谷氨酰胺对热打击下单层肠上皮Caco-2细胞屏障功能的影响

目的 探讨谷氨酰胺(Gln)对热打击后肠黏膜单层上皮细胞屏障通透性改变的影响及可能机制.方法 应用Caco-2细胞株建立肠上皮机械屏障模型,加入Gln培养24h,43℃持续1h热打击.以CCK-8法检测不同浓度Gln(0.4、0.7、1.4、2.1、2.8mmol/L)对细胞增殖的影响,为后续实验选择最适合浓度;Transwell法测定单层跨膜电阻抗(TEER)值和对辣根过氧化物酶(HRP)的通透性;Western blotting检测紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达;采用考马斯亮蓝对细胞骨架进行染色观察.结果 0.7mmol/L的Gln促进细胞增殖的效果最强,与其他浓度相比,差异均有统计学意义(P<0.05).相较于单纯43℃热打击组,0.7mmol/L的Gln可抑制单层上皮细胞TEER的下降和HRP通过率的升高(P<0.01),增加occludin和ZO-1的表达,有益于维持细胞骨架的正常结构.结论 0.7mmol/L的Gln可减轻热打击对单层肠上皮细胞结构的破坏,保护屏障功能.     

肠上皮内淋巴细胞对肠上皮屏障功能的影响

目的：研究在痢疾志贺菌F2a-12脂多糖刺激下，大鼠小肠上皮内淋巴细胞（IEL）对人结肠癌上皮细胞系Caco-2屏障功能的影响。方法：新鲜分离的大鼠小肠IEL与Caco-2共培养，并用F2a-12LPS刺激共培养细胞。通过检测短路电流、紧密连接相关蛋白表达及透射电镜来反映上皮屏障功能的变化。结果：共培养后跨上皮电阻增加，但在LPS刺激后显著降低；紧密连接相关蛋白ZO-2mRNA表达在共培养后增加，LPS刺激后共培养细胞ZO-1mRNA表达显著下降；透射电镜下可见共培养后细胞间紧密连接显著增强，但在LPS刺激后共培养细胞间的连接几乎消失。首次在电镜下发现上皮细胞与IEL间有连接样结构的存在，为其相互作用提供了形态学的证据。结论：IEL对上皮屏障功能具双向调节作用，在生理状态下增强，但在感染信号存在时降低。     

热打击致大鼠肠上皮IEC-6细胞钙超载损伤的初步研究

目的 研究不同程度热打击对体外培养大鼠肠黏膜上皮细胞IEC-6的钙超载及钙超载相关的损伤.方法 设置培养IEC-6细胞的温度梯度,Fluo-3Am探针加荧光显微镜及流式细胞术观察细胞内钙离子水平的改变,相差显微镜观察细胞形态学改变,考马斯亮蓝染色法观察细胞骨架变化,CCK-8法观察细胞活性改变,黏附实验观察基底膜黏附性改变.结果 与正常对照组比较,热打击组细胞内钙水平上升(P＜0.01),呈温度依赖性.热打击组细胞形态变圆,伪足变短,细胞间隙增大,45℃较43℃改变更为明显.考马斯亮蓝染色显示,热打击组细胞骨架增粗、紊乱,出现应力性纤维,45℃较43℃改变更为明显.CCK-8法显示,热打击组细胞活性下降(p＜0.01),呈温度依赖性.基底膜黏附实验显示,热打击组基底膜黏附性显著下降(P＜0.01),呈温度依赖性.结论 热打击可造成IEC-6细胞钙超载,并造成与钙超载相关的一系列细胞损伤,热打击对于肠黏膜上皮钙超载的影响及其机制的进一步研究将有助于了解热射病的发病机制.     

