混合表皮细胞与脱细胞真皮基质构建复合皮的移植和转归研究

探讨混合表皮细胞与脱细胞真皮体外构建的复合皮作创面移植后的转归。将BALB／c小鼠的表皮细胞和人表皮细胞按一定比例混合，种植于脱细胞真皮基质表面，经体外培养后形成复合皮，然后移植于BALB／c小鼠全层皮肤缺损创面，观察人表皮细胞的转归。结果显示，复合皮移植后可封闭创面，人表皮细胞多位于新生表皮上层，随时间延长，数量逐渐减少并最终被小鼠自体表皮细胞替代。提示两种不同的表皮细胞按一定比例混合培养构建复合皮可封闭全层皮肤缺损创面，可望节省自体皮源，缩短体外培养时间。     

转EGF基因表皮细胞的生物学活性及移植实验

为探讨转表皮细胞生长因子(EGF）基因的人表皮细胞在体外培养条件下及移植后EGF的表达，于体外培养转EGF基因的人表皮细胞，采用ELISA法测定不同培养时间及不同传代数时培养上清中EGF的含量。然后将转基因的人表皮细胞种植于无细胞真皮替代物表面，于体外培养后形成复合皮，移植于裸鼠全层皮肤缺损创面，移植后3周以抗EGF抗体免疫组化染色观察移植后EGF的表达。结果显示，转EGF基因表皮细胞传至第5代仍可分泌EGF，达pg级水平；含转基因表皮细胞的复合皮移植后1—3周、抗EGF染色阳性。提示转EGF基因表皮细胞在体内与体外均可稳定地表达外源基因产物，可望应用于组织工程皮肤的构建。     

无细胞真皮复合皮制备及移植的实验研究

体外构建表皮细胞-无细胞真皮活性复合皮，移植于裸鼠背部创面，并与单纯移植表皮细胞膜片相对照。术后观察创面愈合情况，行光镜、电镜及免疫组化检测。结果示复合皮移植后创面覆盖率高，外观情况良好，收缩程度低。组织学检测提示复合皮移植后上皮分化充分，胶原增生有序，表皮-真皮连接结构重建明显，提示无细胞真皮复合皮移植可改善创面愈合质量。     

海绵状胶原膜作为真皮支架构建复合皮的研究

探讨以海绵状胶原膜作为真皮支架体外构建复合皮的可能性。由新鲜猪皮提取胶原后与硫酸软骨素混合，经真空干燥制成具有立体网状结构的膜片；取正常人包皮环切后的废弃皮肤组织，常规方法分离表皮细胞制成单细胞悬液，滴加于海绵状胶原膜上进行体外培养，观察表皮细胞的生长、增殖情况。结果显示，人表皮细胞种植于海绵状胶原膜上可生长、增殖，融合成片。提示此种海绵状胶原膜对人表皮细胞无明显毒性作用，可作为组织工程构建复合皮的真皮支架。     

自体表皮细胞培养与异体真皮组合应用研究

严重烧伤病人皮肤修复中主要未解决的问题是真皮的替代。动物实验结果表明，异体皮移植后５天，用自体培养表皮细胞膜片覆盖真皮床，１４天后复合皮成活率是８４．６％±２．４％。组织学检查证实表皮已形成了复层结构，可见基底层、颗粒层和角质层。临床应用中，异体皮移植后１０天，去除异体表皮覆盖病人的自体培养表皮，３５天后未见排斥征象，异体真皮促进了培养表皮的分层、成熟和完整，组织学检查证实表皮细胞的边缘清楚，已分化形成颗粒层和角质层，真皮多细胞，已血管化，但表皮嵴缺乏。     

鼠异体无细胞真皮基质（ADM）的制备和应用

目的：通过动物实验方法,探讨一种适合薄的自体断层皮片或培养表皮细胞膜片生长的真皮床,使两者结合成为复合皮,以期为临床应用。方法：将异体鼠的全厚皮切制成厚０．３ｍｍ的中厚皮征,先后经１Ｍ ＮａＣｌ溶液去表皮、０．１％戊二醛交联、０．５％ＳＤＳ脱真皮细胞、０．２５％胰蛋白酶再消化及冷冻干燥处理,清除皮肤中具有抗原性的所有细胞成分,而较完整地保留了无免疫源性的细胞外基质蛋白和胶原,制得无细胞真皮基质（ＡＤＭ）。与薄的自体断层皮片（厚０．１ｍｍ）一起制成复合皮移植于创面上。结果：术后２周见复合皮成活率高。组织学检查证实ＡＤＭ血管化良好,宿主细胞如成纤维细胞可长入ＡＤＭ中。长期观察证实无明显瘢痕形成及挛缩畸形,后期收缩轻;表面平滑,质地柔软,有弹性,无水疱形成及排异反应。结论：目前认为,表皮－真皮复合皮是一种较为理想的真     

