小鼠CXCR3基因转染细胞株的构建、鉴定及生物学功能研究

目的:构建含有小鼠CXCR3基因的重组逆转录病毒载体,获得稳定表达小鼠CXCR3分子的基因转染细胞株L929-mCXCR3,研究CXCR3与其配IP-10相互作用引起的L929-mCXCR3的迁移效应。方法:取1只雌性BALB/c小鼠(7周龄),尾静脉注射0.5mgConA/只,12h后取其脾脏,研磨成细胞悬液后,分离获得脾脏细胞;用含5万U/L人IL-2的RPMI1640培养基培养3d;收集细胞,TRIzol一步法抽提总RNA,RT-PCR扩增小鼠CXCR3全长基因,装入逆转录病毒载体pEGZ-term,与两辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞293T,收集含完整逆转录病毒颗粒的293T培养上清感染L929细胞,重复感染3次,筛选获得含Zeocin抗性的稳定表达小鼠CXCR3分子的基因转染细胞株。采用流式细胞术(FCM)和RT-PCR对CXCR3分子的表达进行鉴定。Transwell分析基因转染细胞株L929-mCXCR3在IP-10作用下的迁移能力。结果:构建了含小鼠CXCR3基因的重组逆转录病毒载体,建立了稳定表达小鼠CXCR3分子的基因转染细胞株L929-mCXCR3,其膜表面CXCR3分子阳性表达率为97.0%;该基因转染细胞株在IP-10的介导下可定向迁移,迁移率为4.356%。结论:L929-mCXCR3细胞株为研究CXCR3信号通路的生物学特性、肿瘤转移模型的建立和抗小鼠CXCR3单克隆抗体的研制奠定了基础。     

人CXCR3B基因转染细胞株的构建、鉴定及生物学功能研究

目的:克隆人CXCR3B基因,并构建含有该目的基因的真核表达载体,获得稳定表达人CXCR3B分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3B.方法:采用PCR方法从pMD19-T/huCXCR3A质粒中扩增人CXCR3B基因,通过双酶切装入真核表达载体pIRES2-EGFP中;脂质体法转染L929细胞,G418加压筛选阳性克隆;分别用RT-PCR方法与免疫荧光技术分析阳性克隆中人CXCR3B在mRNA和蛋白水平的表达.MTT分析基因转染细胞株 L929-huCXCR3B 在Mig( monokine induced by IFN-γ,IFN-γ诱导的单核因子)作用下的增殖能力.结果:成功克隆了人CXCR3B基因并构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/huCXCR3B,转染该载体后获得了稳定表达人CXCR3B的基因转染细胞株L929-huCXCR3B,膜表面CX-CR3B分子的阳性表达率为93％.该基因转染细胞与其配体Mig共培养24、48及72 h,抑制率分别为41.44％、44.01％和24.80％.结论:L929-huCXCR3B细胞株的建立为研究CXCR3B信号转导及制备相应的单克隆抗体(mAb)奠定了基础.     

MAGE-3基因真核表达载体构建及在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　扩增人黑色素瘤抗原 3(Melanomaantigen 3,MAGE 3)基因 ,构建真核表达载体 ,并在小鼠黑色素细胞瘤B16中进行表达。方法　采用PCR扩增MAGE 3基因 ,连接到真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,构建真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞。G4 18筛选阳性克隆 ,荧光显微镜和RT PCR分别检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白 (Enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)的表达和MAGE 3mRNA的表达。结果　从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 95 0bp的片段 ,成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆 ,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光 ,RT PCR检测到MAGE 3mRNA的表达。结论　成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,获得了稳定表达该载体的小鼠黑色素瘤B16细胞系 ,为研究MAGE 3在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。     