活性氧在热打击诱导肠上皮细胞凋亡中的作用

目的 观察热打击对大鼠肠上皮细胞(IEC-6)氧化应激反应、溶酶体损伤及细胞凋亡的影响,探讨中暑热损伤过程中肠道损伤的机制.方法 将IEC-6细胞分为对照组(细胞仅置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育)、热打击组(细胞置于43℃、5%CO2细胞培养箱中1h,之后分别置于正常细胞培养箱中继续孵育0、1、3、6、12h)、药物干预组(于热打击前分别采用溶酶体抑制剂E-64和活性氧清除剂NAC预处理细胞1h).采用DCFH-DA法检测细胞内活性氧(ROS)的表达,吖啶橙(AO)染色法检测溶酶体膜稳定性,AnnexinⅤFITC/PI双染色法检测细胞凋亡率,CCK-8法检测细胞活力.结果 与对照组比较,热打击后复温1h即导致IEC-6细胞活力下降,凋亡增加,且在复温后12h时最为明显(P<0.05);热打击后即刻即引起细胞内ROS表达及"苍白细胞"数量增加,且在复温后12h时最为明显(P<0.05).与热打击组比校,采用NAC对细胞进行预处理可明显提高热打击后细胞活力,减轻溶酶体损伤,并降低细胞凋亡率(P<0.05);采用E-64对细胞进行预处理可明显提高热打击后细胞活力,并降低细胞凋亡率(P<0.05).结论 ROS介导了热打击诱导肠上皮细胞凋亡的调控,这可能是中暑导致肠道黏膜屏障功能损伤的重要机制之一.     

热打击诱导骨骼肌细胞胀亡而非凋亡

目的探讨热应激过程中骨骼肌细胞发生损伤的具体形式,以及重症中暑合并横纹肌溶解的机制。方法将人骨骼肌细胞(HSKMC)分为对照组与热打击组,对照组细胞于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中孵育;热打击组细胞于43 ℃、5% CO₂细胞培养箱中孵育2 h构建热打击损伤模型,然后置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中孵育。待孵育0、6、12、24 h后,采用CCK-8法检测细胞活力,LDH法检测细胞毒性,透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化情况,Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色法检测双阳性细胞率,Western blotting检测细胞中porimin、caspase-3蛋白的表达情况。结果与对照组比较,热打击后复温0h HSKMC细胞活力即开始下降,细胞毒性即增加,且均呈时间依赖性(P<0.05)。对照组细胞表面具有丰富的微绒毛,线粒体、内质网等细胞器结构清晰,核大浓染,形态不规则,染色质浓密,核仁大而清晰;热打击组细胞肿胀、体积变大,胞质空泡化,线粒体明显肿胀,脱颗粒,双嵴消失,核周间隙增宽,细胞核凝聚、固缩,...     

烧伤血清对培养大鼠肠上皮细胞间黏附连接的影响

肠黏膜屏障中机械性屏障最为重要 ,其结构基础是肠黏膜上皮细胞的完整性及其相邻肠黏膜上皮细胞间连接。严重烧伤后肠黏膜缺血、缺氧及再灌注导致肠黏膜上皮完整性受损 ,是肠黏膜屏障功能降低的主要原因[1,2 ] 。在维护肠黏膜机械性屏障完整性结构中 ,肠上皮细胞形态结构和功能的完整起着重要的作用。为了深入和系统地了解烧伤后肠上皮细胞间连接的变化 ,笔者以体外培养的肠黏膜上皮细胞株ＩＥＣ - 6为模型 ,动态观察了烧伤血清对肠上皮细胞间的特有成分Ｅ -钙黏附蛋白 (Ｅ -ｃａｄ ｈｅｒｉｎ ,ＥＣＤ)表达的影响 ,为进一步研究肠黏膜上皮…     

鹰嘴豆芽提取物对Caco-2细胞凋亡的作用

目的研究鹰嘴豆芽乙醇提取物（CSE）对人结肠腺癌Caco-2细胞增殖及细胞凋亡的影响。方法提取鹰嘴豆芽的活性成分并测定含量;MTT法观察提取物对Caco-2细胞增殖的影响;透射电镜观察细胞超微结构;琼脂糖凝胶电泳法进行细胞凋亡的DNA分析;流式细胞术检测凋亡情况。结果 CSE含23.53%皂苷、14.73%异黄酮;不同浓度的CSE对Caco-2细胞均有一定的增殖抑制作用,且呈量效和时效关系;细胞出现染色质边移和凋亡小体;DNA电泳呈现梯度条带,表明CSE可诱导Caco-2细胞凋亡;3、5、10μg/ml的CSE作用后,细胞凋亡率分别为32.6%、68.8%、73.9%,与对照组（0.9%）比较差异显著（P〈0.05）。结论 CSE可通过诱导细胞凋亡而抑制人结肠腺癌株Caco-2细胞的生长,为鹰嘴豆应用于结肠癌的临床治疗和预防提供了理论依据。     

