PGC-1β调节大鼠ALAS-1基因表达机制的初步探讨

目的 检测PGC-1β在人肝癌细胞（Hep G2）和大鼠肝原代细胞中调节大鼠ALAS-1基因表达。方法 在Hep G2细胞中瞬时转染PGC-1β,用双荧光报告系统,检测过表达PGC-1β时,大鼠ALAS-1启动子报告基因的活性变化。同时构建了5'端顺式元件系列截短和突变的ALAS-1启动子报告基因,检测并分析介导PGC-1β作用的转录因子结合元件。分离肝原代细胞并检测PGC-1β对ALAS-1转录的影响。构建干扰NRF-1基因的siRNA腺病毒,证明,NRF-1介导PGC-1β激活ALAS-1启动子转录的作用。结果 在Hep G2细胞中,过表达PGC-1β显著促进ALAS-1表达。分别构建了FoxA2和NRF1结合元件突变的ALAS-1启动子,发现PGC-1β对NRF1突变的ALAS-1启动子的激活作用显著下降,而FoxA2作用不明显。在肝原代细胞中过表达PGC-1β促进了ALAS-1的转录。当用小RNA干扰NRF-1的表达后,则抑制了PGC-1β对ALAS-1转录的促进作用。结论 在Hep G2 和大鼠肝原代细胞中,PGC-1β能够促进ALAS-1基因的表达,并且这种作用是通过NRF-1介导完成的。     

C/EBPα参与小鼠胰岛β细胞囊泡谷氨酰胺转运子2基因表达的调控

目的:探讨转录调节因子CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)在小鼠胰岛β细胞株MIN6的囊泡谷氨酰胺转运子2(VGLUT2)基因表达过程中的调控作用。方法:克隆小鼠VLGUT2基因的启动子区,并对其中C/EBPα的结合位点进行了核酸定点突变,以荧光素酶活力方法观察突变后的启动子活性改变情况。通过电泳迁移率实验(EMSA)检测C/EBPα与含有小鼠VGLUT2启动子区核酸序列的核苷核探针的结合能力,以CEBPαsiRNA特异性抑制转录调控因子C/EBPα的基因表达,通过荧光素酶,RT-PCR和Western blotting方法观察抑制C/EBPα基因表达后小鼠VGLUT2的基因表达情况。结果:在对小鼠VGLUT2启动子区C/EBPα结合位点进行核酸定点突变后,小鼠VGLUT2启动子活性下降约50%,EMSA实验表明C/EBPα可与小鼠VGLUT2启动子区结合,当以C/EBPαsiRNA特异性地下调C/EBPα的表达时,小鼠VGLUT2的启动子活性、mRNA和蛋白水平也相应各自下降约60%、40%及45%。结论:C/EBPα参与了小鼠VGLUT2的基因表达调控。     

c-Jun对硫氧还蛋白还原酶1启动子转录的调控作用

目的: 探讨转录因子激活剂蛋白-1(activator protein-1,AP-1)家族成员c-Jun对硫氧还蛋白还原酶1(thioredoxin reductase 1, TrxR1 )启动子转录的调控作用。方法: 利用生物信息学技术分析调控 TrxR1 启动子区域的转录因子,构建 TrxR1 启动子区域一系列截短的萤光素酶报告基因载体,将含c-Jun的真核表达载体pcDNA3.1(+)-c-Jun和含有 TrxR1 启动子的萤光素酶报告基因载体共转染人胚肾HEK293细胞和鼠心肌H9c2细胞,检测转染细胞中萤光素酶活性。应用定点突变技术针对 TrxR1 启动子区域AP-1的可能结合位点进行突变,与c-Jun的真核表达载体共转染上述2种细胞,检测各组萤光素酶活性。利用染色质免疫共沉淀(ChIP),分析c-Jun与 TrxR1 启动子区域的AP-1结合位点结合情况。结果: 酶切及测序结果表明,获得的3个不同长度的 TrxR1 启动子克隆与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,且插入方向正确;此3种质粒都有明显的启动子活性,在人胚肾HEK293和鼠心肌H9c2细胞中转染pcDNA 3. 1(+)-c-Jun可以上调 TrxR1 启动子活性。突变AP-1结合位点,导致 TrxR1 启动子活性明显降低;ChIP结果显示c-Jun结合在 TrxR1 启动子区域的AP-1结合位点上。结论: 转录因子AP-1家族成员c-Jun可能通过与 TrxR1 基因启动子区域AP-1结合位点相结合,上调 TrxR1 基因的转录。     

