真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ的构建和鉴定

目的构建恒河猴绒毛膜促性腺激素β亚基macacam ulattac horionicg onadotrophin β subunit,rmCGβ）基因真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,并了解该质粒能否在真核细胞中表达。方法通过PCR扩增rmCGβ的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcDNA3．1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16／pcDNA3．1（＋）-rmCGβ细胞株中rmCGβ全段基因cDNA。结果经4轮PCR,成功扩增出rmCGβ的cDNA全长基因,酶切和测序证明正确构建了真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,通过RT-PCR方法证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达。建立了稳定的细胞株B16／pcDNA3．1（＋）-rmCGβ。结论成功克隆和构建了rmCGβ的真核表达质粒载体pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,为进一步研究rmCGβ的新功能和免疫治疗奠定了基础。     

SLPI基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建并鉴定含分泌型白细胞蛋白酶抑制蛋白(SLPI)基因的重组真核表达质粒。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出SLPI基因cDNA,将产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,构建含SLPI基因的重组真核表达质粒。将pcDNA-SLPI重组质粒和空载体pcDNA分别转染HeLa细胞,Western blot检测SLPI蛋白表达。结果核酸序列分析及双酶切鉴定SLPI已成功插入pcDNA3.1(+)载体中,转染pcDNA-SLPI的HeLa细胞中检测到高表达的SLPI蛋白。结论成功构建了含SLPI基因的重组真核表达质粒。     

Construction and identification of eukaryotic expression plasmids containing SLPI gene

目的 构建并鉴定含分泌型白细胞蛋白酶抑制蛋白(SLPI)基因的重组真核表达质粒.方法 以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出SLPI基因cDNA,将产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,构建含SLPI基因的重组真核表达质粒.将pcDNA-SLPI重组质粒和空载体peDNA分别转染HeLa细胞,Western blot检测SLPI蛋白表达.结果 核酸序列分析及双酶切鉴定SLPI已成功插入pcDNA3.1(+)载体中,转染pcDNA-SLPI的HeLa细胞中检测到高表达的SLPI蛋白.结论 成功构建了含SLPI基因的重组真核表达质粒.     

人乳腺癌转移抑制基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建乳腺癌转移抑制基因(BRMS 1)的真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS1,为进一步研究恶性肿瘤的转移机制及基因治疗提供物质基础.方法 常规方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,Trizol法提取细胞株总RNA;设计一对特异性引物,经过逆转录反应获得BRMS1 cDNA的CDS序列,连接到质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B上,构建BRMS 1的真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS1,行基因测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK-293,行Western blot验证其是否表达.结果 重组质粒pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1经双酶切及基因测序分析,验证了克隆的人BRMS 1基因cDNA序列与GenBank[AF159141]公布的人BRMS 1基因的cDNA序列吻合,重组体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1中插入的目的 基因BRMS 1是正向、单倍插入.结论 成功构建了BRMS 1真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1,为深入研究BRMS 1基因功能和BRMS 1基因治疗奠定了物质基础.     

重组质粒pcDNA3.1-CD44v5的构建及意义

目的:观察构建含人的肿瘤侵袭和转移的特异性抗原CD44v5编码基因的真核表达的重组载体,为进一步研究CD44v5修饰的DC融合瘤苗的免疫治疗作用及机制提供实验依据及理论基础.方法:以pcDNA3.1作为真核表达载体,选择CD44v5编码基因进行RT-PCR扩增,构建重组表达质粒,进行酶切鉴定和测序分析.结果:经酶切鉴定和测序分析表明,插入的目的基因片段为CD44v5的编码基因,由129 bp组成,与GeneBank中登录的cDNA相比较,同源性高达100%,且方向正确.结论:成功构建了pcDNA3.1-CD44v5真核表达的重组载体,为下一步构建和研究以CD44v5修饰的DC融合瘤苗抗肿瘤作用及其机制奠定了基础.     

