嗜酸粒细胞对支气管上皮细胞表达细胞间黏附分子1的诱导作用

目的探讨嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞联合培养对支气管上皮细胞表达细胞间黏附分子(ICAM)-1的影响。方法人嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞(BEAS-2B)联合培养4和12h,提取BEAS-2B细胞总RNA;通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法分析与嗜酸粒细胞联合培养对BEAS-2B细胞中ICAM-1基因表达的影响;BEAS-2B细胞表面ICAM-1蛋白质的变化用荧光抗体流式细胞分析。结果经嗜酸粒细胞活化后,BEAS-2B细胞中ICAM-1基因表达上调;BEAS-2B细胞表面ICAM-1蛋白质量显著增加(34.23±4.19和57.60±7.62,P<0.05)。结论嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞接触培养可诱导支气管上皮细胞表达ICAM-1。     

上皮细胞黏附分子在食管癌组织中的表达及其临床意义

目的 探讨上皮细胞黏附分子(Ep-CAM)在食管癌组织中的表达的临床意义。方法 采用免疫组织化学法分别检测食管癌黏膜组织(60例)、不典型增生的组织(35例)及正常食管黏膜组织(35例)中Ep-CAM的表达水平。结果 Ep-CAM在正常食管黏膜组织中无阳性表达,增生黏膜组织和癌组织中阳性表达率为分别为28.57%和90.00%,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05);其中,Ep-CAM的表达与肿瘤分化程度、淋巴是否转移及3年生存率有显著相关性(P<0.01或P<0.05)。结论 Ep-CAM在食管癌组织中特异性表达增高,具有作为食管癌病变诊断、预后判断及治疗指标的潜在价值。     

葡萄糖调节蛋白78真核表达载体及稳定转染人视网膜色素上皮细胞株的构建

背景：葡萄糖调节蛋白78是存在于内质网上最多的分子伴侣蛋白,具有保护细胞对抗细胞调亡的作用。目的：构建携带并正确表达外源性人葡萄糖调节蛋白78基因的重组真核表达载体,建立葡萄糖调节蛋白78基因稳定转染的人视网膜色素上皮细胞系。方法：扩增人葡萄糖调节蛋白78全长编码序列,将该目的基因与真核表达载体PEGFP-N1进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞,以PCR方法鉴定阳性克隆,并进行测序和分析比对,获得融合蛋白表达质粒载体pEGFP-grp78。通过阳离子脂质体介导将重组质粒pEGFP-grp78转染入体外培养的人视网膜色素上皮细胞,经G418筛选,建立稳定表达细胞系。结果与结论：体外培养的人视网膜色素上皮细胞株作为真核细胞表达系统,经荧光显微镜和RT-PCR方法检测,G418筛选的稳定转染细胞系中GFP大量表达,葡萄糖调节蛋白78mRNA的表达量是正常视网膜色素上皮细胞的4倍左右,表示脂质体介导的pEGFP-grp78质粒成功转染视网膜色素上皮细胞,并高效稳定表达葡萄糖调节蛋白78。     

葡萄糖调节蛋白78真核表达载体及稳定转染人视网膜色素上皮细胞株的构建

背景:葡萄糖调节蛋白78 是存在于内质网上最多的分子伴侣蛋白,具有保护细胞对抗细胞调亡的作用.目的:构建携带并正确表达外源性人葡萄糖调节蛋白78 基因的重组真核表达载体,建立葡萄糖调节蛋白78 基因稳定转染的人视网膜色素上皮细胞系.方法:扩增人葡萄糖调节蛋白78 全长编码序列,将该目的基因与真核表达载体PEGFP-N1 进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞,以PCR 方法鉴定阳性克隆,并进行测序和分析比对,获得融合蛋白表达质粒载体pEGFP-grp78.通过阳离子脂质体介导将重组质粒pEGFP-grp78 转染入体外培养的人视网膜色素上皮细胞,经G418 筛选,建立稳定表达细胞系.结果与结论:体外培养的人视网膜色素上皮细胞株作为真核细胞表达系统,经荧光显微镜和RT-PCR 方法检测,G418 筛选的稳定转染细胞系中GFP大量表达,葡萄糖调节蛋白78 mRNA 的表达量是正常视网膜色素上皮细胞的4 倍左右,表示脂质体介导的pEGFP-grp78 质粒成功转染视网膜色素上皮细胞,并高效稳定表达葡萄糖调节蛋白78.     