异种无细胞真皮基质与薄自体皮复合移植后细胞外基质的变化

目的观察异种无细胞真皮基质与薄自体皮复合移植后细胞外基质的动态变化。方法以SD大鼠为动物模型,在其背部造成4 cm×5 cm的全层皮肤缺损。大鼠分为薄自体皮移植组和猪无细胞真皮基质+薄自体皮移植组,分别于移植后1,2,3,4,8,12,16周取标本,检测羟脯氨酸含量、Ⅰ/Ⅲ型前胶原mRNA的表达、透明质酸含量及纤维连接蛋白的变化。结果猪无细胞真皮基质与薄自体皮复合移植后,各时相点羟脯氨酸含量、Ⅰ型前胶原mRNA的表达均低于薄自体皮移植组(P<0.05);Ⅲ型前胶原mRNA的表达与薄自体皮移植组差异无统计学意义(P>0.05);透明质酸含量高于薄自体皮移植组(P<0.05);而纤维连接蛋白的表达在早期高于薄自体皮移植组,后期则低于薄自体皮移植组(P<0.05)。结论猪无细胞真皮基质与薄自体皮复合移植后能够减少胶原合成和Ⅰ型前胶原mRNA的表达,增加皮肤中透明质酸含量,从而减轻瘢痕增生。纤维连接蛋白早期表达增高有利于创面愈合及基底膜的重塑,而后期表达降低有助于减轻瘢痕增生。     

人工表皮构建及其结构的研究

目的 :以角朊细胞作为种子细胞 ,构建人工表皮 ,检测培养的人工表皮的结构 ,为进一步进行动物移植试验奠定基础。方法 :(1)采用分散酶 (dispase)分离表皮细胞 ,以无血清培养法培养表皮细胞。 (2 )人工表皮构建成功后 ,分别进行HE染色及透射电镜观察。 (3)角蛋白免疫组织化学染色。结果 :经过 2～ 3周的培养 ,表皮细胞连接成片 ,呈现典型的“铺路石”状 ;继续培养 5～ 7d后 ,将细胞膜消化下来 ,HE染色显示由 2～ 4层细胞组成 ,电镜可以观察到桥粒及张力微丝束的结构 ;免疫组织化学染色显示培养细胞和细胞膜角蛋白染色阳性。结论 :该人工构建表皮与人正常表皮结构类似 ,可作为移植物进行深入研究     

人真皮微血管内皮细胞的体外分离和原代培养

目的：建立体外分离及培养人真皮微血管内皮细胞的方法，为进一步开展创面愈合及相关领域的细胞和分子生物学研究提供物质基础和实验模型。方法：健康成人中厚皮组织经中性蛋白酶消化后去除表皮；然后，采取薄片真皮组织胰蛋白酶低湿慢速灌注法消化微血管内皮细胞；将获取的微血管内皮细胞于不同条件的培养基内连续培养５～１５ ｄ，观察其基本生物学生长特征，并采用免疫细胞化学方法行Ⅷ因子相关抗原染色鉴定。结果：①采用中性蛋白酶及胰蛋白酶分步消化法，所分离获得的细胞体外具有很强的增殖能力；该细胞呈现Ⅷ因子相关抗原阳性，说明为真皮微血管内皮细胞；②细胞单层培养时显示活跃的形成类管腔状结构的生物学特征；③真皮微血管内皮细胞在不同培养基内生长状态不同，含８％ 胎牛血清、２ ％ 人分娩前母体血清及适量ｃＡＭＰ等添加物的ＩＭＤＭ 为其较理想的培养基。结论：经体外分离及培养获得了生长性良好的人真皮微血管内皮细胞。     

在体诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞的初步观察

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs)分化为表皮细胞的可行性，方法：抽取小型香猪的骨髓，经密度梯度离心分离、纯化间充质干细胞及培养扩增后，应用5－溴脱氧尿嘧啶（5－BardU)标记技术进行细胞标记。将已标记的细胞以注射方式回植到提供骨髓的香猪的皮内及皮下，分别于注射后1，2周取材，常规石蜡包埋，连续切片，行5－BrdU和角蛋白免疫组织化学染色，对比研究。结果：大多数5－BrdU阳性细胞聚集在真皮中的小血管周围。但有少数5－BrdU阳性标记细胞出现在表皮的棘层和颗粒层，并同时表达角蛋白，结论：在皮肤微环境下骨髓间充质干细胞具有分化为表歧细胞的潜能。     