人Prp8蛋白基因片段的克隆

目的：构建人Prp8基因全长真核表达质粒。方法：从HeLa细胞中提取总体RNA,两步法合成cDNA,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法,扩增出人Prp8基因的四段序列,首先克隆至pTZ57R/T载体,再定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）,构建pcDNA3.1（＋）-Prp8重组质粒。结果：RT-PCR法获得Prp8基因的4段序列,长度分别为2025、1090、1966、1963bp,分别与pTZ57R/T载体连接后,选择合适的酶切位点再连接成全长序列,然后将全长序列和pcDNA3.1（＋）真核表达载体连接、转化、酶切鉴定及序列分析后,证实pcDNA3.1（＋）-Prp8重组质粒构建成功。结论：成功克隆了人Prp8的编码基因,并构建了表达载体pcDNA3.1（＋）-Prp8。     

人类U5·116 ku蛋白基因片段的克隆

目的:构建人类U5·116 ku基因全长真核表达质粒。方法:从HeLa细胞中提取总体RNA,一步法合成单链cDNA,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,扩增出人类U5·116 ku基因两段连续的序列,首先分别克隆至pTZ57R/T载体,两段序列连接成全长后再定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)-U5·116 ku重组质粒。结果:RT-PCR法获得U5·116 ku基因两段连续的序列,长度分别为1672bp和1246bp,分别与pTZ57R/T载体连接后,选择合适的酶切位点再连接成全长序列,然后将全长序列和pcDNA3.1(-)真核表达载体进行连接、转化、酶切鉴定及序列分析后,证实pcDNA3.1(-)-U5·116 ku重组质粒构建成功。结论:成功克隆了人类U5·116 ku的编码基因,并构建了其真核表达质粒pcDNA3.1(-)-U5·116 ku。     

小鼠ORMDL3表达质粒的构建

目的构建小鼠血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因的表达质粒,并在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3细胞)中检测其过表达效果。方法根据小鼠ORMDL3蛋白的编码序列设计引物,以NIH3T3细胞cDNA为模板,PCR扩增ORMDL3的编码序列,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ酶切位点之间,并测序鉴定。由脂质体介导将pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1-ORMDL3质粒分别瞬时转染NIH3T3细胞中,24h后收取细胞,抽取细胞全蛋白,Western blot检测ORMDL3蛋白的相对表达量。结果成功构建小鼠ORMDL3表达质粒pcDNA3.1-ORMDL3,该质粒瞬时转染至NIH3T3细胞内可有效增加ORMDL3蛋白表达2倍左右(P<0.05)。结论成功构建小鼠ORMDL3表达质粒,为后续小鼠动物模型研究ORMDL3基因的功能及致病机制提供依据。     

野生型DPP Ⅳ真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建野生型DPP Ⅳ真核表达质粒。方法将野生型DPP Ⅳ基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3 DPP Ⅳ;然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定。结果经酶切和DNA序列测定鉴定证实重组质粒构建正确。结论真核表达质粒pcDNA3DPP Ⅳ构建成功,为进一步研究DPP Ⅳ基因在卵巢癌细胞中的表达和生物学作用奠定了基础。     

p 16 基因对人肝癌细胞的生长抑制作用的初步研究

目的探讨抑癌基因p16对肝癌细胞生长的抑制作用。方法将p16 cDNA亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体上,并经脂质体介导转染至人肝癌细胞株SMMC-7721。用MTT法和Western blot分析转染细胞的生长情况。结果成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-p16,转染pcDNA3.1-p16的SMMC-7721细胞生长速度受到明显抑制;经Western blot证实,转染后有外源p16蛋白的表达,且伴随Bax上调,Bcl-2和cIAP2的下调。结论重组pcDNA3.1-p16质粒能在人肝癌细胞SMMC-7721内表达,且能抑制SMMC-7721的生长,其机理与诱导肿瘤细胞凋亡相关。     

结核分枝杆菌Ag85B真核表达质粒的构建及其表达

目的：构建结核分枝杆菌Ag85B真核表达质粒并表达。方法：从结核分枝杆菌（H37Rv）基因组中扩增出Ag85B编码基因，经限制性内切酶消化后，定向克隆入pcDNA3.1( )中。采用脂质体法将pcDNA/Ag85B转染COS－7细胞，采用RT－PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：扩增出Ag85B基因，经双向DNA序列测定，与Genbank注泵的序列一致；重组质粒转染COS－7细胞后经检测证实，该基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了pcDNA/Ag85B质粒，其在真核细胞中表达的蛋白具有良好的抗原性。     

