B群脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白抗原性分析

挑选了１０株具有代表性的菌株，提取了它们的外膜蛋白（ＯＭＰｓ），ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现：１０株菌的ＯＭＰｓ带谱不完全相同，但都含有１，２／３，４和５类外膜蛋白，而且纯化的１类外膜蛋白（ＯＭＰ１）显示一条分子量为（４１或４３）×１０＾３的蛋白带。从中选两株菌５４２８５２（Ｂ：ＮＴ：Ｐ１．２：Ｌ３，７，９：克隆Ｉ：ＲＦＬＰ－ｂ２０）和３４０７（Ｂ：１５：Ｐ１．２：Ｌ３，７，９，克隆群Ｉ：ＲＦＬＰ－ｂ     

宋内氏志贺氏菌（Ipa^＋,Oag^—）菌株的构建及表达

直接用转化方法将质粒ｐＨＳ４１０８转入宋内氏Ⅱ相菌Ｓ１Ｒ（Ｉｐａ＾－，Ｏａｇ＾－），构建了菌株Ｓ１Ｒ１０１／ｐＨＳ４１０８。该菌株能表达侵袭性外膜多肽ａ，ｂ，ｃ，ｄ，无Ｏ抗原。本实验又将质粒ｐＨＳ４１０８中的１２．５ｋｂ ＳａｌＩ片段克隆到质粒ｐＢＲ３２２上，构建质粒ｐＪＭ５６，并把它转入Ｓ１Ｒ株内所得的重组菌Ｓ１Ｒ１０２／ｐＪＭ５６能表达多肽ａ，ｃ，ｄ，但不表达多肽ｂ。     

迟缓爱德华菌外膜蛋白抗原性分析

目的 :分析迟缓爱德华菌 (Et)外膜蛋白 (OMP)的抗原性。方法 :用Western blotting分析 2 7株Et与EtATCC15 94 7OMP抗血清的转印情况 ,用ELISA、杀菌力试验和凝集反应检测OMP诱导的抗体滴度。结果 :2 1株致病株中有 2 0株能与EtATCC15 94 7株OMP抗血清转印出清晰的条带 ,分别为 33k、35k、38k、4 5k ,而非致病株和另一株致病株Et12 2的OMP则没有反应带 ;ELISA、杀菌力试验和凝集反应表明 ,ATCC15 94 7和JEL4株的OMP均能诱导高滴度的杀菌抗体和抗OMP抗体 ;不同程度稀释的抗ATCC15 94 7OMP血清及抗 35k、4 5k血清还能对小鼠提供一定的保护力。结论 :EtOMP33k、35k、38k、4 5k可能为保护性抗原 ,OMP可作为疫苗的候选成分。     

沙门菌属外膜蛋白的抗原同源性分析

目的 分析沙门菌属外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）的抗原同源性。方法 十二烷基肌氨酸钠法提取甲型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和粘质沙雷菌的OMP。用甲型副伤寒沙门菌的OMP与完全佐剂制成乳油状，多次多部位免疫日本大耳兔，获得抗OMP抗体血清。35％饱和硫酸铵沉淀并纯化IgG，用HRP标记。SDS-PAGE法分离检测上述8种细菌的OMP。Western blot测定兔抗甲型副伤寒沙门菌OMP抗体与上述其他细菌OMP抗原的反应特异性。斑点印迹．酶联免疫吸附试验（Dot blot-ELISA）测定兔抗甲型副伤寒沙门菌OMP抗体与肠炎沙门菌、费氏枸橼酸杆菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、蜂房哈夫尼亚菌、棒状杆菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、金黄色葡萄球菌、摩根摩根菌、屎链球菌、肺炎链球菌、新型隐球菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和白色念珠菌提取物的反应性。结果 沙门菌属成员的OMP可与兔抗甲型副伤寒沙门菌OMP抗体血清发生特异性反应；其他革兰阴性菌OMP与之无反应；革兰阳性菌和真菌亦不发生反应。结论 沙门菌属OMP具有高度的抗原同源性，有别于其他细菌。     

空肠弯曲菌67KD外膜蛋白诱导抗核抗体生成

在分离提取空肠弯曲菌 S—131主要膜抗原成份67KD 鞭毛蛋白的基础上,用此蛋白成份经腹腔免疫8周龄雌性 KM 小鼠,每周一次,共12周,ELISA 方法动态测定小鼠血清中自身抗核抗体(包括抗 ds-DNA,ss-DNA 和组蛋白抗体)的水平。发现输注剂量为120—200μg/次/小鼠时能成功诱导上述各类自身抗体的产生,其中抗组蛋白抗体的阳性反应性最大,出现时间较早.本研究为从分子水平研究慢性感染诱致自身免疫的机理提供了新的实验依据,为抗组蛋白抗体作临床早期诊断的潜在作用提供了佐证.     

