-80℃低温冻存保护剂对不同来源的造血干细胞体外冻存效果分析

目的分析-80℃体外冻存保护体系对不同来源的造血干细胞的冻存效果。方法以国产或进口药用二甲基亚砜(DMSO)、羟乙基淀粉(HES)、人血白蛋白(HSA)配制细胞冷冻保护剂,分别对人外周血、纯化的CD34+、骨髓及脐血造血干细胞进行-80℃低温保存,冻融前、后计数MNC、CD34+细胞、CFU-GM数量、回收率及台盼蓝拒染率,了解其生理活性。结果 4种来源的造血干细胞各30例,以120g/L HES加10%(V/V)DMSO和64g/L HSA为保护剂-80℃冻存360d,观察组与对照组在冻融前、后MNC、CD34+细胞、CFU-GM数量、回收率及台盼蓝拒染率无统计学意义(P>0.05)。应用国产试剂对118例外周血干细胞、39例纯化CD34+造血干细胞、3例脐血干细胞进行-80℃低温冻存1～9个月,进行冻存的造血干细胞移植,移植后7～19d内均成功恢复造血重建。结论以120g/L HES加10%(V/V)DMSO和64g/L HSA为细胞冷冻保护剂,能够良好保持干细胞数量及生理活性,且国产试剂与进口试剂无显著差别,具有价格低廉,容易购买,低毒安全,操作简便等特点,可临床应用于造血干细胞-80℃低温短期保存。     

人脐血CD34+造血干细胞的分离和体外扩增培养问题

目的通过细胞形态学观察以及计数法对分离得到的脐血CD34+造血干细胞进行研究,掌握脐血CD34+造血干细胞的生长规律和体外培养方法。方法采用Isolex50免疫磁珠法分离纯化脐血CD34+造血干细胞。在体外扩增培养中,将细胞因子SCF、IL-3、IL-6、G-CSF、EPO组合成不同实验组进行诱导,以检测单个核细胞数和集落形成单位(CFU)的形成率来找到细胞培养较好的细胞因子组合。结果本研究中使用细胞因子的细胞培养孔的单个核细胞数明显大于无细胞因子的细胞培养孔,使用此5种细胞因子联合对脐带造血干细胞培养效果最好。结论研究结果表明,不同的细胞生长因子组合会对培养CD34+造血干细胞产生不同的作用效果,对单个核细胞的增殖与扩增有明显的促进作用。     

脐血造血干细胞分离方法的实验研究

目的 优化脐血造血干细胞/祖细胞的分离方法.方法 脐血按体积比1:5与含有树脂海绵筛(筛孔直径约12μm)的6%羟乙基淀粉混合,静置60min,提取界面有核细胞.倒置显微镜下计数有核细胞数,集落培养记数CFU-GM数,流式细胞仪检测CD34 细胞数,并与按照标准的羟乙基淀粉沉淀法和淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离的脐血相对照.结果 采用本实验方法分离脐血获得的有核细胞数、CFU-GM数和CD34 细胞数分别为(96.82±25.78)×105/ml,(66.70 ±12.47)×105,(1.33±0.57)×105/ml,明显高于由羟乙基淀粉沉淀法(70.72±20.93)×105/ml,(28.79±10.25)×105,(1.01±0.36)×105/ml和淋巴细胞分离液密度梯度离心法(25.33±7.27)X 105/ml,(20.13±7.55)×105,(0.34±0.01)×105/m1分离的脐血(P＜0.05).结论 本实验方法可由脐血中分离出大量的造血干/祖细胞,是一种分离脐血造血干/祖细胞的理想方法.     

利用诱导性多能干细胞技术体外扩增造血干/祖细胞的初步研究

目的 利用诱导性多能干细胞技术体外扩增造血干/祖细胞.方法 利用非整合型载体,将四个转录因子:Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc导入脐血来源的造血干/祖细胞(CD34+细胞)重编程获得诱导性多能干细胞(iPSCs),再利用与小鼠骨髓基质细胞OP9共培养法将其定向分化成CD34+造血干/祖细胞.借助iPSCs可以在体外无限传代、大量扩增的特点,实现体外保存及大量扩增造血干/祖细胞的目的.结果 脐血CD34+细胞可以在体外重编程为非整合型iPSCs,并能够高效定向分化成为CD34+细胞,其分化效率比胚胎干细胞(ESCs)有显著提高.结论 利用诱导性多能干细胞技术体外大量扩增脐血造血干/祖细胞是一个可行的方案,具有良好的应用前景.     