上皮细胞黏附分子在黏液表皮样癌中的研究进展

黏液表皮样癌（MEC）是口腔颌面部常见的上皮性恶性肿瘤。由于黏液表皮样癌具有高发病率和病死率,以及高转移率和复发率,因此患者的生活质量一直是治疗和康复过程中的一个严重问题。上皮细胞黏附分子（EpCAM） 高表达于快速生长的上皮肿瘤中,与上皮性恶性肿瘤密切相关,参与上皮性恶性肿瘤细胞黏附、信号传导、迁移和增殖,并与肿瘤的预后密切相关。当细胞与细胞间发生黏附作用时,EpCAM聚集于细胞膜表面,可改变细胞内的微环境,影响MEC的预后及转移。EpCAM参与肿瘤的发生、发展,可为MEC的早期诊断及预后评估提供新的参考依据。     

人同源盒基因HoxB4真核表达载体的构建及鉴定

本研究旨在构建人同源盒基因HoxB4真核表达载体并进行鉴定,为进一步研究HoxB4的作用提供物质基础。采用RT-PCR的方法从健康产妇脐血单个核细胞中扩增出该基因,并将HoxB4的PCR产物用EcoRI和BamHI双酶切后连接到用EcoRI和BamHI双酶切的带有EGFP编码序列和内部核糖体转入位点(IRES)的真核表达载体pIRES2-EGFP中,重组质粒在大肠杆菌DH5α内扩增后,对其进行双酶切及测序鉴定以证实载体构建成功。结果表明,双酶切和质粒测序结果证明HoxB4基因正确的连接到真核表达载体pIRES2-EGFP中,开放阅读框架正确,pIRES2-EGFP/HoxB4真核表达载体构建成功。结论 :利用PCR,DNA重组等分子生物学技术,成功构建了pIRES2-EGFP/HoxB4真核表达载体,为探讨HoxB4基因在造血干细胞的增殖和分化的调控功能提供了实验基础。     

人性激素结合球蛋白的真核表达、纯化鉴定及质控品应用分析

目的 构建人性激素结合球蛋白(SHBG)的重组真核表达载体,获得高纯度的人SHBG重组蛋白.方法 根据人SHBG基因序列,利用Primer Premier 6.0设计引物,扩增获得人SHBG基因;构建人SH-BG-pCMV3H重组真核表达载体;将其转染至HEK-293F细胞,提取人SHBG重组蛋白,并用ConA柱亲和层析法纯化;采用人S HBG检测试剂盒对其蛋白浓度进行鉴定.结果 人S HBG基因产物长度与预期一致,约为1200 bp;测序比对分析结果显示人SHBG基因成功插入pCMV3H载体;电泳结果显示在相对分子质量约为42×103处有一明显条带,与预期蛋白质位置一致;人SHBG检测试剂盒鉴定结果显示人SHBG重组蛋白作为质控品与西门子、安图生物、罗氏一致性良好;含钙离子缓冲液中人S HBG重组蛋白稳定性优于不含钙离子缓冲液.结论 真核表达人SHBG重组蛋白能够作为SHBG检测试剂的质控品,且各厂家检测一致性良好;钙离子有利于提升人SHBG蛋白的稳定性.     

上皮细胞黏附分子与肝母细胞瘤患儿病理特征及预后的相关性

目的:研究上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,Ep-CAM)表达与肝母细胞瘤患儿病理特征及预后的相关性。方法:以西安市儿童医院2015年1月至2017年1月收治的62例肝母细胞瘤患儿的肿瘤组织和癌旁组织为研究材料,采用免疫组织化学法检测Ep-CAM表达。分析Ep-CAM表达情况与患儿性别、年龄、病理分期、病理类型等病理特征的关系,并绘制患儿生存曲线,分析上皮细胞黏附分子表达水平与预后的相关性。结果:62例肝母细胞瘤肿瘤组织和癌旁组织EpCAM表达阳性率分别为75.81%和0.00%,差异有统计学意义(P<0.05)。肝母细胞瘤组织中Ep-CAM表达阳性与PRETEXT术前分期有关,与患儿年龄、性别、术前甲胎蛋白水平和病理类型无关。PRETEXT分期Ⅲ期和Ⅳ期患儿肿瘤组织中Ep-CAM阳性表达率显著高于Ⅰ期和Ⅱ期患儿(P<0.05)。Ep-CAM阳性和阴性患儿2年总生存率分别为34.04%(16/47)和86.67%(13/15),差异有统计学意义(P<0.05)。Log-rank分析Ep-CAM阳性和阴性患儿总的生存率差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Ep-CAM蛋白在肝母细胞瘤组织中呈高表达,与PRETEXT分期存在相关性,是影响预后的关键因素,可能作为肝母细胞瘤诊断和预后评估的新靶点加以深入研究。     