喉癌来源黑色素瘤抗原A3在小鼠黑色素瘤细胞模型的表达

目的:建立pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒在小鼠黑色素瘤B16细胞稳定表达的肿瘤细胞模型。方法:将喉癌来源的黑色素瘤抗原A3(Melanoma-associated antigen A3,MAGE-A3)构建成真核质粒pIRES2-EGFP/MAGE-A3,脂质体法将pIRES2-EGFP/MAGE-A3转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选阳性克隆,荧光显微镜检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的表达,荧光定量PCR(qRT-PCR)检查MAGE-A3在B16细胞中的转录。结果:pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒转染B16细胞后筛选得到阳性克隆,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光,qRT-PCR可检测到MAGE-A3 mRNA的转录。结论:pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒通过脂质体法能有效转染,并在B16稳定表达,成功建立了MAGE-A3肿瘤细胞模型。     

Bcl-xl基因克隆及其在SH-SY5Y细胞中的表达

目的研究Bcl-xl基因在SH-SY5Y细胞中的表达。方法构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,采用脂质体介导将重组质粒导入SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Western-blot检测外源基因表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,并用脂质体介导的方法高效转染SH-SY5Y细胞,RT-PCR显示有Bcl-xlmRNA表达增加,Western-blot显示有32kD的蛋白质表达增加。结论重组质粒pIRES2-EGFP/Bcl-xl经转染能够在SH-SY5Y细胞中高效表达,为进一步研究Bcl-xl对SH-SY5Y细胞的生物学功能奠定了基础。     

转染Lgr5基因对结肠癌细胞株体外生物学特性影响的研究

目的 构建pIRES2-EGFP-Lgr5重组表达载体,获得SW480/Lgr5瞬时基因转染细胞株,并探讨转染Lgr5基因对结肠癌细胞株生物学特性的影响.方法 运用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从结肠癌组织中获得Lgr5全长基因,经双酶切(XhoI和BamHI)连接入真核表达载体pIRES2-EGFP中,利用脂质体法转染SW480细胞,经流式细胞术、Western blot、免疫细胞化学法检测Lgr5分子的表达;CCK-8法和悬滴实验分析Lgr5对结肠癌细胞增殖率和成球能力的影响,划痕实验分析Lgr5对结肠癌细胞迁移能力的影响.结果 成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP/hLgr5,并获得SW480/Lgr5瞬时基因转染细胞株;转染Lgr5基因的结肠癌细胞体外增殖速度加快,形成的细胞球大而紧密但迁移能力下降.结论 Lgr5基因转染促进结肠癌细胞株体外的生长,为进一步研究人Lgr5分子的生物学特性及其在结肠癌中的作用机制奠定了基础.     

鼠抗人CXCR3单克隆抗体的研制及生物学功能研究

目的:获得持续分泌鼠抗人CXCR3单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株;以鼠抗人CXCR3 mAb作为工具,研究人CXCR3分子的表达特性及CXCR3信号转导对L929 -huCXCR3和结肠癌细胞株的迁移及增殖的影响.方法:以高表达人CXCR3膜型分子的L929-huCXCR3细胞作为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交技术,将免疫小鼠的脾脏细胞与同种系小鼠的骨髓瘤细胞sp2/0进行融合.以L929-huCXCR3作为筛选细胞,转染空载体的L929 -mock细胞作为阴性对照细胞,采用间接免疫荧光和流式细胞术,筛选能持续分泌抗人CXCR3 mAb的杂交瘤细胞株.采用Ig亚类快速定性试纸法和间接免疫荧光法对所获得的杂交瘤细胞株和mAb进行鉴定;用间接免疫荧光法分析CXCR3分子在肿瘤细胞表面的表达;Transwell隔离小室检测mAb对L929 -huCXCR3和结肠癌细胞株Colo205、HCT116及HT29迁移的影响;MTT法分析mAb对结肠癌细胞株Colo205增殖的影响.结果:获得了1株能持续分泌鼠抗人CXCR3 mAb的杂交瘤细胞株,命名为9B5.经快速定性试纸分析显示,该mAb重链为IgG1亚类,轻链为链;间接免疫荧光和流式细胞术分析显示,mAb 9B5可识别活化T淋巴细胞和结肠癌细胞株Colo205、HCT116及HT29表面的CXCR3分子.通过阻断CXCR3信号转导,mAb 9B5可抑制L929-huCXCR3细胞和结肠癌细胞株Colo205、HCT116和HT29的定向迁移及IP-10对Colo205的促增殖作用.结论:成功获得了1株能持续分泌鼠抗人CXCR3 mAb的杂交瘤细胞株,为研究CXCR3的表达特性及深入探讨CXCR3信号转导在肿瘤生长与转移过程中的作用及机制奠定了物质基础,并且有望为治疗肿瘤转移提供新的思路和新型药物.     