HIF-1α基因启动子-1946位点基因多态性与紫绀型先天性心脏病低氧耐受的相关性

目的研究低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因多态性与紫绀型先天性心脏病(CCHD)低氧耐受能力是否具有相关性。方法用靶向捕获技术,对97例CCHD患儿和108例非紫绀型先天性心脏病(ACHD)患儿HIF-1α基因二代测序;生物信息学分析后找出差异分布的多态位点;用Sanger测序验证。针对HIF-1α启动子区多态位点,构建不同基因型HIF-1α启动子-荧光素酶报告基因载体;转染HEK293T和H9C2细胞;用双荧光素酶报告基因检测系统,分析HIF-1α不同基因型启动子活性。结果 CCHD组HIF-1α启动子区-1 946位点A碱基删除变异频率高于ACHD组(P0.05)。与AA基因型比较,DD基因型HIF-1α启动子转录活性更高(P0.05)。结论 HIF-1α基因-1 946位点与CCHD耐受低氧能力相关,DD基因型HIF-1α转录活性明显增高,可能是耐受低氧的分子遗传学机制之一。     

MEF2C调控DOK5基因的表达

目的 研究MEF2C对DOK5的表达调控机制。方法 用RT-PCR法检测小鼠中DOK5组织表达谱,检测P19CL6向心肌细胞分化过程中DOK5和MEF2C的表达。MEF2C与DOK5启动子报告基因共转染P19CL6细胞或将DOK5启动子上的MEF2结合位点突变后,观察报告基因活性的变化。结果DOK5在小鼠的脑、心脏、骨骼肌等高表达。DOK5和MEF2C在P19CL6向心肌细胞分化过程中mRNA表达水平升高 (p<0.05)。过表达MEF2C可以激活DOK5启动子区的报告基因活性,而MEF2结合位点突变则抑制DOK5启动子区报告基因活性。结论 MEF2C可以通过作用于DOK5启动子区的MEF2结合位点,调节DOK5的转录活性。     

SIRT6对小鼠米色脂肪细胞适应性产热功能的影响

目的:探索沉默信息调节因子6(SIRT6)对小鼠米色脂肪细胞适应性产热功能的影响及其机制。方法:利用Seahorse能量代谢分析仪和real-time PCR检测SIRT6对小鼠原代米色脂肪细胞线粒体呼吸的调控作用及产热基因表达的情况;在HEK293A细胞和小鼠原代米色脂肪细胞中利用免疫共沉淀(Co-IP)实验检测SIRT6和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)的相互作用;利用免疫沉淀(IP)实验检测SIRT6对PGC-1α乙酰化水平的影响,并通过双萤光素酶报告基因实验检测SIRT6对PGC-1α转录辅激活活性的调控作用。结果:过表达SIRT6可增加小鼠原代米色脂肪细胞的氧气消耗速率,上调产热基因的表达,Co-IP实验说明SIRT6与PGC-1α存在相互作用,IP实验表明SIRT6会去乙酰化PGC-1α,双萤光素酶报告基因实验证实SIRT6会协同增强PGC-1α的转录辅激活活性。结论:SIRT6通过去乙酰化PGC-1α增强小鼠原代米色脂肪细胞的适应性产热,从而促进能量消耗。     

三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中PRMT1通过C/EBPα调控c-myc表达

目的研究在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中精氨酸甲基转移酶PRMT1通过C/EBPα调控c-myc表达的机制。方法在MDA-MB-231细胞中分别过表达C/EBPα和敲低PRMT1,在蛋白和mRNA水平检测c-myc表达量;ChIP-qPCR和EMSA检测C/EBPα与c-myc启动子的结合能力;荧光素酶双报告基因检测PRMT1和C/EBPα对c-myc启动子的调控作用。结果过表达C/EBPα、敲低PRMT1后,c-myc表达明显下降;C/EBPα蛋白3个甲基化位点35位、156位和165位精氨酸突变为苯丙氨酸后(3RF),C/EBPα对c-myc启动子的转录抑制明显减弱。而3个位点同时突变成赖氨酸后(3RK),PRMT1对c-myc的调控作用消失。结论在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,PRMT1通过甲基化C/EBPα调控c-myc的转录。     

