采用PCR产物直接测序法和克隆测序法(≥20个克隆/样本)对其中的46例多重耐药HBV突变株进行鉴定。采用体外表型耐药分析法检测核苷类与核苷酸类联合处理对多重耐药HBV的抑制效果。分析临床治疗方案在多重耐药HBV感染的发生及控制中的作用。结果在11 800例慢性HBV感染者中,共3658例(31.0%)检出核苷(酸)类耐药相关突变,其中拉米夫定(LAM)耐药突变2592例(70.9%),阿德福韦酯(ADV)耐药突变665例(18.2%),恩替卡韦(ETV)耐药突变293例(8.0%),替比夫定(LdT)耐药突变62例(1.7%),同时针对核苷类和核苷酸类的多重耐药(MDR)突变46例(1.3%)。对46例多重耐药感染样本的克隆测序显示,40例样本在同一病毒基因组上检出MDR突变,其他6例样本的MDR突变则存在于不同的HBV基因组中。基因型分析显示共有15种病毒变异形式,同时耐LAM(或LdT)和ADV,以及同时耐ETV和ADV的MDR株分别为10种和5种。体外表型耐药分析结果显示,ETV(或LAM)和ADV联合用药可有效抑制HepG2细胞内MDR HBV的复制,但对野生株无类似效果。临床用药方案分析显示,多重耐药HBV感染常出现在LAM(或)LdT、ADV、ETV序贯治疗的患者,以LAM→ADV(22例)和LAM→ADV→ETV(10例)最多见,发生多重耐药后大多出现病毒学和(或)生化学突破。LAM+ADV或ETV+ADV联合挽救治疗可成功将大多数多重耐药HBV的DNA复制控制在检测不到的水平。结论我国MDR HBV株具有多样性和复杂性,表型分析和临床观察均证实核苷与核苷酸类似物联合使用可有效控制MDR HBV复制。多重耐药HBV感染的发生与临床长期应用核苷(酸)类似物序贯治疗有关,密切监测病毒应答及耐药突变对于临床尽早制定最优的抗病毒策略具有重要意义。     

1121例慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区的耐药突变分析

目的 分析大样本慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶基因上的多位点核苷(酸)类似物的耐药相关突变情况及其临床意义.方法 提取1 121例患者血清HBV DNA,采用巢式PCR方法 扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对12个位点上的耐药相关突变进行检测,并结合临床资料进行分析.结果 检出拉米夫定(LAM)耐药突变228例,阿德福韦(ADV)耐药突变32例,恩替卡韦(ETV)耐药突变13例,替比夫定(L-dT)耐药突变4例.多药耐药5例.LAM耐药突变中以M204V和M2041最常见,前者通常伴随U80M突变,后者常单独出现;ADV耐药突变中以N236T±A181位碱基替换为主;ETV耐药突变发生在LAM耐药基础上,以T184位碱基替换为主;L-dT的耐药突变为M2041.结论 用基因序列测定法检测HBV RT基因多位点耐药相关突变,有助于临床及时发现乙肝患者是否存在HBV基因耐药,合理进行抗病毒治疗.     

乙肝病毒多聚酶区rtL229突变的演变及其表型分析

目的分析乙肝病毒(HBV)多聚酶的反转录酶(RT)功能域rtL229突变的演变规律及其与拉米夫定(LAM)耐药的相关性。方法回顾性分析2010年8月在解放军302医院抗病毒治疗过程中发生rtL229F突变的1例慢性乙肝患者的临床资料,从其动态血清中扩增HBV RT基因并克隆测序(>20个克隆/样本)以观测rtL229F突变的演变过程。同时将含有不同突变形式(rtM204I、rtL229F以及rtM204I+rtL229F)的HBV DNA RT区基因定向克隆至HBV1.1载体中获得可复制的HBV复制子,将复制子转染HepG2细胞,在含或不含核苷(酸)类似物[LAM、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦酯(TDF)]的培养基中连续培养4d,采用实时荧光定量PCR法检测上清中产生的HBV DNA。结果 LAM治疗过程中,rtL229F突变可继发于rtM204I突变,而停用LAM后可逐渐回复为野生型。表型分析结果显示,单独rtL229F突变不改变病毒的药物敏感性,而与rtM204I突变联合后可以增强突变HBV的LAM耐药性。结论 rtL229F位点突变是LAM耐药突变的补偿突变,与LAM应答不佳相关,且对ADV、ETV及TDF敏感。     