淋球菌外膜蛋白疫苗的研究进展

在自然界 ,淋球菌的唯一宿主是人类 ,淋球菌在漫长的进化过程中已经形成了一套逃避人体免疫系统的机制 ,加上缺少很好的动物实验模型 ,给制备淋球菌疫苗进行淋病预防造成相当大的障碍。但近年来 ,从Por,Pil,Opa和LOS等淋球菌外膜蛋白抗原的一系列研究中 ,人们认识到理想的淋球菌疫苗抗原应该具有的一些特性 ,有力地推动了淋球菌疫苗的研究。     

迟缓爱德华菌全菌及外膜蛋白的免疫力比较

目的：比较观察Et ATCC15947株的全菌（WCB）及外膜蛋白（OMP）对小鼠和鲫鱼免疫效果。方法：用全菌凝集试验及ELISA测定抗体滴度，以迟发性变态反应（DTH）观察细胞免疫情况。结果：免疫小鼠抗体滴度14d时，以全菌组最高，而在28d时以OMP＋LPS组最高，保护率分别是：OMP＋沙门氏菌LPS＞全菌组＞OMP＞OMP＋FCA。免疫鲫鱼第1周OMP＋LPS注射组即能测到抗体，而全菌组则需2－3周，但强化免疫后均能升高至相似的滴度,浸泡组则只在刚免疫的2－3周可测到低滴度的凝集抗体,保护率；OMP＋LPS注射组＞全菌注射组＞全菌浸泡组。结论：给小鼠和鲫鱼注射全菌和OMP均能提供良好的免疫保护，在有佐剂LPS存在下，OMP效果更好。     

牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的基因克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:克隆牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB基因、原核表达并制备牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB多克隆抗体。方法:根据牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的DNA序列,设计特异性引物并经PCR扩增其基因。扩增产物经鉴定和测序分析后,与质粒pET-32a(+)重组形成pET-32a-ragB,继而转化大肠埃希菌。IPTG诱导重组蛋白的表达,再通过Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定;获得的重组蛋白行常规家兔免疫,以制备多克隆抗体,并应用ELISA测定抗体效价。结果:PCR扩增获得编码区全长为1506bp可编码501个氨基酸的RagB基因,测序结果与GenBank公布的序列(AJ130872)完全一致;构建了pET-32a-ragB原核表达载体,获得了高表达的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blot表明具有较高的纯度;ELISA结果显示,特异性兔抗RagB的多克隆抗体效价为1×105。结论:在成功构建牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB原核表达载体的基础上,高效表达及纯化了RagB融合蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体。为进一步开展牙龈卟啉菌疫苗研究、建立牙龈卟啉菌感染的实验室诊断方法奠定了基础。     

空肠弯曲菌67KD 外膜蛋白的提取及其对淋巴细胞的多克隆激活作用

本室曾建立空肠弯曲菌诱导自身免疫综合征小鼠模型.本文用盐析法及离子交换层析法从空肠弯曲菌(CJ-S131)中提取了67KD 的外膜蛋白.免疫印迹法证实该蛋白为空肠弯曲菌的主要抗原成份之一,具有较强的免疫原性;体外对小鼠脾淋巴细胞具有明显的多克隆激活作用.本实验为从分子水平研究感染与自身免疫的关系提供了重要的物质基础和新的实验依据.     

不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的重组表达及免疫保护作用研究

目的 研究不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)重组外膜蛋白P6的理化性质和对小鼠的免疫保护作用.方法 利用PCR技术,以NTHi基因组为模板,扩增出编码外膜蛋白P6的基因片段;构建pET-32a-P16重组质粒;转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并对表达条件进行了优化.通过阴离子交换和凝胶过滤层析对蛋白进行纯化.经SDS-PAGE、Western blot等对蛋白的理化性质进行初步分析,继而免疫BALB/c小鼠,用同源菌经腹腔攻击,比较免疫组和对照组小鼠死亡率.结果 实现了该蛋白在大肠杆菌中的高效表达,产物表达形式为可溶性表达,纯化后蛋白纯度可达95%,收率可达5 mg/g(蛋白/湿菌),相对分子质量(M_r)为14 145.848,Western blot证实重组P6蛋白能与菌源提纯P6蛋白免疫小鼠后的抗血清发生特异性反应.动物实验结果表明重组P6蛋白在小鼠体内能诱生高滴度的抗体,显示免疫组小鼠存活率明显高于对照组(P<0.01).结论 重组NTHi外膜蛋白P6的原核表达产物为可溶性蛋白,在小鼠体内能诱生高效价抗体,在小鼠感染模型中具有保护作用,为NTHi疫苗的研发提供了基础资料.     