PGC1α协同PPARγ调节CIDEC基因在小鼠脂肪细胞系中表达

 目的 鉴定CIDEC的表达能够被PPARγ和PGC1α共激活, 检测其在脂肪代谢中的重要调控作用。方法 构建5’删切和顺式原件突变的启动子,运用HepG2细胞中双荧光报告基因实验检测PPARγ和PGC1α对CIDEC的共激活作用并确定顺式作用原件。运用PPARγ特异激动剂pioglitazone刺激3T3-L1细胞检测CIDEC的mRNA水平。在3T3-L1细胞系中,过表达CIDEC,检测脂肪合成及能量代谢相关基因的mRNA水平。通过腺病毒感染在小鼠肝原代细胞中过表达CIDEC,检测肝脏细胞中脂肪变化。结果 PPARγ和PGC1α能够显著激活CIDEC的启动子。过表达CIDEC后在脂肪细胞中脂类合成相关基因FAS上调3.47±0.17倍（p<0.05）,ACC上调3.95±0.57倍（p<0.05）,在肝原代细胞中CIDEC促进脂滴的生成。结论 CIDEC过表达能够被PPARγ促进并且被PGC1α共激活,在体内起到促进脂肪积累的作用。     

人β-防御素-2基因5′-端转录调控序列分析

目的 :对在LPS、TNF α刺激下 ,人 β 防御素 2基因 5′ 端转录调控机制进行初步分析。 方法 :将HBD 2基因 5′ 端上游序列连接入无启动子的pEGFP 1质粒 ,构建了系列 5′端缺失的 pEGFP 1 /HBD 2报告质粒。pEGFP 1 /HBD 2质粒转染细胞后给予LPS、TNF α刺激 ,用RT PCR检测 pEGFP的mRNA浓度。 结果 :显示HBD 2基因上游 2 41段有较强的启动子活性 ;LPS、TNF α刺激后 ,即使上游序列缩短至 2 41位点时 ,报告基因 pEGFP的mRNA表达量仍明显增高。说明HBD 2基因上游 2 41区域含有LPS、TNF α刺激后激活的转录因子作用位点。计算机分析表明 2 3 2 / 2 2 2区域有一同源性极高的NF kB结合元件 ,提示NF kB结合元件可能调控HBD 2的增强表达     

Ⅰ型胶原基因转录调控的研究进展

调控Ⅰ型胶原(COL1)基因转录的顺式作用元件位于启动子和第一个内含子中。顺式作用元件及其结合的转录因子有生物种类特异性。一些转录因子以不同的亲和力与其部分潜在结合位点结合,它们间的相互作用稳定了DNA的环状结构,并引发转录。转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子在转录水平参与COL1基因的调控,在COL1基因启动子上有它们的反应元件。     

NF-κB结合位点突变对人NOD2基因启动子调控的影响

探讨NF-κB结合位点突变对人NOD2基因启动子调控的影响。采用PCR技术从人基因组DNA中扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列,并定向克隆入已切除启动子的表达载体pEGFP-N3中,构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白(green fluorescent proteins,GFP)载体pEGFP-N3-NOD2wt,并构建NF-κB结合位点2个碱基缺失突变的载体,将构建的重组质粒瞬时转染HEK293细胞,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果显示重组质粒转染HEK293细胞后,在倒置荧光显微镜下均能看到绿色荧光,其中pEGFP-N3-NOD2wt重组质粒在HEK293细胞中荧光表达较强,而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱。说明NF-κB结合位点是驱动NOD2基因转录的重要元件,且在NOD2基因启动子的调控中发挥了正调节作用,为进一步研究NOD2基因表达及调控机制提供了新的思路。     

