乙型肝炎病毒核苷类药物耐药突变和基因型研究

目的研究聚合酶链反应-连接酶检测反应(PCR-LDR)检测乙型肝炎(下称乙肝)病毒核苷类药物耐药位点和基因型的可行性。方法运用多重LDR和PCR原理,在乙肝病毒基因相关区域设计引物和探针检测突变位点和基因型。结果 156例临床样本中,B型占60.90%(95/156),C型占37.20%(58/156),非B非C型占1.90%(3/156)。此外共检出56例样本存在突变,其中拉米夫定耐药突变41例。结论本研究显示拉米夫定耐药突变主要在rtM204I/V和rtL180M,阿德福韦以rtN236T/rtA181V为主;恩替卡韦一般联合拉米夫定耐药,并且发生耐药突变以B型为多。     

连接酶检测反应法检测乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药突变的可行性

目的探讨依据寡核苷酸等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)扩增及连接酶检测反应(LDR)方法检测乙型肝炎病毒(HBV)4种核苷(酸)类似物耐药突变的可行性。方法以基因库公布的981条HBV基因序列为基础,针对拉米夫啶、替比夫啶、阿德福韦和恩替卡韦8个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计15对特异性引物,采用多重PCR扩增HBV P基因区野生型和突变型目的片段,然后进行多重LDR,最后在ABI3130测序仪上电泳,根据内参标记、LDR产物的长度进行结果判读。应用此方法对12例慢性HBV感染患者血清进行检测,同时采用荧光PCR、焦磷酸测序技术对其验证,判断其特异性和准确性。结果 LDR法能有效区分包括rtL180M、YMDD、YIDD、YVDD、rtA181V/T、rtN236T、rtT184G、rtS202I、rtM250V野生株和部分突变株;4例HBV DNA>106copy/mL患者检测出野生株和突变株,结果与焦磷酸测序一致;LDR法与荧光PCR法检测结果一致率达83.3%(10/12)。结论血清HBV DNA>106 copy/mL时结合多重PCR的复合LDR可通过一次扩增检测产物中的多个单突变或野生型位点,有助于核苷(酸)类似物耐药的诊断和治疗。     

某地区乙型肝炎病毒基因型分布和P区耐药突变模式分析

目的探讨十堰地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布和P区耐药突变模式及两者的相关性。方法将在该院进行治疗的224例慢性乙型肝炎患者纳入本研究,提取患者血液标本中的HBV DNA,利用ABI 3730型遗传分析仪对DNA进行测序,通过SeqMan软件实施序列比对,分析HBV DNA的基因型和P区耐药突变的情况。结果检出HBV基因型为B型者136例,占60.71%;为C型者62例,占27.68%。二者比例均高于D型、B+C型及未分型者,差异有统计学意义(P0.05)。78例明确出现耐药突变,其中B基因型对于拉米夫定以及阿德福韦的耐药率分别为18.38%与9.56%,与C基因型对于二者的耐药率16.13%与9.68%相比,差异均无统计学意义(P0.05)。B基因型患者M204V、M204I耐药突变的发生率分别为38.60%、17.54%,C基因型患者则分别为28.57%与38.10%,两种基因型患者比较差异无统计学意义(P0.05)。B、C型基因突变患者间YMDD突变(M204V、M204I)及非YMDD突变所占比例比较,差异均无统计学意义(P0.05)。B基因型及C基因型分别与M204V及M204I两种突变均呈正相关。结论十堰地区HBV的基因型主要是B型及C型,发生的HBV耐药突变则以M204I和M204V为主,在临床治疗时应按照基因分型以及耐药突变情况合理选择药物进行慢性乙型肝炎的治疗。     