空肠弯曲菌外膜蛋白亚单位疫苗的研制及免疫原性研究

目的 探索用脂质体包裹空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,CJ)Mr 28 000～31 000外膜蛋白制备安全、稳定、有效的CJ亚单位脂质体佐剂疫苗及其免疫原性、免疫剂量和途径.方法 采用薄膜-超声-冻融法制备阴离子脂质体(AL)、阳离子脂质体(CL)CJ疫苗后对其进行质量鉴定;用ELISA(间接法)检测经CJ疫苗免疫后的新西兰兔血清IgG抗体水平.结果 ①疫苗无菌试验及热原质试验均合格,均无明显不良反应;②阴、阳离子脂质体疫苗冻融前包裹率分别为32.1%、22.5%,冻融后分别是38.3%、28.4%;③CJ阴离子组比CJ阳离子组血清IgG的OD值显著增高(P<0.01),与CJ弗氏组无统计学差别(P0.1);CJ阴、阳离子组0.50 mg/kg的免疫剂量血清IgG的OD值最大;CJ阳离子皮下注射组与肌肉注射组IgG的OD值无统计学差别(P0.1);特异性IgG抗体经6个月动态观察,5个月后抗体效价下降.结论 ①采用薄膜-超声-冻融法制备CJ亚单位佐剂疫苗安全、稳定,冻融法可以提高脂质体疫苗包裹率;②同一剂量的阴离子脂质体疫苗血清抗体水平明显高于阳离子脂质体疫苗;③脂质体疫苗最佳接种剂量为0.50 mg/kg,肌肉注射与皮下注射免疫效果无显著差异;④较高水平的特异性抗体维持5个月,6个月后应加强免疫.     

铜绿假单胞菌外膜蛋白的免疫原性及免疫保护性

铜绿假单胞菌亦称绿脓杆菌,是一种最常见的条件致病菌。铜绿假单胞菌感染占院内感染的15 %以上,并还有上升趋势,这与铜绿假单胞菌对抗生素耐药率增高有关〔1〕。在国内外烧伤中心对革兰阴性细菌感染的临床调查表明,铜绿假单胞菌感染占首位(约5 0 %) 〔2〕。为此,人们一直在寻找有效的防治对策。既往研究的菌体疫苗缺点较多,如不同血清型保护率及保护时间不甚理想等。因此,发展高免疫保护性、低不良反应的亚单位疫苗非常必要。制备亚单位疫苗的关键在于找出与保护性免疫相关的抗原。细胞膜中的一种重要成分———外膜蛋白,在免疫方面的作用越…     

宋内氏志贺氏菌（Ipa~＋，Oag~－）菌株的构建及表达

直接用转化方法将质粒ｐＨＳ４１０８转入宋内氏Ⅱ相菌Ｓ１Ｒ（ｌｐａ－，Ｏａｇ－），构建了菌株Ｓ１Ｒ１０１／ｐＨＳ４１０８。该菌株能表达侵袭性外膜多肽ａ，ｂ，ｃ，ｄ，无Ｏ抗原。本实验又将质粒ｐＨＳ４１０８中的１２．５ｋｂＳａｌⅠ片段克隆到质粒ｐＢＲ３２２上，构建质粒ｐＪＭ５６，并把它转入Ｓ１Ｒ株内所得的重组菌Ｓ１Ｒ１０２／ｐＪＭ５６能表达多肽ａ，ｃ，ｄ，但不表达多肽ｂ。     

HIV外膜蛋白的结构与功能研究进展

人免疫缺陷病毒 (ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ ,ＨＩＶ)ｅｎｖ基因编码的前体分子 ｇｐ16 0 (ＨＩＶ 1)或ｇｐ140 (ＨＩＶ 2 )经蛋白酶剪切加工后 ,成为成熟的外膜蛋白ｇｐ12 0 (ＨＩＶ 1) ｇｐ10 5 (ＨＩＶ 2 )和跨膜蛋白 ｇｐ41(ＨＩＶ 1) ｇｐ36 (ＨＩＶ 2 )。在病毒表面 ,外膜蛋白和跨膜蛋白以非共价键结合成Ｅｎｖ异二聚体 ,3个异二聚体组成包膜超分子结构 ,形成病毒表面的突起[1 ] 。ＨＩＶ外膜蛋白是激发体液免疫和细胞免疫应答的最重要蛋白抗原。自从 1984年Ｋｌａｔｚｍａｎｎ等发现ＨＩＶ与ＣＤ4+细…     