成纤维细胞生长因子10对人角朊细胞表达GM-CSF的刺激作用

研究FGF 10对角朊细胞表达GM CSF的作用 ,以探讨FGF 10促进创面愈合的机制。按FGF 10的浓度分为 4、16、12 5和5 0 0ng/ml四组 ,细胞接种密度为低密度 (2 5 0 0细胞 /cm2 )和高密度 (5 0 0 0细胞/cm2 )两种 ,分别于FGF 10作用后 2 4、48和 72h收集细胞培养液上清并进行细胞计数 ,测定GM CSF的含量。结果显示 ,低密度接种时 ,2 4h收集的各组上清中均未能检测到GM CSF,48h上清中的12 5ng/ml和 5 0 0ng/mlFGF 10组GM CSF的浓度及单个细胞的GM CSF的分泌均显著高于阴性对照组(P <0 0 5 )。 72h的培养上清中仅5 0 0ng/mlFGF 10组GM CSF的分泌量显著高于对照组 (P<0 0 5 )。高密度接种时 ,2 4h的上清中 16、12 5、5 0 0ng/ml的FGF 10各组GM CSF浓度显著高于对照组 (P<0 0 5 ) ,但单个细胞GM CSF的分泌无显著性变化 (P >0 0 5 ) ,48h的培养上清中 ,FGF 10各组的GM CSF均未升高 ,且 48h各组单个细胞GM CSF的分泌与细胞总数呈负相关 (r2 =0 881,P <0 0 5 )。结果提示FGF 10可能通过刺激GM CSF的分泌来促进创面肉芽组织形成。     

改善珊瑚表面成骨细胞粘附和增殖的研究

新西兰兔骨央基质成骨细胞作为接种珊瑚的种子细胞。珊瑚块分别用多聚赖氨酸、纤维粘连蛋白（Fn)和单纯培养液处理，接种成骨细胞后形成细胞／珊瑚复合物，在体外培养7、14、21天进行观察。电镜显示，第7天和14天，Fn处理的珊瑚表面有更多的成骨细胞粘附和骨基质的形成。经多聚赖氨酸处理的珊瑚与培养液处理的珊瑚比较，虽然在第7天通过DNA含量的测定具有较多的的细胞数，但在第14、21天差异无显著性意义。Fn处理的珊瑚在各时间点细胞数和 碱性磷酸酶活性均高于多聚赖氨酸和培养液处理组，同时细胞数随培养时间呈增长趋势。本文实验结果提示Fn处理珊瑚表面可以明显促进成骨细胞的粘附和增殖。     

异体脱细胞真皮基质与自体皮片复合移植治疗增生性瘢痕临床应用探讨

目的:异体脱细胞真皮基质与自体皮片复合移植是治疗深度烧伤增生性瘢痕的较好方法,可以明显改善手术部位的外观及功能,探讨该方法在不同部位中的应用及具体操作方法和注意事项.方法:在56例患者共78个创面上用商品化的同种异体脱细胞真皮与自体大张刃厚皮片复合移植,术区选择前臂、小腿、大腿、胸部等非功能部位以及膝关节、踝关节、肩关节、髋关节等功能部位,采用一步法.结果:76个创面的复合移植皮片完全成活,前臂、小腿、大腿等非功能部位术区皮片外观、质地和弹性均令人满意,无明显瘢痕形成;胸部术区皮片外观、质地和弹性欠佳,膝关节、踝关节、肩关节、髋关节等功能部位术区皮片外观、质地和弹性绝大多数令人满意,无明显瘢痕形成,关节活动功能明显改善,2个创面因基底血运不良成活欠佳,残留明显瘢痕.结论:一步法复合移植具有较高的成功率,术后效果与术区部位、网状异体脱细胞真皮基质拉网大小、创面基底、自体刃厚皮片质量有关.     

异种(猪)去细胞真皮基质与自体微粒皮及自体刃厚皮复合移植的比较研究

目的　比较异种 (猪 )去细胞真皮基质 (PADM)与自体刃厚皮、PADM与自体微粒和同种异体皮以及自体微粒皮加同种异体皮覆盖烧伤创面后愈合质量的差异。方法　72只SD大鼠背部全层皮肤缺损创面分别用PADM +自体刃厚皮 (实验组I)、PADM +自体微粒皮 +同种异体皮 (实验组II)和微粒皮 +同种异体皮 (对照组 )覆盖 ,术后定期观察创面愈合情况并计算植皮成活率和收缩率 ,同时行组织学观察。结果　实验组I、II复合皮外观较平整 ,植皮成活率高 ,收缩程度轻 ,与对照组比较差异有统计学意义 (P <0 0 5 ) ,且实验组I创面愈合情况优于实验组II。组织学观察实验组I、II上皮化良好 ,胶原纤维排列有序 ,基底膜结构完整。结论　异种 (猪 )去细胞真皮基质与自体刃厚皮覆盖烧伤创面后愈合质量最佳 ,异种 (猪 )去细胞真皮基质与自体微粒和同种异体皮覆盖烧伤创面后愈合质量次之 ,但明显优于微粒皮加同种异体皮组。     