应用PCR-LDR法检测乙型肝炎病毒核苷类药物耐药多基因突变位点

目的用多重聚合酶连接反应-连接酶检测反应分型法（PCR-LDR）同时检测乙型肝炎病毒（HBV）的180、181、184、204、236、250位点突变。方法以50例慢性乙型肝炎患者血清中HBV的DNA为模板,获得PCR-LDR反应探针连接产物,用ABI 3130Sequencer进行检测分析。结果共检测出拉米夫定耐药突变8例（16%）、阿德福韦耐药突变5例（10%）,恩替卡韦耐药突变1例（2%）,拉米夫定和阿德福韦同时耐药突变1例（2%）,突变情况与直接测序法检测的结果完全一致。结论用PCR-LDR法可以快速检测HBV基因的已知位点突变,与直接测序等其他方法相比具有更简单、方便、快捷的优势,有利于临床医生早期发现乙肝病人的耐药情况并及时更改治疗方案。     

清远地区1152例慢性乙型肝炎病毒耐药突变分析

目的通过检测慢性乙型肝炎患者核苷(酸)类药物治疗后耐药情况,了解清远地区乙型肝炎病毒基因突变流行情况。方法采集1152例乙型肝炎病毒耐药高危患者血清,采用硅胶柱体法提取HBV核酸,用PCR技术扩增DNA,使用反向斑点杂交技术检测突变位点并分析结果。结果1152例CHB患者中,检测出基因突变患者271例,突变率为23.52%(271/1152);271例基因突变患者中,rt204突变率为14.67%,rt180位点突变率为12.07%,rt236位点突变率为7.38%,rt181位点突变率为7.64%,rt184位点突变率为2.43%,rt202位点突变率为0.95%,rt250位点突变率为1.48%;LAM总耐药率为19.62%(226/1152),ADV总耐药率为9.46%(109/1152),ETV总耐药率为18.58%。结论清远地区乙型肝炎病毒存在较高的耐药基因突变率,定时监测CHB患者体内是否出现耐药基因突变,有利于判断抗病毒药物治疗的疗效,指导临床合理选择抗病毒药物,及时调整治疗方案,实现个体化诊治。     

连接酶反应检测乙型肝炎病毒阿德福韦耐药突变的初步研究

目的建立一种基于连接酶检测反应（LDR）技术的方法,检测慢性乙型肝炎患者阿德福韦（ADV）耐药突变rtA181V／T和rtN236T。方法设计特异性引物和针对不同突变类型的探针,聚合酶链反应（PCR）扩增后进行LDR,最后在测序仪上分析结果。以直接测序法作为对照分析55例临床标本,对结果不一致的标本进行亚克隆测序确认。结果LDR能够在野生型质粒背景下检测到1％的rtA181V／T或rtN236T突变质粒,不与野生型质粒及血清常见病毒产生交叉扩增。55例临床标本中检测到8例（14．5％）rtA181V／T和rtN236T双突变,6例（10．9％）rtA181V／T单突变,7例（12．7％）rtN236T单突变,与直接测序法结果一致的标本有52例（94．15％）。对3例结果不一致的标本进行亚克隆测序分析,结果与LDR一致。结论LDR是一种特异、敏感的方法,可以用于监测慢性乙型肝炎患者ADV耐药突变。     

武汉市乙型肝炎病毒基因型分布和P区耐药突变模式及两者相关性分析

目的探讨武汉地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情况和P区耐药突变模式及两者的相关性。方法提取HBV-DNA进行聚合酶链反应(PCR)扩增后以直接测序法检测HBV基因型及P区耐药突变位点,用SPSS19.0软件进行统计学分析。结果 219例慢性乙型肝炎患者血浆中检出HBV基因型B型135例(61.6%)、C型61例(27.9%)、D型2例(0.9%)、B+C混合型3例(1.4%)、B+F+G混合型1例(0.4%)、未分型17例(7.8%)。对202例分出基因型的标本进行耐药突变检测,其中76例发生耐药突变,突变位点以M204I(42.9%)、M204V(22.1%)、L180M(27.3%)多见。YMDD突变的发生率在B、C基因型之间比较差异无统计学意义(P0.05),但YMDD突变类型中的M204V和M204I在B、C基因型中的分布比较差异有统计学意义(P0.05)。结论武汉地区HBV基因型以B型和C型为主,HBV耐药突变以M204I、M204V、L180M多见,临床医生应根据基因分型和耐药突变结果为慢性乙型肝炎患者选择适合的治疗方案。     