Fulminant hepatitis B

Fulminant hepatitis, or fulminant hepatic failure, is defined as a clinical syndrome of severe liver function impairment, which causes hepatic coma and the decrease in synthesizing capacity of liver, and develops within eight weeks of the onset of hepatitis. Several independent factors influence the survival of patients: age, the cause of liver disease, the degree and the duration of encephalopathy in relation to the onset of the disease, and the prevention of complications. Over the years many intensive treatments have been practiced. Liver transplantation is expensive, and patients who survive transplantation require life-long immunosuppression, clinical care and complications management. Without transplantation fulminant hepatitis and hepatic failure might be completely recovered spontaneously, and the patient could expect a normal life. Two cases of fulminant B hepatitis with intensive care treatment, and their survival despite unfavorable prognosis are presented in this paper. The management of patients with fulminant hepatitis required intensive monitoring and therapeutic measures, including corticosteroids. The prognosis for survival without transplantation in fulminant hepatitis is limited by the measures of medical treatment and new specific therapeutic modalities which must be developed through basic research.     

不同基因型HBx对乙型肝炎病毒复制的影响

目的探讨A、B、C和D四个基因型乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis Bvirus Xprotein,HBx）对乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus,HBV）复制的影响。方法构建含A、B、C和D四种基因型HBx的真核表达载体和提前终止HBx表达的突变型单倍体HBV表达系统,共转染至人肝肿瘤细胞系HepG2细胞,利用荧光素酶报告系统检测不同基因型HBx对HBV核心启动子的激活作用,利用酶联免疫法（ELISA）检测培养上清中HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的表达情况,利用特异性引物PCR方法检测细胞中HBV前基因组RNA（pgRNA）和总RNA（pgRNA,2.2kb和0.8kbRNA）的转录情况。结果 A、B、C和D四种基因型HBx的表达均可显著激活HBV核心启动子活性,但不同基因型HBx的激活作用不同。除C基因型外,A、B和D三种基因型HBx均可显著增强HBsAg和HBeAg的胞外分泌水平。检测HBV复制中间产物发现,C基因型HBx对HBVpgRNA和总RNA转录水平的影响显著低于A、B和D基因型。结论不同基因型HBx对HBV复制的影响不同,为进一步研究HBV基因型与HBV复制能力以及临床病理表现的关系打下基础。     

前S1抗原在乙型肝炎诊断中的作用

目的：分析乙型肝炎病毒前S1抗原（PreS1）与乙型肝炎病毒（HBV）复制的关系。方法：采用酶联免疫吸附实验（ELISA）方法对364例乙型肝炎不同标志物的患者血清进行PreS1测定并与用荧光定量聚合酶链反应对HBV—DNA进行含量测定，然后做对比分析。结果：364例乙型肝炎患者中，167例HBsAg、HBeAg、抗HBc^＋阳性组中PreS1叶。144例（86．2％），HBVDNA阳性147例（88．0％），这组患者病毒高度复制，PreS1和HBVDNA两者间差异无显著意义，P〉0．05。122例HBsAg、抗HBe、抗HBc阳性组中PreS1^＋38例（31．1%），HBVDNA阳性43例（35．2％），表明HBeAg阴性患者仍有病毒复制，两者间差异无显著意义，P〉0．05。65例HBsAg和抗HBc阳民生组中PreS1^＋17例（26．2％），HBVDNA^＋20例（30．7％），表明病人仍有病毒在复制。10例HBsAg、HBeAg阳性组中PreS1^＋7例（70．0％），HBVDNA＋9例（90．0％），表明病人病毒在复制。结论：乙肝病毒前S1抗原是乙肝病毒在体内复制和传染的可靠指标，特别是在反映HBeAg阴性的乙型肝炎患者是否有病毒复制的诊断中有重要意义。     

乙型肝炎免疫发病机制研究进展

介绍了人体免疫细胞T细胞、B细胞以及树突状细胞（dendritic cell，DC）在急性和慢性乙肝病毒感染后的免疫发病机制及其发展规律中的作用研究进展，并阐述了它们在乙肝慢性化机制中的作用。     

乙型肝炎患者不同血清标志物HBV DNA的表达及意义

 目的探讨血清HBV DNA水平与HBV标志物(HBVM)表现模式的相关性.方法血清HBV DNA定量检测采用PCR ELISA法,HBVM采用ELISA法.结果在HBVM阳性的366例血清中,有199例HBV DNA阳性,占54.4%.血清HB-/ml占65.2%;HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性者HBV DNA-HBc阳性者HBV DNA阳性率占95.2%,≥106 copiessAg、HBeAg、抗阳性率占29.1%,≥106 copies/ml占17.6%.结论血清HBVM阳性患者中约55.0%的血清HBV DNA阳性,且HBeAg阳性患者中HBV DNA含量及阳性率均明显高于抗-HBe阳性者;在抗-HBs、抗-HBc阳性或HBsAg阴性者血清内也有HBV DNA阳性者.     