rhBMP-2m对辐射小鼠骨髓CD34~+细胞变化的影响

目的　探讨小鼠受到辐射后 ,重组人骨形成蛋白成熟肽 2 (rhBMP 2m)对骨髓CD34+ 细胞变化的影响。方法　通过60 Coγ射线照射 ,建立小鼠骨髓造血损伤模型 ,经rhBMP 2m连续治疗后 ,骨髓单个核细胞计数 ,通过流式细胞仪检测骨髓单个核细胞中CD34+ 细胞比例 ,比较对照组和治疗组之间的差别。结果　经rhBMP 2m治疗的动物 ,单个核细胞数和CD34+ 细胞比例均明显高于照射对照组 ,P <0 0 5 ,n=6。结论　对于辐射引起的小鼠骨髓造血损伤 ,rhBMP 2m能够增加造血细胞数量 ,提高骨髓单个核细胞中CD34+ 细胞的比例 ,加快骨髓造血系统的重建。     

人骨髓间充质干细胞联合细胞因子的无血清培养体系体外扩增脐血干细胞研究

目的 探讨以人骨髓间充质干细胞(BM-MSC)为基质的无血清培养方法，体外扩增脐血造血干细胞(CBSC)，研究BM-MSC支持造血的功能和体外扩增时间的选择。方法 用含血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、flt3／flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)的无血清培养液，以人BM-MSC为基质，比较体外扩增脐血CD34^ 细胞7d及14d后总细胞(TC)、CD34^ 细胞和集落形成单位(CFU)数增加倍数。结果在以人BM-MSC为基质及TPO、FL、SCF和G-CSF这四种细胞因子作用下，经体外扩增7d后TC、CD34^ 细胞、CFU-GM和CFU-C数较起始分别增加了87、16、15和26倍；14d后较起始分别增加了427、38、125和104倍，与7d扩增倍数有显著性差异。结论以人BM-MSC为基质的无血清体外培养体系可以有效扩增CBSC，有潜在的临床应用价值，扩增时间应以14d为宜。     

骨髓间充质干细胞对造血干细胞"干性"的保持作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)对造血干细胞(HSCs)"干性"的保持作用及其机制.方法 免疫磁珠分离纯化脐血HSCs-CD34+细胞,并分组培养:A组,CD34+细胞单独培养;B组,加细胞因子;C组,加细胞因子和MSCs(直接接触);D组,加细胞因子和MSCs(不接触);E组,加MSCs(直接接触);F组,加Mscs(不接触).0、7、14 d分别计扩增倍数、单位细胞数形成集落能力、CD34+比率,计数7 d时各组CD34+、CD34+CD38-比率.结果 随着时间延长扩增倍数增加(尤其B组),形成集落的能力和CD34+细胞比率渐下降,但E、F组下降不明显.结论 以MSCs为滋养层,对HSCs扩增作用不明显,但可更好地保持HSCs的"干性";这种保持"干性"的作用依赖于细胞与细胞间的相互黏附作用.     

细胞因子联合治疗对急性放射病比格狗造血干/祖细胞的影响

目的 探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)和重组人白细胞介素11(rhIL-11)联合治疗对重度骨髓型急性放射病(ARS)比格狗干/祖细胞数量和质量的影响.方法 用4.5Gy60Coγ射线照射比格狗建立重度骨髓型ARS模型,随机分为三组:A组5犬,不予任何治疗;B组5犬,予输血、抗感染等对症治疗;C组6犬,在B组基础上加用rhG-CSF和rhIL-11 3周.观察外周血CD34+细胞数和骨髓中CD34+细胞的比例、骨髓涂片骨髓增生程度、骨髓和外周血造血祖细胞集落数及端粒酶活性.结果 与A、B组比较,C组外周血CD34+细胞数照射后早期增高(P<0.05),骨髓CD34+细胞比例各个时间点差异无统计学意义(P>0.05);照射后45d,C组骨髓增生程度、外周血红细胞集落形成单位(CFU-E)、骨髓混合细胞集落形成单位(CFU-Mix)和骨髓端粒酶活性均明显高于B组(P<0.05).结论 联合使用细胞因子可保护部分造血干/祖细胞的增殖能力,保持端粒酶较高的活性,促进CD34+的早期释放,有利于骨髓造血功能较快恢复.     