胞红蛋白在CHO细胞中的表达及其抗氧化活性研究

构建胞红蛋白(Cytoglobin,CYGB)真核表达载体,并在CHO细胞中进行表达。通过PCR技术扩增了CYGB基因序列,并将CYGB基因序列定向插入pcDNA3.1(+)表达载体中,构建了pcDNA3.1-CYGB真核表达载体。将重组表达载体pcDNA3.1-CYGB转染CHO细胞,经G418筛选出阳性细胞株。培养、收集细胞,提取细胞总蛋白,经Western Bloting鉴定证明CYGB表达。通过H2O2(800μmol/L)诱导的氧化应激损伤实验,检验CYGB的抗氧化活性,与对照组相比,CYGB表达细胞株提高了细胞内超氧化物酶(SOD)的活力,显著的提高了细胞在H2O2诱导的氧化应激下的存活率。研究结果表明,真核表达载体pcDNA3.1-CYGB构建成功,CYGB在真核细胞CHO中成功表达。     

人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的人脂联素（Adiponectin）真核表达质粒。方法：用本实验室已构建好的人脂联素克隆载体pMD18—T／Adiponeetin为模板，结合已设计好的特异性引物。采用PCR方法克隆出Adiponectin目的片段，将该目的片段再连至真核表达载体pcDNA3．1／CT—GFP—TOPO上，转化入TOP10感受态细胞中，通过筛选得到融合有绿色荧光蛋白的重组质粒pcDNA3．1／CT—GFP—TOPO—Adiponectin。结果：PCR获得长度为736bp的目的片段，经pcDNA3．1／CT—GFP-TOPO真核表达载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入的目的片段与genebank检索的人脂联素cDNA序列（Accession NM-004797）100％配。结论：绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体构建成功。     

E3泛素连接酶HECTD3真核表达质粒的构建

目的：克隆E3泛素连接酶（homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3, HECTD3）基因及构建真核表达质粒。方法提取人卵巢癌细胞SKOV-3细胞RNA,并逆转录为cDNA,以此作为模板PCR法扩增HECTD3基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）,测序验证构建质粒中包含HECTD3基因。结论 HECTD3基因克隆及真核表达质粒构建成功,可以用于后续卵巢癌发生发展的分子生物学研究。     

NTE酯酶活力域真核表达载体的构建及其表达

目的构建人神经病变靶标酯酶（NTE）酯酶活力域（NESP）真核表达载体，并在细胞中表达。方法利用含有特定酶切位点的引物，通过PCR扩增出其酯酶活力域，经T载体克隆测序正确后，双酶切回收cDNA片段定向插入到pcDNA3．1（＋）中，通过酶切鉴定其真核表达载体的构建。然后将其转染到真核细胞中，通过NTE活力测定，检测其表达效果。结果经PCR获得了NTE的1．6kb酯酶活力域的cDNA片段，T载体克隆后测序证实完全正确，然后克隆到真核表达载体中获得了NTE酯酶活力域真核表达载体pcDNA—NEST。瞬时转染到COS7和SH-SY5Y细胞中，NTE的活力与对照细胞相比显著提高。结论成功构建了NEST真核表达载体，并在哺乳动物细胞中表达。     

MCHR2在CHO细胞中的稳定表达及其信号通路分析

目的构建人MCHR2基因真核表达载体,在CHO细胞中进行稳定表达,并分析MCHR2介导的信号转导通路。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,定向插入到真核表达载体pcDNA3·1(+),经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,经RT-PCR和Western blot鉴定后,通过测定细胞内cAMP、Ca2+浓度的改变分析MCHR2的信号转导通路。结果成功构建了pcDNA3·1-MCHR2真核表达载体并稳定转入CHO细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因,MCH作用于MCHR2后不影响细胞内cAMP生成,可促使细胞内钙库释放Ca2+,进而使胞内Ca2+浓度出现明显而短暂的升高,提示MCHR2的信号转导通路主要是与Gq蛋白偶联。结论人MCHR2的稳定表达和信号转导通路分析为进一步体外研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础。