人可溶性生长刺激表达基因2蛋白的真核表达、纯化和鉴定

目的构建人可溶性生长刺激表达基因2(sST2)蛋白的重组真核表达载体,获得高纯度的人sST2重组蛋白。方法根据人sST2基因序列设计引物,利用RT-PCR技术获得人sST2基因;构建人sST2-pcDNA3.1-his(-)重组真核表达载体;脂质体法转染COS7细胞,表达人sST2重组蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化;用western blot和ELISA法对人sST2重组蛋白进行鉴定。结果PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示产物长度与预期一致,约为1000 bp;同源性比对分析结果显示,人sST2基因成功插入PGH-T载体;用Bam HⅠ和Hin dⅢ对重组真核表达载体双酶切后凝胶电泳分析,结果显示产物电泳位置与预期一致;表达产物经SDS-PAGE电泳结果显示在相对分子质量(M r)约为65000处有一明显条带,与预期蛋白质位置一致;western blot鉴定结果显示人sST2重组蛋白有His标签,ELISA鉴定结果显示人sST2重组蛋白有与抗sST2抗体结合的特异性抗原表位。结论通过重组DNA技术成功构建人sST2基因重组真核表达载体,通过蛋白质纯化技术成功获得人sST2重组蛋白。     

人紧密连接蛋白claudin-6真核表达载体的构建

目的构建人紧密连接蛋白claudin-6的cDNA真核表达载体。方法应用RT-PCR、T-A克隆、限制性内切酶切及亚克隆等技术将claudin-6基因全长克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）质粒中。结果酶切鉴定、PCR扩增以及序列分析表明已经将claudin-6基因全长序列克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）质粒中。结论获得了人claudin-6基因的全长cDNA片段,构建了claudin-6原核克隆载体和真核表达载体。实验中发现,中国人claudin-6基因的461位点碱基为A,而GeneBank中西班牙人claudin-6基因的461位点碱基为G,说明claudin-6基因461位点可能存在多态性。     

pcDNA-GPC3真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人类GPC3重组真核表达载体。方法以人类肝脏cDNA文库为模板扩增出GPC3基因序列,应用T克隆载体及pcDNA真核表达载体重构,将质粒转化进入HLE人肝癌细胞系,进行荧光免疫方法检测。结果 测序结果序列正确,荧光染色转染质粒的HLE细胞可见细胞浆和细胞膜上有GPC3的表达。结论成功构建真核表达载体pcDNA-GPC3,并在真核细胞中可以表达。     

有利于创伤修复愈合的人血管内皮细胞生长因子真核表达质粒的构建

目的构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的真核表达质粒pcDNA3-VEGF.方法采用PCR技术和DNA重组技术,将编码人VEGF的cDNA序列克隆至表达载体pcDNA3.1(+)上,挑取阳性克隆扩增后,提取DNA进行酶切鉴定和测序.结果从HepG2细胞中克隆出VEGF121基因的cDNA片段,该序列由Kozak序列,翻译起始密码子ATG,信号序列,编码序列和终止密码子等部分组成.DNA测序表明,VEGF121基因的cDNA序列正向插入到pcDNA3.1(+)的多克隆位点上.结论本研究获得了VEGF121基因的真核达质粒pcDNA3-VEGF,为进一步研究VEGF的转基因治疗奠定基础.     

重组质粒pEGFP-Brn-4的构建与鉴定

目的构建神经同源盒基因Brn-4真核表达重组质粒。方法从新生SD大鼠脑组织提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的方法扩增编码鼠Brn-4的基因片段,应用基因重组技术将鼠Brn-4基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-C2中,经BamHI、EcoRⅠ双酶切和单酶切证实所构建的载体。结果 RT-PCR方法获得鼠Brn-4的基因片段,限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组子。结论新构建的真核表达重组质粒pEGFP-Brn-4通过鉴定,结构正确,为后续研究在神经干细胞中表达及其体内研究奠定了基础。     

sTRAIL真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞增殖影响的体外实验研究

目的构建重组基因表达载体PcDNA-sTRAIL并观察其对C6胶质瘤细胞的抑制作用。方法通过PCR扩增和定向克隆技术构建重组真核表达载体PcDNA-sTRAIL。以阳离子脂质体介导转染C6胶质瘤细胞并用流式细胞仪观测对细胞增殖的影响。结果经过测序鉴定和蛋白表达检测证实,重组真核表达载体PcDNA-sTRAIL构建成功。阳离子脂质体介导质粒转染C6胶质瘤细胞阳性率达50%。脂质体PcDNA-sTRAIL转染C6细胞后,相比未转染、空质粒转染、Lipofectin转染组C6胶质瘤细胞增殖抑制、细胞凋亡明显增加（t分别=9.52、7.20、2.84,P均〈0.05）。结论成功构建了sTRAIL基因的真核表达载体,并从体外实验中初步证实了其对C6胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用。     