化疗联合G-CSF动员恶性血液病患者外周血造血干细胞

目的　探讨恶性血液病患者使用化疗联合造血生长因子进行自体外周血造血干细胞动员的效果及影响因素。方法　 19例恶性血液病患者采用化疗联合重组人粒细胞集落刺激因子(rhG CSF)进行外周血造血干细胞动员和采集 ,检测采集物中有核细胞及CD34+ 细胞数量。结果　 19例共采集 5 6次 ,化疗结束至采集开始平均 11 5 (6～ 19)天。获有核细胞数平均 4 0 0 (1 6 4～ 6 4 6 )×10 8/kg ;CD34+ 细胞数平均 6 78(0 0 5～ 2 3 33)× 10 6/kg。CD34+ 细胞≥ 2 5× 10 6/kg的比率为 78 9%(15 /19,95 %可信区间为 5 4 %～ 96 % ) ;CD34+ 细胞≥ 5 0× 10 6/kg的比率为 5 2 6 % (10 /19,95 %可信区间为 2 9%～ 76 % )。仅 3例 (15 79% ,95 %可信区间为 3%～ 4 0 % )CD34+ 细胞 <2 0× 10 6/kg。CD34+细胞产率与病程、动员前化疗次数、Drake化疗积分、动员前外周血白细胞计数相关 ,而与年龄、疾病状态等因素无明显相关性。动员效果也与化疗后外周血白细胞计数恢复时间相关。结论　化疗联合rhG CSF方案应用在大多数血液系恶性肿瘤患者中可获得足够的干祖细胞。对于动员病程长、化疗次数多、Drake化疗积分高、白细胞减少的患者动员效果不良。     

骨髓干细胞动员对心肌病心衰大鼠的心功能影响

目的:探讨骨髓干细胞动员对心肌病心衰大鼠的心功能影响。方法:选取20只心肌病心衰模型,随机分成两组,骨髓干细胞动员组(G组)为皮下注入重组人粒细胞刺激因子,心衰组皮下注入生理盐水。治疗前后采静脉血测外周血白细胞计数和单个核细胞数,将治疗5d后外周血分离出单个核细胞用流式细胞仪测CD34。四周后由彩色超声心动图评价心功能参数。结果:骨髓动员组外周血白细胞计数和单个核细胞数明显增高,流试细胞仪检查CD34阳性。在治疗4周后G组在超声心动图与心衰组有差异明显。结论:骨髓干细胞动员动员出造血干细胞,G组对心肌病心衰大鼠的心功能有明显改善。     

Autografting with peripheral blood CD34-positive cells following high-dose chemotherapy against breast cancer

We report autologous CD34+ cell transplantation performed in 3 cases of recurrent breast cancer. The hematological recovery in these cases was assessed by comparing with that in the previous cases of autologous hematopoietic stem cell transplantation performed with the same high-dose chemotherapy regimen. Patient 1 was a 32-year-old woman with pulmonary and skeletal metastases; patient 2, a 55-year-old woman with pulmonary metastases; and patient 3, a 48-year-old woman with hepatic metastases. On day 1, cyclophosphamide 1000 mg/m2 and epirubicin 130 mg/m2 were administered concurrently with granulocyte colony-stimulating factor, and peripheral blood stem cells were harvested on days 14-16. These stem cells were processed using anti-CD34 monoclonal antibody and an immunomagnetic bead device, Isolex 300i. The high-dose chemotherapy regimen consisted of cyclophosphamide 2000 mg/m2/day, div, and thiotepa 200 mg/m2/day, div on day -5, -4, and -3. The harvested CD34+ cells numbered 3.9 +/- 2.8 x 10(6)/kg (range: 0.73-7.8/10(6)/kg), and the CFU-GM, 8.3 +/- 5.6 x 10(5)/kg (range: 1.2-15.1/10(5)/kg). After the separation, the percent of CD34+ cells was 81.9 +/- 11.6% (range: 65.8-96.4%), the CD34+ cell yield, 71.8 +/- 30.2% (range: 46.0-129.6%), and the CFU-GM yield, 48.9 +/- 9.1% (range: 35.3-62.0%). At the time of transplantation, the number of nucleated cells was 0.55 +/- 0.31 x 10(5)/kg, and that of CFU-GM, 31.2 +/- 17.8 x 10(5)/kg. Comparison of the hematological recovery in these three cases with that in patients receiving an identical high-dose chemotherapy regimen revealed recovery rates significantly faster than in patients having bone marrow transplants, and approximately identical with that in peripheral blood stem cell transplantation cases.     