血管内皮细胞生长因子基因转染皮肤成纤维细胞的实验研究

为改善人工复合皮在临床上的应用效果 ,构建人血管内皮细胞生长因子 16 5 (hVEGF165)基因重组载体pcDNA3,并转染成纤维细胞。检测转基因细胞培养上清液VEGF浓度 ;用转基因细胞培养上清液刺激人脐静脉血管内皮细胞 ,观察内皮细胞增殖速度 ;通过Miles实验检测VEGF的生物学活性。结果显示 ,转基因成纤维细胞能够表达一定浓度的VEGF,且具有加速体外培养人脐静脉血管内皮细胞 (HUVEC)生长和增强血管通透性的生物学活性。提示转hVEGF165基因成纤维细胞可修饰人工皮的真皮面。     

In vitro photodynamic effect of aluminum tetrasulfophthalocyanines on melanoma skin cancer and healthy normal skin cells

Photodynamic therapy is a medical treatment that uses an inactive dye/drug and lasers as a light source to activate the dye/drug to produce a toxic form of oxygen that destroys the cancer cells. This study aimed at investigating the cytotoxic effects of different concentrations of aluminum tetrasulfophthalocyanines in its inactive and active state (laser induced) on melanoma skin cancer cells, healthy normal skin fibroblast and keratinocyte cells. Experimentally, 3 × 10? cells/ml were seeded in 24-well plates before treatment with different concentrations of aluminum tetrasulfophthalocyanines. After 2h, cells were irradiated with a light dose of 4.5 J/cm2. Post-irradiated cells were incubated for 24h before cell viability was measured using the CellTiter-Blue Viability Assay. Results showed that aluminum tetrasulfophthalocyanines at high concentrations were cytotoxic to melanoma cells in the absence of laser activation. In the presence of laser activation of aluminum tetrasulfophthalocyanines at a concentration of 40 μg/ml decreased cell viability of melanoma cells to 45%, fibroblasts to 78% and keratinocytes to 73%. At this photosensitizing concentration of aluminum tetrasulfophthalocyanines the efficacy of the treatment light dose 4.5 J/cm2 and the cell death mechanism induced by photoactivated aluminum tetrasulfophthalocyanines was evaluated. A light dose of 4.5 J/cm2 was more efficient in killing a higher number of melanoma cells and a lower number of fibroblast and keratinocyte cells than the other light doses of 2.5 J/cm2, 7.5 J/cm2 and 10.5 J/cm2. Apoptosis features such as blebbing, nucleus condensation, nucleus fragmentation and the formation of apoptotic bodies were seen in the photodynamic therapy treated melanoma skin cancer cells. This in vitro photodynamic therapy study concludes that using aluminum tetrasulfophthalocyanines at a photosensitizing concentration of 40 μg/ml in combination with a laser dose of 4.5 J/cm2 was potentially lethal for melanoma skin cancer cells and less harmful for the normal healthy skin cells.     

异种无细胞真皮动物移植实验研究

目的研究巴马香猪无细胞真皮（acellular dermal matrix,ADM）结合自体刃厚皮移植于皮肤全层缺损大鼠后的免疫排斥反应、移植皮片存活率及创面收缩率。方法将巴马香猪ADM、人ADM及异体大鼠ADM结合自体刃厚皮移植于皮肤全层缺损大鼠背部,与大鼠自体全厚皮片移植组、单纯自体刃厚皮移植组比较,观察移植第1、2、4、8w时免疫排斥反应发生及炎症细胞浸润情况,计算不同时间点移植皮片存活率及创面收缩率。结果巴马香猪ADM和人ADM结合自体皮片移植到大鼠创面后,未引起明显免疫排斥反应,移植皮片存活率及创面收缩率无明显差异;与异体大鼠ADM组移植皮片存活率及创面收缩率之间差异不显著;移植皮片存活率明显低于自体全厚皮片移植组,但显著高于单纯自体刃厚皮移植组,创面收缩率显著低于自体刃厚皮移植组。结论巴马香猪ADM与人ADM具有相似的安全性和有效性,可提高自体皮片存活率,降低创面收缩率,完全可能替代人ADM应用于创伤修复领域。