人乳头瘤病毒16型L1基因真核表达载体的构建及表达

目的从感染人乳头瘤病毒（HPV）的新鲜宫颈癌组织中扩增HPV16型晚期蛋白L1基因全长，构建表达载体，并验证目的蛋白的表达。方法根据基因全长设计一对特异引物，用PCR的方法从宫颈癌组织DNA，中获得L1基因，以pMD18T为克隆载体，构建重组质粒进行亚克隆，再以pcDNA3．1（＋）为载体构建表达质粒，转染至人肝细胞系H7702，提取蛋白，采用Western Blot方法检测HPV16-L1蛋白的表达。结果从长春地区宫颈癌临床标本克隆到的HPV16型L1蛋白编码序列与Genebank报道序列高度同源，其真核表达产物与特异性抗体能够特异性结合。结论成功构建重组表达质粒pcDNA3．1（＋）-HPV16-L1，为进一步研制HPV预防性疫苗创造基础条件。     

人表皮生长因子真核表达载体的鉴定

目的：鉴定人表皮生长因子的真核表达载体。方法：重组体进行限制性酶切及PCR可见目的片段。结果：pCDDA3.1—hEGF真核表达载体已成功构建。结论：已成功构建hEGF真核表达裁体，为进一步研究hEGF的功能奠定了基础。     

分泌人内皮抑素基因工程细胞系的建立

目的建立稳定的基因工程细胞系。方法将含有白细胞介素-2（IL-2）分泌肽的人endostatin全长cDNA插入真核表达载体pSNA2.0,产生重组质粒pSNA2.0/hEndostatin,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK293细胞中,G418筛选后得到阳性克隆hED/293,采用Western-blot检测转染细胞上清中endostatin蛋白的表达。结果hED/293细胞株培养上清中有endosta-tin蛋白的表达,分子量为20000。结论重组pSNA2.0/hEndostatin真核表达载体构建正确,转染HEK293细胞后可有效的表达人endostatin蛋白,并能分泌到细胞外。     

转染真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27对星形胶质细胞增殖的抑制作用

目的:探讨脂质体介导真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27转染体外培养星形胶质细胞后对其增殖的影响。方法:利用脂质体将质粒pGFAP-IRES2-EGFP-p27转染入纯化培养的星形胶质细胞,通过免疫荧光化学标记观察转染质粒pGFAP-IRES2-EGFP-p27后星形胶质细胞内外源基因EGFP、p27的表达情况,并观察其对星形胶质细胞Ki67表达的影响。结果:脂质体介导质粒pGFAP-IRES2-EGFP-p27转染后24 h即开始有EGFP的表达,48-72 h EGFP表达达高峰;通过免疫荧光标记发现,表达EGFP的细胞同时有p27表达水平明显增高;和EGFP阴性细胞相比,EGFP阳性细胞中Ki67的阳性率明显下调(P<0.01)。结论:GFAP启动子能启动目的基因p27和EGFP在星形胶质细胞的表达;连于p27的下游EGFP可作为报告基因,通过观察EGFP的表达可了解外源性p27的表达情况;导入外源性p27能有效抑制星形胶质细胞的增殖。     

HLA-E真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达与鉴定

本研究旨在亚克隆HLA-E真核表达载体，并使其在HLA-I类阴性的靶细胞K562细胞上获得稳定表达。首先采用PcR方法从多顺反子表达载体(pG/A2E)扩增出目的片段A2／ E cDNA，与真核表达载体pcDNA3．1( )重组，构建成HLA—E真核表达载体pcDNA3．1( )／A2E，然后采用脂质体转染的方法将重组质粒转入K562细胞，最后经G418筛选及有限稀释，利用抗HLA-E特异的单克隆抗体K0126-3进行FACS检测，以观察HLA—E分子在靶细胞表面的表达情况。结果显示，HLA-E分子在经pcDNA3．1( )／A2E转染的靶细胞表面获得表达(27．76％)，而经空载体pcDNA3．1( )转染的靶细胞则未获得表达。结论：成功构建了pcDNA3．1( )／A2E真核表达载体，并使HLA-E分子在HLA-I类阴性的K562细胞表面表达，为进一步研究HLA-E作用的分子机制以及探索HLA-E与NK受体之间的相互作用和HLA-E体外表达对NK细胞功能的影响奠定了基础。