YAP通过增加HIF-1α转录活性进而促进小鼠下肢缺血后动脉生成

目的:探讨内皮细胞Yes相关蛋白(YAP)在小鼠下肢缺血后动脉生成过程中的作用与机制。方法:缺氧处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs),并使用Western blot检测YAP第127位丝氨酸的磷酸化水平,采用免疫荧光染色检测YAP的细胞亚定位情况;免疫共沉淀实验检测HUVECs中YAP与缺氧诱导因子1α(HIF-1α)结合的情况;萤光素酶报告基因实验检测YAP野生型(YAP-WT)质粒以及YAP丝氨酸位点突变(YAP-5SA)质粒对HIF-1α转录活性的调节;构建内皮细胞特异性YAP过表达(EC-YAPtg)小鼠,于结扎股动脉手术后1、8、15和22 d使用激光多普勒血流仪检测小鼠下肢血流恢复情况;免疫荧光染色检测小鼠腓肠肌CD31、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及巨噬细胞分化抗原3(Mac3)的表达情况。结果:缺氧可以时间依赖性地下调YAP第127位丝氨酸的磷酸化,同时促进YAP在细胞核定位;免疫共沉淀实验证实,YAP可以与HIF-1α在缺氧条件下相互结合;YAP-WT或者YAP-5SA均可以显著增加HIF-1α的转录活性;与对照(YAPflox)小鼠相比,EC-YAPtg小鼠下肢...     

α2-Heremans-Schmid糖蛋白基因多态性与其血清含量的关联研究

目的 探讨α2-Heremans-Schmid糖蛋白(α2-Heremans-Schmid glycoprotein,AHSG)基因单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)与其血清含量的相关性及其参与调节基因转录的机制.方法 对AHSG基因进行重测序,构建连锁不平衡模式,选择标签SNP在192名北京汉族和424名广州汉族个体中进行了基因分型;应用报告基因荧光素酶活性检测不同等位基因的转录活性;应用酶联免疫吸附试验检测北京地区192名个体血清中AHSG的浓度.结果 AHSG重测序共检出8个SNP,连锁不平衡分析显示广州和北京地区人群的连锁不平衡模式不同,但选择的标签SNP和具有潜在功能的SNP的等位基因和基因型频率分布在两组人群中差异无统计学意义.荧光素酶活性实验结果显示,AHSG基因启动子区-799A等位基因比-799T等位基因的转录活性高;多态性位点rs2248690、rs4917和rs4918与血清中AHSG的含量存在相关性;多元回归分析结果表明只有rs2248690与AHSG含量存在相关性.结论 位于AHSG基因启动子区的rs2248690位点与其血清中含量存在相关性.     

鼻咽癌STGC3基因转录调控元件分析与鉴定*

目的：分析并鉴定STGC3基因转录调控元件,探讨鼻咽癌STGC3基因的转录调控分子机制。方法：运用 生物信息学,预测并分析STGC3基因核心启动子区的转录因子结合位点;将相关转录因子结合位点,制备3 种探 针即生物素标记野生型、突变型及未标记野生型;提取CNE2细胞核蛋白,利用电泳迁移率变动分析（ EMSA） 及染色质免疫共沉淀（ ChIP）分析,体内外鉴定转录因子结合位点。结果：在STGC3基因核心启动子区存在21 个转录因子结合位点,其中9 个为Sp1 转录因子结合位点;进一步严格限定参数,STGC3基因核心启动子区域含 有转录因子结合位点5 个,其中Sp1 转录因子结合位点2 个;EMSA和ChIP 实验结果显示,STGC3基因中存在转 录因子Sp1 特异性结合位点,从而鉴定出STGC3基因转录调控元件。结论： STGC3基因核心启动子区含有Sp1 特异性结合位点,为该基因的转录调控元件。     

转录因子c-Jun调控成骨细胞Mepe基因表达的研究

目的:探讨转录因子c-Jun对Mepe基因的转录调控作用,并寻找c-Jun在Mepe启动子上的特异性结合位点。方法:利用免疫组织化学方法定位c-Jun与Mepe在小鼠骨组织的表达;采用real-time PCR的方法检测c-Jun的表达量改变对Mepe mRNA表达的影响;应用双萤光素酶报告基因检测系统及定点突变技术分析c-Jun对Mepe基因启动子转录活性的影响。结果:转录因子c-Jun在小鼠骨细胞胞核中呈阳性表达,而Mepe在小鼠骨细胞的胞浆中有表达;real-time PCR显示c-Jun过表达后,Mepe mRNA的表达显著增加(P0.05);双萤光素酶报告基因检测系统检测显示,在成骨细胞中转染p CMV-3Tag-1-c-Jun的实验组Mepe启动子的转录活性升高(P0.05);定点突变c-Jun的潜在结合位点后,Mepe启动子的转录活性显著下降(P0.05)。结论:转录因子c-Jun可通过Mepe启动子上潜在的c-Jun结合位点上调成骨细胞中该基因的转录。     