烧伤血清对肠上皮细胞屏障功能损伤的实验研究

目的 系统观察烧伤血清对肠上皮细胞屏障功能的影响。方法 制作体外大鼠肠上皮细胞IEC－6 烧伤血清刺激模型，实验分为对照组和烧伤血清组，采用生化检测、图像分析、细胞ELISA、放射免疫等技术，动态观察肠上皮细胞活性、细胞Ca^2 浓度，细胞通透性以有细胞骨架的变化。结果 肠上皮细胞经烧伤血清作用后，细胞活性即开始降低，而乳酸脱氢酶升高，胞浆Ca62 浓度增高2．43倍，单层细胞通透性显著增加，细胞骨架成分肌动蛋白（F－actin）、角蛋白（keratin）、微管蛋白（β－tubulin）表达减少或状态改变。结论 烧伤血清刺激后肠上皮细胞活性降低，通透性增加，细胞骨架表达减少，从而导致肠黏膜细胞屏障功能受损。     

过氧化氢对肠上皮细胞线粒体膜电位及细胞凋亡的影响

目的 :探讨过氧化氢在体外对肠上皮细胞线粒体膜电位的影响及其与细胞凋亡的关系。方法 :肠上皮细胞株 (SW -4 80 ) ,采用过氧化氢 (H2 O2 )损伤模型 ,用 5 0、10 0、2 0 0、4 0 0 μmol·L-1和 4mmol·L-1作用 1、3、6、12及 2 4h。线粒体功能采用噻唑蓝法 (MTT法 ) ;用罗丹明 (Rhodamine- 12 3)荧光探针检查活细胞线粒体膜电位变化 ;用Annexin -Ⅴ荧光探针 ,流式细胞仪检测早期凋亡细胞 ;同时观察细胞形态学和线粒体超微结构的改变。结果 :H2 O2 在低浓度 (5 0、10 0、2 0 0 μmol·L-1)时线粒体功能未见明显改变 ,在高浓度 (4 0 0 μmol·L-1、4mmol·L-1)时可导致线粒体功能不可逆的进行性下降 ,线粒体内嵴减少、肿胀 ;同时使线粒体膜电位显著降低 ,细胞凋亡率显著增加。结论 :线粒体参与了H2 O2 诱导肠上皮细胞的早期程序性死亡及随后的细胞死亡 ,这种损伤作用与线粒体结构、功能改变和膜电位下降密切相关。     

库普弗细胞功能状态对肠缺血再灌注肝、脾、胸腺细胞凋亡的影响

封闭和不封闭ＢＡＬＢ／ｃ小鼠库普弗细胞４８ｈ后,夹闭肠系膜上动脉１ｈ后松夹,复制肠缺血再灌注模型。运用原位细胞ＤＮＡ末端标记和流式细胞术检测缺血前、缺血６０ｍｉｎ、再灌注３０、６０ｍｉｎ肝、脾、胸腺细胞的凋亡情况。     

异丙酚对热打击后内皮细胞线粒体氧化应激损伤的保护作用

目的 探讨热损伤过程中异丙酚对内皮细胞的抗氧化作用以及对线粒体的保护效应.方法 采用43℃培养2h后37℃、5%CO2常规培养6h的方法建立人脐静脉内皮细胞(HUVECs)热打击模型;实验分为37℃组、37℃+脂肪乳组(阴性对照组)、37℃+异丙酚组、43℃组、43℃+异丙酚组、H2O2+异丙酚组(阳性对照组)6组,其中异丙酚、脂肪乳均于热打击或H2O2作用前先行与细胞孵育.应用CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)、线粒体膜电位(ΔΨm)以及线粒体通透性转换孔(MPTP)的变化;荧光素-荧光素酶法检测ATP含量;Caspase活性试剂盒检测caspase-9和caspase-3活性的变化.结果 热打击后,HUVECs活力明显降低,线粒体功能受损(P<0.05);经异丙酚预处理的HUVECs在热打击后保持了细胞活力,胞内ROS水平较单纯43℃热打击组明显降低(P<0.05),线粒体膜电位下降的细胞占比(JC-1单体所占比例)明显减少(P<0.05),线粒体通透性转换孔开放,细胞内ATP含量明显升高(P<0.05),同时线粒体损伤相关的caspase-9/3所介导的线粒体凋亡通路的激活也被抑制.结论 异丙酚在热损伤过程中具有抗氧化损伤、抗凋亡以及线粒体保护作用.     