六种重组细胞因子对人骨髓造血细胞的体外扩增效应

目的 :观察造血生长因子对骨髓CD34 +细胞的扩增效应及扩增细胞的分化特性。方法 :采用重组人白细胞介素 (rhIL) 1 +rhIL 3+rhIL6 +重组人粒细胞集落刺激因子 +重组人粒 巨噬细胞集落刺激因子和重组人干细胞因子对人骨髓单个核细胞 (MNC)进行刺激 ,动态观察了经上述细胞因子作用后MNC的增殖效应及液态扩增培养后粒 巨噬集落形成率 (CFU GM ) ,利用流式细胞技术 (FACS)分析了扩增前后CD34 +细胞及其亚群的动态变化。结果 :经上述 6种细胞因子作用 2 4d ,骨髓MNC总数是原代MNC的 38.33倍 ,液态扩增 1 0d后 ,CFU GM的数量达高峰 ,是原代MNC的 1 9.0 4倍 ,2 4d时CFU GM总数降至 3.94倍 ,且集落明显小于扩增初期。扩增至 6～ 1 0d ,CD34 +细胞总数是原代MNC的 1 36 .40～ 90 .40倍 ,1 9d时降为 6 1 .40倍。结论 :外源性造血生长因子对CD34 +骨髓细胞具有较强的扩增效应 ,选择适宜的扩增时间是保证骨髓移植后尽快重建造血功能的重要环节。     

百里醌对辐射暴露小鼠造血系统的保护作用

目的　探讨百里醌对小鼠造血系统辐射损伤的影响。方法　ICR小鼠,按平均体质量一致原则分为对照组、照射组和百里醌组,每组5只。其中,对照组小鼠不接受照射,其他2组小鼠接受2.0 Gy照射。照射前1 d,对百里醌组小鼠予以灌胃百里醌（10 mg/kg）, 照射后持续3 d,其余2组小鼠灌胃生理盐水。照射7 d后处死小鼠,取外周血和单侧股骨骨髓细胞进行计数,检测骨髓细胞克隆形成能力与活性氧水平。结果　与对照组相比,照射组小鼠外周血白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血细胞比容（HCT）、血小板（PLT）、单侧股骨骨髓细胞数（BMMNC）、骨髓细胞集落形成数量均显著下降,骨髓细胞活性氧水平显著升高（P＜0.05）,百里醌组外周血WBC、RBC、HGB、HCT和PLT计数也出现显著下降（P＜0.05）。与照射组相比,百里醌组小鼠外周血WBC、BMMNC及骨髓细胞集落形成数量显著提高（P＜0.05）,骨髓细胞活性氧水平降低（P＜0.05）。结论　百里醌对造血系统辐射损伤具有保护作用,可通过抑制活性氧提高骨髓细胞增殖功能。     

21例重型再生障碍性贫血患者CD34^＋细胞检测及临床意义

目的：检测重型再生障碍性贫血（SAA）患者CD34^＋细胞骨髓单个核细胞比例,了解再生障碍性贫血发病与造血干细胞、祖细胞的关系。方法：应用流式细胞仪检测21例重型再生障碍性贫血患者CD34^＋细胞表达水平。并与对照组比较。结果：再生障碍性贫血组21例患者CD34^＋细胞比例为（0．196±0．164）％,对照组10例患者CD34^＋细胞比例为（1．129±0．570）％,两组比较,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：再生障碍性贫血患者CD34^＋细胞表达明显减少,支持再生障碍性贫血造血干细胞内在缺陷的发病学说。此检测有助于再生障碍性贫血诊断,值得临床推广。     

Effects of antioxidants and a caspase inhibitor on chloramphenicol-induced toxicity of human bone marrow and HL-60 cells