SREBP1c/cm对PERK启动子转录活性及表达的差异性调控

目的探讨转录因子固醇调节元件结合蛋白(SREBP1c)及其活性形式(SREBP1cm)对人蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)的调控作用。方法构建人PERK启动子截短体报告基因载体,与内参质粒pRL-SV40共转入人胚肾细胞HEK293检测荧光素酶活性;用pc DNA3.1(-)-SREBP1c、pc DNA3.1(-)-SREBP1cm与PERK启动子转录活性核心区域共转293T细胞,双荧光素酶报告基因分析SREBP1c及活性形式SREBP1cm对PERK启动子转录活性的调控;RT-PCR和免疫印迹法检测SREBP1c、SREBP1cm对PERK mRNA和蛋白表达的影响。结果成功构建PERK启动子截短体报告基因载体,确定了PERK启动子转录活性核心区域;双荧光素酶报告基因分析结果显示SREBP1c抑制PERK启动子的转录活性,而SREBP1cm促进PERK启动子的转录活性。SREBP1c抑制PERK mRNA和蛋白的表达(P0.05),SREBP1cm促进PERK mRNA和蛋白的表达(P0.05)。结论 SREBP1c和SREBP1cm对PERK启动子转录活性及其表达具有相反的调控作用。     

NOX1基因荧光素酶报告基因系统的建立

目的：对炎症细胞因子TNF-α及IFN-γ刺激下,人NOX1基因的表达调控进行初步分析。方法：将NOX1基因5′-端上游序列连接到无启动子的PGL3-BASIC质粒,构建了PGL3-BASIC／NOX1报告质粒。PGL3-BASIC／NOX1质粒转染A549细胞,用TNF-α、IFN-γ刺激12h,双荧光素酶报告基因系统检测基因表达情况。结果：克隆的NOX1片段具有较强的启动子活性,在TNF-α和IFN-γ共同刺激下,转染报告基因的A549细胞萤光素酶活性与对照相比有明显的增高（约4．3倍）。分析显示NOX1基因5′端上游序列片段含有NF-KB结合位点,提示细胞因子刺激的荧光素酶表达增强可能与NF-KB位点激活相关。结论：NOX1基因表达水平明显受到炎症细胞因子的调控,提示该基因可能参与机体免疫防御（特别是上皮细胞免疫防御）,值得进行深入研究。     

人β-防御素-2基因5''-端转录调控序列分析

目的：对在LPS、TNF-α刺激下，人β防御素-2基因5-端转录调控机制进行初步分析。方法：将HBD-2基因5-端上游序列连接入无启动子的pEGFP-1质粒，构建了系列5端缺失的pEGFP-1/HBD-2报告质粒。pEGFP-1/HBD-2质粒转梁细胞后给予LPS、TNF-α刺激，用RT-PCR检测pEGFP的mRNA浓度。结果：显示HBD-2基因上游-241段有较强的启动子活性；LPS、TNF-α刺激后，即使上游序列缩短至-241位点时，报告基因pEGFP的mRNA表达量仍明显增高。说明HBD-2基因上游-241区域含有LPS、TNF-α刺激后激活的转录因子作用位点。计算机分析表明-232/-222区域有一同源性极高的NF-kB结合元件，提示NF-kB结合元件可能调控HBD-2的增强表达。     

人FAM33A基因启动子的克隆与鉴定

目的 鉴定人FAM33A基因的启动子,为进一步研究其转录调控机制奠定基础.方法 采用5'RACE技术(5'端cDNA快速扩增)鉴定FAM33A的转录起始位点.采用PCR定向克隆、酶切亚克隆等策略,构建FAM33A启动子荧光素酶报告基因.采用LipofectamineTM 2000转染H1299细胞,并通过Dual-LuciferaseGA16A Reporter Assay System进行荧光素酶报告基因活性检测.结果 确定了FAM33A的转录起始位点,构建了覆盖FAM33A 5'端ATG附近约2 kb区域的一系列FAM33A启动子荧光素酶报告基因.启动子活性分析表明,这些重组体均具有较高的启动子活性,同时含有典型的GC盒以及Sp1、E2F和GATA-1等潜在的转录因子结合位点.结论 FAM33A启动子区域主要定位于转录起始位点附近约590 bp的区域内.