转化生长因子β1对种植体表面成骨细胞骨涎蛋白基因表达研究

目的 探讨转化生长因子β1（TGF-β1）对种植体表面成骨细胞中骨涎蛋白（BSP）表达的影响.方法 体外培养成骨细胞接种于钛片表面（模拟种植体植入后的体内环境）,将其分为2个浓度刺激组和对照组.刺激组分别加入0.5、10 μg/L的TGF-β1,对照组不加TGF-β1,分别收集刺激后第2、5、7天培养的细胞,通过RT-PCR检测不同培养时间成骨细胞中的BSP mRNA表达.结果 相对半量分析结果显示：浓度为0.5 μg/L的TGF-β1可增加成骨细胞中BSP的表达（P〈0.05）,而浓度为10 μg/L的TGF-β1可降低成骨细胞中BSP的表达（P〈0.05）.结论 外源性TGF-β1对接种于模拟体内种植体钛片表面的成骨细胞中BSP表达的作用与其浓度有关.     

HSP47在TGF-β1诱导肝星形细胞合成I型胶原蛋白中的作用

目的：探讨热休克蛋白47对转化生长因子β1（transforming growth factorβ1,TGF-β1）所诱导的肝星形细胞合成Ⅰ型胶原蛋白的影响。方法：以重组人1ng/mL和10ng/mL TGF-β1作用于培养的肝星形细胞株HSC-T6,采用热休克反应（heat shock response,HSR）（42℃孵育1h,37℃分别恢复6h,12h,24h,48h）和HSP47反义寡核苷酸分别诱导或抑制HSP47的表达,采用免疫印迹技术检测HSP47及Ⅰ型胶原蛋白的合成。采用MTT法检测细胞存活力。结果：正常状态下,HSC-T6细胞均表达一定量的HSP47和Ⅰ型胶原蛋白;1ng/mL和10ng/mL TGF-β1处理24h均能诱导Ⅰ型胶原蛋白表达,其中以10ng/mL的作用最为明显,同时TGF-β1刺激后也能诱导HSP47的表达。HSR在诱导HSP47表达的同时虽然不能改变Ⅰ型胶原蛋白的合成,却能促进TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原蛋白合成。HSP47反义寡核苷酸在不影响细胞存活力的情况下,能显著抑制HSR诱导的HSP47的表达以及TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原蛋白的表达。结论：HSP47的高表达能增强TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原蛋白合成,可能在肝纤维化的发生发展过程中发挥重要作用。     

HSP47在TGF-β1诱导肝星形细胞合成Ⅰ型胶原蛋白中的作用

目的:探讨热休克蛋白47对转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)所诱导的肝星形细胞合成I型胶原蛋白的影响.方法:以重组人1ng/mL和10ng/mL TGF-β1作用于培养的肝星形细胞株HSC-T6,采用热休克反应(heat shock response, HSR)(42℃孵育1h,37℃分别恢复6h,12h,24h, 48h)和HSP47 反义寡核苷酸分别诱导或抑制HSP47的表达,采用免疫印迹技术检测HSP47及Ⅰ型胶原蛋白的合成.采用MTT法检测细胞存活力.结果: 正常状态下,HSC-T6细胞均表达一定量的HSP47和Ⅰ型胶原蛋白;1ng/mL和10ng/mL TGF-β1处理24h均能诱导Ⅰ型胶原蛋白表达,其中以10ng/mL 的作用最为明显,同时TGF-β1刺激后也能诱导HSP47的表达.HSR在诱导HSP47表达的同时虽然不能改变Ⅰ型胶原蛋白的合成,却能促进TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原蛋白合成.HSP47反义寡核苷酸在不影响细胞存活力的情况下,能显著抑制HSR诱导的HSP47的表达以及TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原蛋白的表达.结论: HSP47的高表达能增强TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原蛋白合成,可能在肝纤维化的发生发展过程中发挥重要作用.     

积雪草酸抑制HSC-T6细胞Ⅰ型胶原蛋白表达

目的:研究外源性TGF-β对肝星状细胞系(HSC-T6)的激活作用,以及积雪草酸抑制HSC-T6细胞Ⅰ型胶原蛋白合成的药理作用.方法:用LDH和MTT实验测定积雪草酸对HSC-T6细胞的细胞毒性和细胞增殖的影响.检测HSC-T6细胞受不同剂量和不同时间TGF-β刺激后表达Ⅰ型胶原蛋白的最佳剂量和时间.以不同剂量的积雪草酸作用于TGF-β活化的HSC-T6细胞,提取细胞总蛋白,以Western Blot方法检测积雪草酸对TGF-β活化的HSC-T6细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的影响.结果:TGF-β刺激HSC-T6细胞表达Ⅰ型胶原蛋白的最佳剂量为1 ng/mL,最佳时间24 h.10～30 μmol/L积雪草酸可以抑制TGF-β诱导的HSC细胞Ⅰ型胶原蛋白表达.结论:外源性TGF-β可激活HSC-T6细胞表达Ⅰ型胶原蛋白;积雪草酸抑制HSC-T6细胞Ⅰ型胶原蛋白表达.     