正加速度暴露下大鼠肠黏膜屏障损伤及sIgA水平的变化

目的 探讨模拟正加速度(+Gz)暴露对大鼠肠黏膜免疫屏障的影响.方法 32只雄性SD大鼠随机分成4组(n=8),通过动物离心机模拟+Gz暴露.A组大鼠不做处理,B组大鼠以+5Gz值旋转5min,C组大鼠以+10Gz值旋转5min,D组大鼠连续暴露于+5Gz值1.5min、+10Gz值2.0min、+5Gz值1.5min.每日暴露1次,持续5d.实验结束后观察大鼠肠黏膜大体损伤情况及镜下表现,ELISA法检测肠黏膜内分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的含量.结果 +Gz暴露后,与A组相比,其他各组大鼠肠黏膜均有损伤,损伤程度D组＞C组＞B组;ELISA检测显示其他各组大鼠肠黏膜sIgA含量均明显下降(P＜0.05),且sIgA含量D组＜C组＜B组(P＜0.05).结论 +Gz暴露可损伤大鼠肠黏膜,并削弱肠黏膜的免疫屏障功能.     

卡巴胆碱对脓毒症大鼠肠道功能的影响

目的　探讨拟胆碱药卡巴胆碱对肠缺血再灌注 (I/R)复合内毒素血症大鼠肠道功能的影响。方法　将成年雄性Wistar大鼠随机分为健康组 (N)、肠系膜上动脉夹闭 1小时后再灌注 2小时组 (I/R2 )、肠系膜上动脉夹闭后再灌注同时给卡巴胆碱 2小时组 (I/RK)、夹闭后再灌注 2小时后给内毒素组 (I/RL)和夹闭后再灌注 2小时后给内毒素同时给卡巴胆碱组 (I/RLK) ,共 5个组。分别测血中肠屏障功能指标二胺氧化酶 (DAO)、D 乳酸、D 木糖含量和肠传输。结果　I/R2 、I/RK、I/RL及I/RLK4组大鼠血浆DAO均较N组显著升高 (P <0 .0 5 ) ,但小肠DAO均较N组显著降低 (P <0 .0 5 )。I/RK和I/RLK组与I/R2 和I/RL组比较 ,前 2组血DAO显著降低 (P <0 .0 5 ) ,而小肠组织DAO显著升高 (P <0 .0 5 )。各实验组血浆D 乳酸含量较N组显著升高 (P <0 .0 5 ) ,给卡巴胆碱的I/RK和I/RLK组较I/R和I/RL组稍有降低 ,但各组间无显著性差别。各实验组小肠传输较N组显著加快 (P <0 .0 5 )。给卡巴胆碱后 ,I/RK、I/RLK组较I/R2 、I/RL组小肠传输稍减慢 ,但组间无统计学差别。I/R2 、I/RK、I/RL和I/RLK组给D 木糖 1小时后血浆D 木糖含量较N组显著升高。结论　肠局部给予卡巴胆碱对大鼠肠缺血再灌注复合内毒素所引起的肠屏障功能的损伤有一定的改善。     

不同程度创伤性脑损伤后肠黏膜屏障功能的变化

目的 探讨不同程度创伤性脑损伤(TBI)后肠黏膜屏障功能的变化.方法 将我院2009年6月～2010年12月收治的50例TBI患者根据入院时格拉斯哥昏迷评分(GCS)分为轻度(n=18),中度(n=18),重度(n=14)3组;30例健康成年体检者为对照组,观察比较其伤后3、12、24小时和72小时血浆二胺氧化酶(DA...     

肠系膜淋巴管结扎对重症中暑大鼠凝血功能的影响

目的 探讨肠系膜淋巴管结扎对重症中暑大鼠凝血功能的影响.方法 40只雄性Wistar大鼠均分为5组(n=8):正常对照组、热应激对照(HSS)组、热应激对照肠系膜淋巴管结扎(HSS-LDL)组、重症中暑(SHS)组和重症中暑肠系膜淋巴管结扎(SHS-LDL)组.制备重症中暑大鼠模型,重症中暑发生时采集外周血行凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)等凝血相关指标的检测,同时对肺脏和肾脏进行组织病理分析.结果 与正常对照组比较,HSS组、HSS-LDL组大鼠凝血指标均无明显变化,而SHS组大鼠PT和APTT均明显延长(P＜0.05),血小板(PLT)计数明显下降(p＜0.05),D-二聚体明显升高(p＜0.05),SHS-LDL组大鼠所有凝血指标呈现部分恢复趋势(p＜0.05).组织病理学分析提示SHS组大鼠肺脏和肾脏呈现严重出血、淤血等病理损害,肠系膜淋巴管结扎部分缓解了脏器组织的出血性病理损害.结论 肠淋巴途径的肠源性毒性物质可能是造成重症中暑全身和脏器凝血功能紊乱的重要原因,肠系膜淋巴管结扎可部分缓解凝血功能紊乱的发生.