真核表达载体pIRES2-EGFP-PDLIM2的构建及在EJ细胞中的表达

背景：核因子κB在肿瘤生成过程中起重要作用,PDLIM2基因可以介导终止核因子κB的活性,解除核因子κB对肿瘤细胞的凋亡抑制作用。 目的：克隆人PDLIM2全长基因,构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。 方法：采用反转录-聚合酶链反应从新鲜膀胱组织总RNA中克隆PDLIM2全长基因,与经Bam HI、Xho Ⅰ相同双酶切的pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PDLIM2,经酶切及测序鉴定重组质粒中PDLIM2基因的完整性和忠实性。荧光显微镜下观察重组质粒转染的EJ细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞PDLIM2的表达进行RT-PCR检测。 结果与结论：经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的EJ细胞中获得PDLIM2的高效表达。表明用反转录-聚合酶链反应方法成功从膀胱组织中克隆出PDLIM2全长基因,成功构建pIRES2-EGFP-PDLIM2真核表达载体。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3的构建及在豚鼠耳蜗成纤维细胞中的表达

目的 构建真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3，并观察其在豚鼠耳蜗成纤维细胞中的表达及分布。方法 用RT－PCR法，从人肝脏组织中克隆NT3-cDNA基因，构建真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3并经PCR及EcoR I/Bam H I双酶切鉴定。用脂质体介导的方法，将用真核表达载体IRES2-EGF-NT3瞬时转染豚鼠原代耳蜗成纤维细胞。转染48h后，分别在荧光显微镜下及用免疫组化法观察转染细胞中NT－3的表达。结果 人NT－3 cDNA的PCR产物约为744bp序列测定结果用BLAST软件进行同源性比较，同源性为100％。经Eco R I/Bam H I双酶切证实，NT－3 cDNA已成功地克隆到真核表达载体IRES2-EGFP中。用脂质体介导法，将pIRES2-EGFP-NT3瞬时转染豚鼠原代耳蜗成纤维细胞，在荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的成纤维细胞。NT－3免疫组化染色结果显示，转染NT－3基因的成纤维细胞胞浆呈棕黄色着色；而转染空载体的成纤维细胞免疫组化染色呈阴性。结论 成功地构建真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3并在豚鼠耳蜗原代成纤维细胞中表达，为NT－3基因转染治疗致聋豚鼠耳试验奠定了基础。     

早期B细胞因子3对HepG2细胞周期的影响

目的:克隆人早期B细胞因子3 (EBF3)基因,构建真核表达载体pEGFP/EBF3,研究人EBF3对肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响.方法:提取人胎盘组织总RNA,采用RT-PCR技术克隆人EBF3基因,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1,重组质粒双酶切鉴定,并进行序列测定.将重组质粒转染HepG2细胞,Western blot确证EBF3-EGFP融合蛋白的表达及亚细胞定位,流式细胞术分析转染细胞周期.结果:成功获得全长人EBF3基因,经双酶切和序列测定鉴定,真核表达质粒pEGFP/EBF3构建正确,将pEGFP /EBF3导入HepG2细胞24小时后,在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3-EGFP融合蛋白主要表达于核内.Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24小时和48小时细胞质和细胞核中均检出相对分子质量(Mr)为87 000的EBF3-EGFP融合蛋白.转染pEGFP/EBF3后48小时和72小时,S期细胞比例均明显高于pEGFP-N1转染细胞组,表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展,从而促进细胞增殖.结论:成功构建了真核表达质粒pEGFP/EBF3,pEGFP /EBF3转染组S期细胞比例高于pEGFP-N1转染组,提示EBF3对人肝癌细胞株HepG2细胞有促进增殖作用.     