microRNA-132对肾间质成纤维细胞分泌细胞外基质的调控作用

目的:探讨microRNA-132(miR-132)对转化生长因子(transforming growth factor,TGF)β1刺激后大鼠肾间质成纤维细胞(NRK-49F)的细胞外基质分泌的调控作用。方法:体外培养NRK-49F细胞株,经TGF-β1(2、3、5 ng/mL)作用24 h,或细胞转染miR-132模拟物(rno-miR-132 mimics,50 ng/mL)作用24 h,或rno-miR-132 mimics与TGF-β1共同作用24 h,茎环实时荧光定量PCR(real-time quanti-tative PCR,RT-qPCR)法检测细胞miR-132表达,RT-qPCR法和Western Blot法分别检测细胞胶原蛋白I(Collagen I,Col I)mRNA和蛋白表达。结果:①不同浓度TGF-β1刺激后NRK-49F细胞miR-132和Col I的表达显著升高(P<0.01)。②rno-miR-132 mimics(50 ng/mL)作用NRK-49F细胞Col I表达显著升高(P<0.01)。③与TGF-β1(3 ng/mL)阳性对照组相比,rno-miR-132 mimics(50 ng/mL)与TGF-β1(3 ng/mL)共同作用NRK-49F细胞Col I表达显著升高(P<0.01)。结论:miR-132可以促进TGF-β1诱导的NRK-49F细胞分泌细胞外基质。     

TGF-β1介导新生大鼠心肌成纤维细胞Ⅰ型和Ⅳ型胶原合成的研究

目的:观察TGF-β1对原代培养的新生大鼠心肌成型与Ⅳ胶原表达的影响。方法:取出生3~7d的SD大鼠心脏,利用酶消化法结合差速贴壁体外培养心肌成纤维细胞;分别用不同浓度的TGF-β1(TGF-β1=10 ng/mL、1ng/mL、0 ng/mL)干预心肌成纤维细胞,分别于干预后5h、24h,采用RT-PCR检测I型胶原和Ⅳ型胶原的表达。结果:1.用0ng/mL(对照组),1ng/mL和10ng/mL的TGF-β1干预心肌成纤维细胞5h,RT-PCR检测I型胶原/β-actin光密度值分别为0.61±0.02,0.73±0.03和0.86±0.04,光密度值随着TGF-β1浓度的增加而增加,各组比较,差异有显著性(P<0.01);干预心肌成纤维细胞24h后,RT-PCR检测I型胶原/β-actin光密度值分别为0.65±.03,0.91±0.02和0.98±0.02,光密度值随着TGF-β1浓度的增加而增加,各组比较,差异有显著性(P<0.01)。2.用0 ng/mL(对照组),1ng/mL and 10ng/mL的TGF-β1干预心肌成纤维细胞5h,RT-PCR检测Ⅳ型胶原/β-actin光密度值分别为0.58±0.06,0.71±0.02,0.87±0.02,光密度值随着TGF-β1浓度的增加而增加,各组比较,差异有显著性(P<0.01);干预心肌成纤维细胞24h后,RT-PCR检测Ⅳ型胶原/β-actin光密度值分别为0.62±0.01,0.83±0.05,0.96±0.02,光密度值随着TGFβ1浓度的增加而增加,各组比较,差异有显著性(P<0.01)。结论:TGFβ1能加强I型和Ⅳ型胶原的表达,在24小时内呈时间和剂量依赖性。     

银杏叶提取物对TGF β1诱导α-SMA和Ⅰ型胶原表达的抑制作用

目的探讨银杏叶提取物(EGb)对转化生长因子(TGF-β1)诱导肾纤维化相关细胞因子及细胞外基质表达的影响。方法体外培养的人肾小管上皮细胞(HKC)分为正常对照组(无药物处理)、单纯TGF-β1(8 ng/mL)处理组和TGF-β1(8 ng/mL)与不同浓度EGb(25、50、100、150 mg/L)共刺激组。各组HKC经不同处理72 h后,细胞免疫组化ABC法检测α-SMA表达,实时定量PCR和Western blotting法检测I型胶原表达。结果与正常对照组比较,单纯TGF-β1处理组HKC中α-SMA和Ⅰ型胶原表达明显上调;与单纯TGF-β1处理组比较,TGF-β1与不同浓度EGb共刺激组HKC中α-SMA和I型胶原表达呈剂量依赖性减少。结论银杏叶提取物可抑制TGF-β1诱导的HKC中α-SMA和I型胶原表达,其机制可能与银杏叶提取物抑制肾小管上皮细胞转分化发生有关。     