女性乙型肝炎病毒携带者卵巢颗粒细胞中乙型肝炎病毒感染情况与临床检测结果分析

目的分析女性乙型肝炎病毒(HBV)携带者卵巢颗粒细胞中HBV感染情况与临床检测结果。方法选取自2014年1月至2016年1月于自贡市第三人民医院接受辅助生育治疗的40例女性患者作为研究对象,其中,20例患者为HBV携带者(携带组),20例患者为非HBV携带者(非携带组),分离患者卵泡液中的颗粒细胞并制成涂片。应用经地高辛标记的特异性HBV DNA探针,通过原位杂交对颗粒细泡涂片进行检测;应用碱性磷酸酶系统进行显色反应。结果携带组患者的颗粒细胞涂片显示,5例可见200个成簇的颗粒细胞,细胞核中检测出20个HBV DNA阳性细胞;6例患者可见220个片状、单层的颗粒细胞,细胞核中检测出8个HBV DNA阳性细胞;9例患者可见180个成簇的颗粒细胞,细胞核中检测出4个HBV DNA阳性细胞。非携带组患者的颗粒细胞涂片为阴性。显色10 min时,患者未出现阳性信号;显色20 min时,4例患者出现阳性信号;显色30 min时,3例患者背景着色较深,阳性信号不易辨认,忽略不计。因此,20 min为显色的最佳时间。结论女性HBV携带者卵巢颗粒细胞中具有HBV DNA,可通过生殖细胞向子代传播乙型肝炎。因此,应加强对HBV携带孕产妇的健康宣传教育,并采取有效措施进行阻断。     

慢性乙型肝炎患者血清HBV全长序列分析及复制力评价

目的 分析乙型肝炎患者HBV全长基因组序列并对其复制力进行评价.方法 从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV病毒DNA,PCR扩增HBV全长基因组,克隆到pGEM-Teasy载体中,每个样品挑选5～10个克隆测序,分析基因型以及全长基因组耐药相关的突变位点,并对个别位点进行定点突变.将克隆到pGEM-Teasy载体中的全长HBV基因组经BspQ Ⅰ/Sca Ⅰ双酶切后,转染入肝癌细胞系HepG2、Huh7.转染3d后榆测上清HmAg表达量及细胞内HBV复制中间体核心颗粒DNA载量,分析全长HBV基因组的复制力(1.0倍HBV复制模型).结果 从2份慢性乙型肝炎患者血清中成功获得5条HBV全长克隆,来自同一份血清的克隆核苷酸,其一致性为98%～100%,提示HBV存在准种特性.测序结果 表明5条HBV全长基因均为C型.通过定点突变又获得3个全长克隆.经序列分析发现,HBV反转录酶区存在A181V/S、L229M、V84M、M204I氨基酸位点的突变,前C/C区存在T1753C、A1762T、G1764A和G1896A核苷酸位点的突变.复制力分析提示上述位点突变后病毒复制力均有不同程度下降,L229M还可以进一步降低A181V突变株的复制力.结论 自行建立的无载体1.0倍HBV复制模型可在细胞内分泌抗原蛋白以及装配子代病毒,完成生活周期,这为下一步分析HBV的耐药表型打下了基础.此外,还可指导临床制定更加合理的抗病毒策略,筛选针对已出现或将来可能出现的耐药突变的新型抗病毒药物.     

慢性乙肝患者石蜡包埋肝组织中HBV cccDNA定量检测方法的建立

目的建立慢性乙肝患者微量石蜡包埋肝组织共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)定量检测方法。方法以37例慢性乙肝患者甲醛固定石蜡包埋肝组织为研究对象,提取肝组织HBV DNA,经不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)消化后,利用滚环扩增加跨缺口实时荧光PCR扩增技术检测肝组织中HBV cccDNA含量,以β-actin为内参照。通过已知浓度的模板DNA进行梯度稀释鉴定该方法的灵敏度,并对该方法进行批内和批间重复性检测。应用该方法分析37例慢性乙肝患者肝组织HBV cccDNA与血清总HBV DNA、肝组织总HBV DNA的关系,以及肝组织HBV cccDNA和HBV DNA与血清HBeAg表达之间的关系。结果成功建立了微量石蜡包埋肝组织HBV cccDNA的定量检测方法,该方法具有较好的特异性、灵敏度和稳定性。HBeAg阳性者肝组织中cccDNA含量明显高于HBeAg阴性者,HBV cccDNA水平与血清总HBV DNA水平(R2=0.48,P=0.042)及肝组织总HBV DNA水平(R2=0.63,P=0.001)呈正相关。结论该方法可特异灵敏地定量检测微量石蜡包埋组织切片中的HBV cccDNA。