空肠弯曲菌外膜蛋白亚单位脂质体佐剂疫苗的免疫原性研究

目的 初步探讨自制的空肠弯曲菌（campylobacter jejuni）亚单位（M,28 000-31 000外膜蛋白）脂质体佐剂疫苗的免疫原性,为该疫苗的临床前研究打下基础。方法 用双向免疫琼脂扩散试验、试管凝集试验、ELISA（间接法）分别检测经GJ疫苗免疫后的新西兰兔血清IgG抗体效价。结果 GJ阴离子组与GJ阳离子组比较,血清IgG A值显著增高（P〈0．01）,与GJ弗氏组无统计学差别（P〉0．1）;CJ阴、阳离子组脂质体疫苗接种剂量在0．50mg／kg时,血清IgGA值最大;CJ阳离子皮下注射组与肌肉注射组IgGA值无统计学差别（P〉0．1）;特异性IgG抗体经6个月动态观察,5个月后抗体效价下降。结论 实验组全程免疫后均有特异性抗体产生;同一剂量的阴离子脂质体疫苗比阳离子脂质体疫苗血清抗体水平显著增高;脂质体疫苗最佳接种剂量为0．50mg／kg,肌肉注射与皮下注射免疫效果无显著差异;特异性抗体高水平维持5、6个月后应加强免疫。     

黑龙江立克次体外膜蛋白B基因表达及表达重组蛋白的抗原性分析

黑龙江立克次体为远东蜱传斑点热病原体,本文以黑龙江立克次体基因组为模板,扩增ompB的4段基因,利用原核表达载体构建重组表达质粒,IPTG诱导重组质粒转化的大肠杆菌表达重组目的蛋白,并对其抗原性进行分析.免疫印迹反应表明,重组表达的4个蛋白均与黑龙江立克次体感染小鼠血清反应.该4个重组蛋白分别免疫小鼠后,分析其血清的特...     

中国莱姆病螺旋体PD91外膜蛋白A肽段的克隆表达及其免疫保护性的初步研究

目的:克隆并表达中国莱姆病螺旋体基因型代表菌株伽氏疏螺旋体( Borrelia garinii, B. garinii)PD91外膜蛋白A(OspA)的126~274 aa肽段,并对其免疫保护性进行初步研究。 方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增 B. garinii PD91的126~274 aa OspA肽段基因,克隆至原核表达载体pET-30a上,构建pET-30a-OspA-pep重组质粒,转入大肠埃希菌感受态细胞BL21(DE3)中,利用IPTG诱导表达,表达产物用Ni-IDA树脂层析纯化,采用Western blot分析其免疫原性。将不同剂量的重组OspA-pep(rOspA-pep)蛋白(20、30、40、50、60、80、100 μg)免疫新西兰家兔,采用间接免疫荧光法(IFA)检测免疫前后的抗体滴度,选取产生抗体滴度最高的剂量组为最佳剂量组。用最佳剂量组的免疫兔血清进行体外中和试验以检测rOspA-pep蛋白免疫后血清抗体的体外杀菌能力,同时用最佳剂量的rOspA-pep蛋白免疫新西兰家兔,观察其抗体滴度变化。 结果:重组质粒pET-30a-OspA-pep构建成功并在宿主菌体内高效表达。Western blot表明rOspA-pep蛋白与 B. garinii PD91的多抗有明显的免疫应答。IFA检测结果表明rOspA-pep蛋白免疫后的兔血清IgG抗体滴度明显升高(最高可达1∶2 480),40 μg为rOspA-pep的最佳免疫剂量。体外中和试验结果表明该剂量rOspA-pep蛋白免疫家兔后产生的抗体对10 6个/ml的 B. garinii和阿弗西尼疏螺旋体( Borrelia afzelii, B. afzelii)型代表菌株PD91和FP1的中和率达100%,对10 7个/ml的FP1的中和率为100%,对10 7个/ml的PD91的中和率为60%。用40 μg rOspA-pep在1 d和30 d免疫新西兰家兔2次后,其抗体达到高峰,持续时间为3~4个月,之后抗体滴度逐渐下降。 结论:中国莱姆病螺旋体基因型代表菌株 B. garinii PD91的126~274 aa OspA肽段具有较好的免疫原性,其诱导的抗体有较好的体外中和能力,可作为中国二代亚单位疫苗的候选成分。