南通地区乙型肝炎病毒P区耐药突变与基因型及其临床意义

目的 探讨南通地区乙型肝炎病毒P区耐药基因突变特征与基因型,为临床合理用药提供科学依据。方法 选择158例经核苷(酸)类似物治疗至少2年以上慢性乙型肝炎(CHB)患者和30例未接受过核苷(酸)类似物治疗的CHB患者作为研究对象,采用PCR产物直接测序法检测HBV P区耐药基因和基因型,同时观察三种主要突变模式与ALT和HBV DNA水平的关系。结果 158例CHB患者检出B基因型42例(26.58%),C基因型116例(73.42%)。131例发生P区不同位点突变,突变率为82.91%。共检出11个HBV突变位点,主要突变位点是M204I,L180M,M204V,A181V和A181T,耐药频率依次为41.14%,37.34%,22.15%,11.39%和10.13%,11个突变位点有21种突变模式。拉米夫定(LAM)耐药相关突变中以L180M和M204V合并出现为主,其次以M204I单独出现; 阿德福韦酯(ADV)耐药相关突变中以A181V为主; 恩替卡韦(ETV)耐药率较低。结论 南通地区HBV基因型以B和C型为主,C型为优势基因型; 耐药突变主要集中在拉米夫定和阿德福韦酯耐药相关的突变位点,而恩替卡韦耐药率较低。多位点耐药突变检测有助于及时发现病毒耐药,更好地指导临床治疗。     

用PCR-反向点杂交法检测九江地区乙型肝炎病毒基因型

目的调查九江地区乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus,HBV）基因型的分布情况。方法采用PCR-反向点杂交法,对203例HBV DNA阳性患者HBV进行基因型分析。结果共检测了203例患者,成功分型199例,占98.03%。其中B型160例,占78.82%;C型24例,占11.82%;B、C混合型14例,占6.90%;D型1例,占0.49%。结论利用PCR-反向点杂交法技术可以较简便地对HBV进行基因型分析,分型成功率高,适用于临床检测;在九江地区人群中感染的HBV以B型为主,C型次之,其它型别极少见。     

慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒耐药基因型研究

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)基因型与耐药病毒株产生的相关性。方法收集85例接受拉米夫定治疗1年以上的慢性乙型肝炎(CHB)患者为研究对象。采集血样经离心分离血浆,进行HBVDNA定量检测,再进行基因测序和基因分型。结果基因测序和基因型分析结果为A型4例(4.7%),B型28例(32.9%),C型37例(43.5%),D型11例(12.9%),B/C混合型5例(5.9%)。其中发生YMDD耐药突变的基因型突变率分别是A型1例(25.0%),B型5例(17.9%),C型16例(43.2%),D型2例(18.2%),B/C混合型1例(20.0%)。结论 HBV基因型C型发生YMDD耐药突变的频率较高,HBV基因型与YM-DD突变可能存在相关性。     

HBV基因分型和耐药突变基因检测

目的探讨东营地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布,乙型肝炎患者耐药情况,HBV基因型别与耐药以及突变位点关系。方法收集乙型肝炎患者血清300例,采用离心柱法提取HBV-DNA,聚合酶链反应(PCR)-反向点杂交法检测HBV分型和耐药突变。结果 300例HBV-DNA阳性患者中,检出B型、C型、B/C型及其他未检测出的基因型,未检出D型分型,检出结果中以C型为主,占81.8%;HBV患者耐药药物以拉米夫定和替比夫定的联合耐药为主,占43.6%;HBV耐药突变基因型主要为rt204I(24.35%)、rt204V(17.39%)及rt180M(17.39%);B型和C型的耐药突变率分别为30.77%和42.42%,差异有统计学意义(P0.05)。结论东营地区HBV基因C型多于B型,C型容易产生耐药,以rt204I,rt204V及rt180M基因突变型多见,拉米夫定和替比夫定的联合耐药多见,应根据基因分型和耐药突变结果对乙型肝炎患者选择适合的治疗方案。     