槲皮素对小鼠体内和体外NIH-3T3细胞的抗氧化作用及其机理

目的 比较槲皮素对小鼠体内和体外H2O2处理前/后的NIH-3T3细胞抗氧化效应的差异并探讨其作用机理。方法 将NIH-3T3细胞分为4组,槲皮素前保护组（Qb）：槲皮素后保护组(Qa)：H2O2组 (H2O2)和对照组(C)。 用试剂盒检测细胞内T-AOC、SOD、GSH-Px、GSH、MDA、NOS和NO2-/NO3-的水平;MTT和TUNEL法检测细胞凋亡率和生存率;免疫印迹和免疫组化技术检测细胞的cyclin D1、PTEN、NF-kB、HSP-70、Bcl-2、Bax、 及caspase-3的表达。另将20只Wistar大鼠等分为对照组和实验组,检测槲皮素灌胃前、后1、2及24h血浆内T-AOC、SOD、GSH-Px、GSH、MDA、NOS和NO2-/NO3-的水平。结果H2O2组细胞凋亡率增高,cyclin D1、PTEN及Bcl-2的表达下调;Bax、HSP-70、NF-kB及caspase-3的表达上调;T-AOC,SOD,GSH-Px及GSH水平降低,NOS、NO2-/NO3-及MDA增高。动物灌胃后1h/2h血浆中T-AOC、SOD、GSH-Px、GSH,NOS及NO2-/NO3-的水平增高,MDA降低;24h后基本恢复。结论 槲皮素在体内外皆可通过调节抗氧化酶体系发挥抗氧化作用,其效应依据H2O2处理与否和处理前/后等细胞的异质性而呈现一定差异。     

携带pcDNA3s与EGFPC3质粒的重组减毒沙门氏菌的免疫性与EGFP的表达

目的研究HBsAg DNA重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的免疫性与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因EGFPC3在小鼠体内的表达。方法将质粒pcDNA3s与pEGFPC3分别电转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/EGFPC3与SL8786/pcDNA3s。利用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)检测小鼠的血清抗体的含量,以及重组菌引起的T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。用荧光显微镜观察EGFPC3表达。结果口服SL8786/p cDNA3s免疫小鼠后,可诱导产生较强的特异性CTL应答。口服免疫小鼠后第11周抗-HBs含量最高。用流式细胞术检测贴壁培养的2只小鼠的脾细胞中SL8786/EGFPC3阳性率分别为19.20%和17.36%,而SL8786/pcDNA3口服的2只小鼠脾细胞中的EGFP阳性率分别仅为1.95%和1.63%。给小鼠口服SL8786/EGFPC33周后,在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠及肌肉等组织中,均有EGFPC3的表达。结论口服SL8786/pcDNA3s在小鼠体内诱导了特异性细胞和体液免疫应答。携带EGFPC3的重组鼠伤寒沙门氏菌SL8786/EGFPC3在小鼠的部分组织中产生绿色荧光表达,该重组菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体基因工程疫苗的研制提供了一个优良模型。     

大肠癌组织中PIK3CA和PIK3CB的表达及意义

目的观察癌基因PIK3CA、PIK3CB在大肠癌组织中的表达及其相互关系,并分析PIK3CA和PIK3CB的表达对大肠癌患者预后的影响。方法采用免疫组化EnVision法染色并结合图像进行分析,探讨PIK3CA和PIK3CB在大肠癌组织及正常大肠黏膜组织中的表达;应用RT-PCR和Western blot技术分别检测PIK3CA mRNA和PIK3CB mRNA及其相应蛋白的表达;回访125例大肠癌术后患者,生存分析用Kaplan-Meier法,生存曲线用Log-Rank检验。结果在300例大肠癌蜡块组织及正常黏膜组织中,PIK3CA表达的平均光密度值分别为:10.087 9±2.148 7、6.937 6±2.065 3,PIK3CB表达的平均光密度值分别为:15.870 6±2.877 7、8.693 2±2.442 4。PIK3CA和PIK3CB在大肠癌组织中的表达具有相关性(r=0.68,P<0.05);RT-PCR检测结果显示,与正常大肠黏膜组织相比,大肠癌组织中PIK3CA mRNA和PIK3CB mRNA的表达水平均明显升高,且二者表达结果呈正相关(r=0.74,P<0.05);Western blot法检测发现PIK3CA和PIK3CB蛋白表达水平同样升高,二者表达结果呈正相关(r=0.71,P<0.05);生存分析显示PIK3CA和PIK3CB高表达与患者死亡风险具有明显相关性。结论 PIK3CA和PIK3CB在大肠癌组织中高表达,与正常黏膜组织中的表达相比差异较明显,且PIK3CA和PIK3CB在大肠癌的发生、发展中具有协同作用,PIK3CA、PIK3CB高表达亦是大肠癌患者预后相关的因素之一。检测大肠癌患者PIK3CA和PIK3CB的表达对于控制大肠癌的进展、确定大肠癌的靶点治疗及判断预后具有重要意义。     