SAHA对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞胶原蛋白表达的影响

目的探讨辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）对转化生长因子-β1(TGF-β1)所诱导的人胚肺成纤维细胞（HELF）胶原表达的影响。方法体外培养人胚肺成纤维细胞系HELF,并分为空白对照组、SAHA组、TGF-β组以及SAHA＋TGF-β组。其中空白对照组加入等体积PBS;SAHA组加入5 μmol/L SAHA;TGF-β组加入终浓度为5 ng/mL TGF-β1孵育24 h;SAHA＋TGF-β组在TGF-β组基础上分别加入0.5、2.0、和5.0 mol/L SAHA,共同孵育24 h。处理结束后,获取培养上清,比色法测量羟脯氨酸(HYP)的含量,并用逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）检测HELF细胞中Ⅰ、Ⅲ型前胶原的mRNA表达水平。结果对照组脯氨酸表达极低,TGF-β1处理后,羟脯氨酸含量达12.684±1.485 μg/mL。当分别用0.5、2.0、和5.0 mol/L SAHA处理后,HYP含量随着SAHA浓度的增加而减少（P<0.05）;SAHA孵育24 h后,能够明显抑制TGF-β1刺激后的细胞表达Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白mRNA,并且具有明显的剂量依赖性（P<0.05）。结论SAHA能减少TGF-β1诱导的HELF羟脯氨酸含量及Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白表达,这可能是其抗纤维化的重要机制。     

川芎嗪对TGF-β1诱导人胚肾近端小管上皮细胞转分化影响的实验研究

目的利用原代培养的人胚肾近端小管上皮细胞作为研究对象,探讨川芎嗪(TMP)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人胚肾近端小管上皮细胞转分化的影响。方法采用胶原酶消化后系列网筛过滤,再用密度梯度离心分离纯化细胞的方法,进行人胚肾近端小管上皮细胞的原代培养。原代培养的人胚肾近端小管上皮细胞传至第2代后分为5组,空白对照组、10ng/mL TGF-β1刺激组、5ng/mLTMP+10ng/mL TGF-β1刺激组、10ng/mLTMP+10ng/mL TGF-β1刺激组及20ng/mLTMP+10ng/mL TGF-β1刺激组。刺激48h后,采用倒置相差显微镜、透射电子显微镜、酶化学染色和免疫细胞化学方法检测细胞的转分化情况。结果 TGF-β1刺激人胚肾近端小管上皮细胞后细胞拉长呈梭形,细胞间隙加大;电子显微镜下细胞失去极性,微绒毛减少直至消失;碱性磷酸酶染色阴性;细胞角蛋白18(CK-18)表达减弱,波形蛋白(Vimentin)表达增强,并表达α平滑肌肌动蛋白抗体(α-SMA)。各浓度TMP+10ng/mL TGF-β1刺激组细胞的上述变化均有不同程度的减弱,减弱程度与TMP浓度呈正比。结论 TMP能以浓度依赖方式阻止TGF-β1诱导的人胚肾近端小管上皮细胞的转分化。     

TGF-β1对人肾成纤维细胞热休克蛋白47表达的影响

目的 探讨TGF-β1在肾组织纤维化中的作用机制.方法 采用原代培养的人肾成纤维细胞,将细胞分为0、0.1、1、5ng/ml和10ng/ml不同浓度TGF-β1刺激培养组.应用免疫细胞化学方法检测TGF-β1作用下人肾成纤维细胞热休克蛋白47(heat shock protein 47,HSP47)表达,RT-PCR方法检测TGF-β1作用下人肾成纤维细胞HSP47和I型胶原mRNA表达.结果 (1)对照组(0ng/ml TGF-β1组)人肾成纤维细胞几乎无HSP47表达,在 TGF-β1刺激下,培养的人肾成纤维细胞HSP47表达增强.(2)在0.1～5ng/ml范围内,TGF-β1以剂量依赖方式促进培养的人肾间质成纤维细胞表达HSP47和I型胶原mRNA.结论 TGF-β1促进肾组织纤维化形成,可能部分是通过其促进肾间质成纤维细胞表达HSP47,进而增加胶原合成所致.     