乙型肝炎基因分型同耐药位点突变的关系研究

目的：探讨耐药位点突变与乙型肝炎病毒(HBV)基因分型及其他临床信息的相关性。方法以358例慢性乙型肝炎(CHB)患者为研究对象,采用聚合酶链反应(PCR)-反向点杂交法检测耐药位点及基因分型。收集患者血清 HBV DNA 载量、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,以及乙型肝炎病毒 e 抗原(HBeAg)、性别、年龄、核苷(酸)类似物用药时间等临床资料。结果所有标本均成功扩增阳性条带。HBV 基因型以 B 型(267例)为主,其次为 C 型(81例)、D 型(10例)。使用核苷(酸)类似物的311患者中完全野生型269例,未用药的47例患者均未见耐药突变。耐药位点突变以204及180/204位点突变为主。耐药突变与患者性别、年龄、血清 HBV DNA 载量、病毒基因型、ALT 水平及 HBeAg 无明显相关性(P >0.05);用药时间越长,耐药突变率越大(P <0.05);180位点突变与204位点突变有一定相关性(P <0.05)。结论PCR-反向点杂交技术可有效检测 HBV 基因型及突变位点,可有效指导临床用药。     

太仓市慢性乙型肝炎患者耐药突变和基因型分布研究

目的：研究太仓地区慢性乙肝患者耐药突变和基因型分布情况,及 HBV 基因型与耐药突变的相关性。方法选择太仓地区350例慢性乙型肝炎患者,在使用核苷（酸）类药物抗病毒前,检测患者耐药突变及基因型情况,分析患者耐药突变与基因型的相关性。结果350例慢性乙肝患者,HBV 基因型分布：B 基因型172例,占49.14％;C 基因型164例,占46.85％;其中 D基因型9例,占2.57％;B、C 混合型基因型有5例,占1.42％;未发现其他基因型。本研究共检出58例耐药突变患者,其中 B 基因型22例,C 基因型35例,D 基因型1例,B、C 混合基因型患者未发现耐药突变。耐药突变位点：与拉米夫定相关的耐药突变36例（10.28％）,与阿德福韦相关的耐药突变16例（4.57％）,与恩替卡韦相关的耐药突变6例（1.71％）。结论太仓地区慢性乙肝患者 HBV 基因型以 B、C 型为主,2种基因型占90％以上,两种基因型比例相似。C 基因型患者发生耐药突变的比例较 B 基因型高,拉米夫定相关的耐药突变比例最高。建议对用药史不明确、复发再治疗的慢性乙肝患者,在接受核苷（酸）类药物治疗前进行耐药检测,选择针对性治疗方案。     

某市苗族、侗族及汉族乙型肝炎病毒基因分型及耐药基因检测

目的研究凯里市苗族、侗族及汉族乙型肝炎病毒(HBV)的基因分型和耐药基因变异状况。方法采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和基因芯片反向斑点杂交技术检测凯里市苗族、侗族及汉族293例乙型肝炎患者基因型和对拉米夫定、阿德福韦耐药突变基因型。用试剂盒自带的阴性、阳性对照作为每次测定的质控,确保结果的准确性。结果 (1)HBV基因型检测到B型及C型,其中B型259例(88.4%),C型25例(8.5%),无法分型9例(3.1%)。汉族B基因型比例低于苗族和侗族,C基因型比例明显高于其他2个民族,其基因型分布与其他少数民族比较,差异有统计学意义(χ2=15.55,P0.01);(2)286例对拉米夫定敏感,7例对拉米夫定耐药;7例对拉米夫定耐药的突变基因中,为苗族和汉族患者,侗族未见拉米夫定耐药。但3个民族HBV耐拉米夫定变异检出率比较,差异无统计学意义(χ2=3.20,P0.05)。所有293例患者均对阿德福韦敏感。结论凯里市HBV基因型以B型为主;HBV基因B型患者易对拉米夫定耐药,且以突变基因型以180M和204V为主。     