Chloramphenicol (CAP), a board spectrum antibiotic widely used in many developing countries, has toxic side effects on bone marrow, the most serious of which is aplastic anemia. Recent studies suggest that effects of CAP on suppressing hematopoietic colony formation may be abrogated by antioxidants. In addition, there is preliminary evidence that CAP induces apoptosis in hemopoietic stem cells, leading to aplastic anemia. We have been unable to demonstrate the protective effects of a variety of antioxidants on CAP-induced suppression of burst-forming unit erythroid (BFU-E) and colony-forming unit granulocyte/monocyte (CFU-GM). Using flow cytometry, we have, however, confirmed that CAP can induce apoptosis in purified human bone marrow CD34+ cells. We also showed that a caspase inhibitor, Z-VAD.fmk, can ameliorate the apoptotic-inducing effects of CAP in the HL-60 cell line.     

转HOXB4基因人骨髓MSC促进脐血CD34~+细胞体外扩增

目的 研究转HOXB4基因的人骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血CD34~+细胞体外扩增的支持作用.方法 用病毒载体质粒转染包装细胞293T,收获病毒上清(VCM)感染MSC后,用潮霉素筛选获得转HOXB4的MSC(MSC-HOX).分别将MSC(对照组)与MSC-HOX细胞(实验组)作为CD34~+细胞体外扩增的饲养层细胞,结合细胞因子Fh3/Flk3配体(FL)、促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)和粒细胞-集落生长因子(G-CSF)体外扩增脐血CD34~+细胞10 d,收集所有脐血细胞,检测细胞总数、CD34~+细胞总数,集落细胞形成单位(CFU)数.结果 生产重组逆转录病毒可有效将HOXB4基因转入靶细胞内并表达.脐血CD34~+细胞经体外扩增10 d后,细胞总数和CFU数两组间差异无统计学意义(P>0.05),脐血CD34~+细胞总数和比例高于对照组(P<0.05).结论 转HOXB4基因的人骨髓MSC在脐血CD34~+细胞体外扩增中,可保持CD34~+细胞未分化状态,有潜在的应用价值.     

枸杞多糖对小鼠骨髓造血干细胞、粒单系祖细胞增殖分化的影响

枸杞多糖(LBP)10mg·kg~(-1)·d~(-1)ip,连续3d,可促进正常小鼠骨髓造血干细胞(CFU-S)增殖,明显增加骨髓粒单系祖细胞(CFU-GM)数量,促进CFU-GM向粒系分化。     

莪术提取物ERC61对化疗小鼠造血功能的影响

目的:观察莪术提取物ERC61对环磷酰胺(CTX)抑制小鼠造血功能的影响并确定其最佳给药方式。方法:实验小鼠ipCTX(100mg.kg-1.d-1),连续给药3d,复制白细胞减少症模型;将ERC61按照单纯预防、单纯治疗和预防+治疗3种给药方式ip给药,常规方法计数小鼠白细胞数、骨髓有核细胞数,并测定脾指数。结果:ERC61对CTX抑制小鼠的白细胞数、骨髓有核细胞数、脾指数均有不同程度的改善。结论:ERC61可改善CTX抑制小鼠的造血功能,其中预防+治疗的给药方式效果最好。     

青蒿琥酯对小鼠骨髓造血干/祖细胞分化的抑制与毒性作用

目的:观察青蒿琥酯(artesunate,AS)对小鼠骨髓造血干/祖细胞分化的影响。方法:取小鼠骨髓干细胞进行体外液体或半固体定向培养并加入不同浓度的AS,光镜下计数半固体培养的红系集落形成单位(CFU-E)与红系爆式集落形成单位(BFU-E)数量,流式细胞术检测液体定向培养的细胞凋亡和线粒体膜电位变化,同时进行DNAladder凝胶电泳实验。结果:AS可显著抑制CFU-E与BFU-E集落的生成(P<0.05)并具有一定的量效关系;DNAladder凝胶电泳结果显示0.01～1.30mmol/L的AS可明显诱导细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞晚期凋亡/死亡率具有统计学意义(P<0.05);线粒体膜电位的下降程度也与AS浓度正相关(r=0.546,P=0.018)。结论:AS对小鼠骨髓造血干/祖细胞的增殖和分化具有明显抑制作用,小剂量AS可诱导小鼠骨髓造血干/祖细胞发生凋亡,大剂量可直接引起细胞坏死。