健腰密骨片对成骨细胞增殖分化和BMP信号通路报导基因活性的影响

目的:探讨健腰密骨片对成骨细胞的影响及作用机制。方法:常规培养转染12×SBE-OC-Luc报导基因的成骨细胞株OCT-1细胞(以下简称12×SBE-OC-Luc-OCT1细胞),采用健腰密骨片含药血清进行干预48 h,并以骨形态发生蛋白(BMP)2纯化蛋白(50 ng/ml)为阳性对照。用MTT法检测成骨细胞增殖率,实时荧光定量RT-PCR法检测成骨细胞中Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen)、骨钙素(osteocalcin)和BMP2mRNA的表达以及荧光素酶活性检测法检测成骨细胞12×SBE-OC-Luc的活性。结果:与正常对照组比较,健腰密骨片能明显促进成骨细胞的增殖(P0.05);显著增加成骨细胞中typeⅠcollagen、osteocalcin和BMP2的mRNA表达量(P0.05);能明显促进成骨细胞中BMP报导基因12×SBE-OC-Luc的荧光素酶活性(P0.05)。结论:健腰密骨片可通过促进BMP2、typeⅠcollagen和osteocalcin的表达及BMP信号通路报导基因12×SBE-OC-Luc的活性,从而促进成骨细胞的增殖与分化。     

阿尔茨海默病患者血清TGF-β1的测定

目的：探讨阿尔茨海默病中转化生长因子β1（TGF-β1）测定在诊治中的临床价值。方法：酶联免疫吸附分析法（ELISA）测定66例阿尔茨海默病患者和143例正常人血清TGF-β1含量,两者加以比较。结果：阿尔茨海默病组TGF-β1含量明显低于正常组,两组间存在显著性差异（P〈0.05）。结论：TGF-β1参与阿尔茨海默病的发生。     

水飞蓟素对肾小管间质纤维化大鼠肾小管上皮-间质转分化的干预作用

目的:探讨水飞蓟素对肾小管间质纤维化大鼠小管上皮-间质转分化的干预作用。方法:利用单侧输尿管梗阻诱导建立肾小管间质纤维化大鼠模型,56只SD大鼠随机分为模型组24只、治疗组24只、假手术组8只。治疗组给予水飞蓟素30mg/(kg·d)灌胃,模型组和假手术组给予生理盐水灌胃。模型组和治疗组分别于实验第7d、14d、21d各收获大鼠8只,假手术组于第21d一次处死大鼠,进行肾组织病理学观察。用免疫组化方法检测肾组织转化生长因子-β1(TGF-β1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果:实验第7d模型组大鼠出现小管损伤和炎症细胞浸润,随病程进展,上述病变呈进行性加重。水飞蓟素治疗组大鼠在各时间点组织学的改变与模型组相比有明显减轻。免疫组化显示水飞蓟素治疗组在各观察时间点能显著下调TGF-β1和α-SMA在肾小管间质中的表达。结论:水飞蓟素通过下调TGF-β1的表达,有效干预上皮-间质转分化达到改善肾脏纤维化的作用。     

TGF-β1对人粘连成纤维细胞增殖与COL-Ⅰ合成的影响

目的考察TGF-β1对人粘连成纤维细胞（ATF）增殖与COL-Ⅰ合成的影响。方法通过人体腹膜粘连组织原代培养获取ATF,将不同剂量的TGF-β1与ATF共培养48h,MTT法测定细胞增殖活性,ELISA法测定培养基中COL-Ⅰ的含量。结果TGF-β1 0．5～40ng／mL剂量组的ATF增殖活性均高于0ng／mL剂量组,差异有统计学意义（P〈0．01）。TGF-β1 10、20ng／mL剂量组的COL-Ⅰ含量与0ng／mL剂量组差异有统计学意义（P〈0．01）。结论TGF-β1可明显提高人ATF的增殖活性与COL-Ⅰ合成水平。     

TGF-β1对IL-1β诱导人牙周膜成纤维细胞分泌HGF影响的研究

目的研究转化生长因子-β1（TGF-β1）、白细胞介素-1β（IL-1β）干预人牙周膜成纤维细胞后HGF的基因表达的水平变化,为HGF网络调控人牙周膜成纤维细胞功能的研究提供新资料。方法分别采用IL-1β梯度浓度、IL-1β最佳干预浓度和TGF-β1梯度浓度干预第5代人牙周膜成纤维细胞,并运用RT-PCR法检测人牙周膜成纤维细胞中HGF的基因表达。结果经IL-1β单独作用,人牙周膜成纤维细胞中HGF的基因表达水平上调,并优选出IL-1β的最佳干预浓度为10ng/ml（P〈0.05）;当一定浓度的TGF-β1和10ng/ml的IL-1β共同作用于人牙周膜成纤维细胞后,该细胞中HGF的基因表达水平比单独IL-1β作用组低（P〈0.05）。结论 TGF-β1能够抑制IL-1β所诱导的人牙周膜成纤维细胞中HGF的基因表达。     