嘉兴地区乙肝病毒基因分型与病理及耐药的关系

目的：了解嘉兴地区慢性乙型肝炎（CHB）患者乙型肝炎病毒（HBV）基因型分布的特点,探讨基因型与病理及核苷类药物耐药之间的关系。方法采用荧光定量聚合酶链反应方法检测85例CHB患者的HBV基因型,同时检测血清HBV DNA、乙肝三系、核苷类药物耐药,并进行肝组织病理检查。结果85例CHB患者B基因型32例（37.65％）、C基因型53例（62.35％）,C基因型患者的HBV DNA水平、HBeAg阳性率均明显高于B基因型,差异均有统计学意义（t=2.78,χ2=8.03,P均＜0.05）。肝组织炎症坏死及肝纤维化的进展程度,C基因型较B基因型明显加重,差异均有统计学意义（χ2分别=8.82、10.67,P均＜0.05）,C基因型较B基因型发生拉米夫定、替比夫定耐药更多,差异均有统计学意义（χ2分别=4.03、4.03, P均＜0.05）。结论嘉兴地区CHB患者HBV基因型以C型为主,C型HBV复制能力强,拉米夫定、替比夫定耐药更多,更易导致严重肝脏病变。HBV基因分型对判断肝脏病变的严重程度和指导临床抗病毒治疗具有重要意义。     

不同类型乙型肝炎患者HBV基因型的分布

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）各种基因型在不同类型乙型肝炎患者中的分布.方法 用PCR结合限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测56例HBV感染的肝癌、58例肝硬化、60例慢性乙型肝炎患者以及60例HBV无症状携带者血清HBV基因型.结果 无症状携带者中B基因型为46.7%（28/60）,C基因型为33.3%（20/60）,D基因型为20.0%（12/60）;慢性乙型肝炎组B基因型为41.7%（25/60）,C基因型为36.7%（22/60）,D基因型为21.7%（13/60）;肝癌患者中B基因型为33.9%（19/56）、C基因型为60.7%（34/56）、D基因型为5.4%（3/56）;肝硬化患者中B基因型为31.0%（18/58）、C基因型为63.8%（37/58）,D基因型为3.5%（2/58）.结论 在慢性乙型肝炎和无症状携带者中以B基因型为优势感染毒株,而肝硬化和肝癌患者则以C基因型为优势感染毒株.     

慢性乙型肝炎重叠急性戊型肝炎63例HBV基因型的检测和分析

目的:探讨HBV基因型与慢性乙型肝炎重叠急性戊型肝炎发病机制的相关性.方法:采用Caliper微流芯片法测定63例慢性乙型肝炎重叠急性戊型肝炎患者的HBV基因型.同时对HBV-DNA定量采用荧光定量PCR技术测定,生化指标采用全自动生化分析仅检测.结果:63例慢性乙型肝炎重叠急性戊型肝炎患者B型和C型分别为22例和39例,C型HBV重叠HEV感染率明显高于B型(P<0.05),HbeAg(-)和HbeAg(+)分别为31例和32例,HbeAg(-)和HbeAg(+)的慢性乙型肝炎患者重叠HEV感染率相仿(P>0.05);C型患者血清ALT、AST、TBIL水平明显高于B型(JD<0.05),血清CHE、ALB、PTA水平明显低于B型(P<0.05);B型和C型患者HbeAg阳性率分别为31.8%和61.5%,C型患者HBeAg阳性率明显高于B型(P<0.05);在HbeAg(-)组中,B、C型HBV-DNA的阳性率分别为55.3%和26.7%,B型患者的HBV-DNA阳性率明显高于C型(P<0.05).结论:C型HBV感染的慢性乙型肝炎患者比B型更易重叠HEV感染,同时,C型患者肝功能损害要明显重于B型.B型HBV易发生前C区变异,可能是B型HBV感染的慢性乙型肝炎患者重叠HEV感染率低于C型的原因之一.