通络泄浊方对糖尿病肾病大鼠TGF-β1和CTGF的影响

目的：观察通络泄浊方对糖尿病肾病（DN）大鼠肾组织转化生长因子-β1（TGF-β1）和结缔组织生长因子（CTGr）的影响。方法：采用随机数字表法将实验动物分为正常组、模型组、通络泄浊方组（中药组）、氯沙坦组（西药组）和通络泄浊方＋氯沙坦组（中西药组）。采用链脲菌素（STZ）法制作DN大鼠模型,药物干预后以免疫组织化学法和荧光定量PCR分别检测肾组织TGF-β1,和CTGF蛋白及其mRNA的表达。结果：中药组、西药组和中西药组大鼠TGF-β1和CTGF蛋白及其mRNA表达均显著低于模型组（P〈0．05或P〈0．01）,且中西药组CTGF蛋白及其mRNA水平较中药组和西药组均明显降低（P〈0．01）。结论：通络泄浊方和氯沙坦均能抑制DN大鼠肾组织TGF-1与CTGF表达,而且联合使用对CTGF表达作用更明显。     

HIF-1α和GLUT-1在人体退变腰椎间盘中的表达及意义

目的：研究低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）和葡萄糖转运蛋白-1（glucosetransporter-1,GLUT-1）在人体退变腰椎间盘髓核中的表达及意义。方法：对照组为取自青壮年腰椎爆裂性骨折患者的正常椎间盘髓核组织;实验组取自临床患者退变椎间盘髓核组织,依据术前MRI影像表现分为2组。术中所取标本分别进行免疫组织化学染色及RT-PCR检测,比较3组椎间盘髓核组织中HIF-1α和GLUT-1的表达,并对检测结果进行统计学分析。结果：免疫组织化学结果显示在正常人类腰椎间盘组织中HIF-1α和GLUT-1的表达呈弱阳性,中度退变组中HIF-1α和GLUT-1的表达为阳性,重度退变组中HIF-1α和GLUT-1的表达为强阳性,且随着腰椎间盘组织退变的程度加重其表达也进行性加强（P〈0.01）。 RT-PCR结果显示,HIF-1α和GLUT-1基因存在于人体椎间盘髓核组织中,3组患者差异有统计学意义（P〈0.01）。结论：HIF-1α和GLUT-1均可能参与了人类腰椎间盘组织的退变过程,二者在人体退变腰椎间盘组织中有相同的增高趋势。可以考虑通过检测HIF-1α和GLUT-1在椎间盘组织中表达来检测腰椎间盘组织退变情况,从而为预防和治疗腰椎间盘退变的提供新思路和切入点。     

Basigin/CD147参与马兜铃酸损伤人肾小管上皮细胞的体外实验

目的:探讨马兜铃酸(AA)对人肾小管上皮细胞损伤机制及细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(Basigin/CD147)在损伤过程中发挥的作用。方法:不同浓度AA(10、20、40μg/ml)作用于人近端肾小管上皮细胞(HK-2)不同时间(24、48 h)后,MTT比色法检测细胞增殖变化;Basigin/CD147干扰质粒转染HK-2,选取AA最适浓度(20μg/ml),ELISA法检测不同时间段(24、48 h)细胞上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)含量;实时定量(Real-time)PCR法检测Basigin/CD147 mRNA表达;Western印迹检测Basigin/CD147、TGF-β1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达。结果:AA 48 h组TGF-β1含量显著高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组TGF-β1低于48 h AA组(P0.05);AA48 h组Basigin/CD147 mRNA含量显著高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组Basigin/CD147 mRNA显著低于48 h AA组(P0.05);AA 48 h组Basigin/CD147、α-SMA、TGF-β1蛋白表达明显高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组Basigin/CD147、α-SMA、TGF-β1蛋白表达均显著低于48 h AA组(P0.01)。结论:Basigin/CD147参与介导AA所致HK-2细胞损伤过程,干扰Basigin/CD147表达可能抑制AA引起的细胞纤维化;Basigin/CD147蛋白表达调控异常可能是引起马兜铃酸肾病的重要发病机制之一。