Ezh2、Runx3和caspase-3在子宫内膜样腺癌中的表达及相关性

目的 探讨Ezh2、Runx3和caspase-3在正常子宫内膜、子宫内膜增殖症和子宫内膜样腺癌组织中的表达及相关性.方法 采用组织芯片技术和免疫组织化学SP法检测30例正常子宫内膜组织、30例单纯性增生内膜、30例复杂伴不典型增生内膜、72例子宫内膜样腺癌组织中Ezh2、Runx3和caspase-3蛋白的表达.结果 Ezh2、Runx3和caspase-3蛋白在子宫内膜样腺癌组织中的阳性表达率分别为83.3%(60/72)、26.4%(19/72)、33.3%(24/72);Ezh2在腺癌组织中的阳性率明显高于正常和各型增生内膜(16.7%、33.3%、63.3%;P<0.05),Runx3在腺癌组织中的阳性率明显低于正常和单纯性增生内膜(80.0%、56.7%;P<0.01),caspase-3在腺癌组织中的阳性率明显低于正常和各型增生内膜(86.7%、73.3%、63.3%;P<0.01),差异均有统计学意义.Ezh2和Runx3的阳性表达与组织分级、临床分期和肌层浸润深度均有关(均P<0.05),与淋巴结转移均无关(P>0.05);caspase-3的阳性表达与组织分级有关(P<0.05),而与临床分期、浸润深度及淋巴结转移均无关(P>0.05).Ezh2与Runx3的蛋白表达呈负相关(rs=-0.262,P<0.05).结论 Ezh2、Runx3和caspase-3可能在子宫内膜样腺癌的发生发展过程中发挥重要作用,联合检测其表达可为子宫内膜样腺癌的预后监测及新基因靶点的探寻提供依据.

Abstract：

Objective To investigate the role of the expression of Ezh2, Runx3 and caspase-3 proteins and their correlation in the pathogenesis of endometrial carcinoma. Methods Expression of Ezh2, Runx3 and caspase-3 proteins was examined by tissue microarray technique and immunohistochemistry (SP method) in 72 cases of endometrial adenocarcinomas, 60 endometrial hyperplasia and 30 normal endometrial tissues. Results The positive expression rates of Ezh2, Runx3 and caspase-3 proteins in endometrial adenocarcinomas were 83.3%(60/72), 26.4%(19/72) and 33.3%(24/72), respectively. The positive rate of Ezh2 protein in endometrial carcinomas was higher than that in normal endometrium and endometrial hyperplasia(16.7%, 33.3%, 63.3%;P<0.05). However, the positive rate of Runx3 in endometrial carcinomas was lower than that in normal endometrium and endometrial hyperplasia(80.0%,56.7%; P<0.01). The positive rate of caspase-3 protein in endometrial carcinomas was lower than that in normal endometrium and endometrial hyperplasia(86.7%, 73.3%, 63.3%;P<0.01). Positive expression of Ezh2 and Runx3 was related to the histological grade, FIGO stage, and depth of invasion of endometrial adenocarcinomas(P<0.05), but it was not related to the lymph node metastasis (P>0.05). Positive expression of caspase-3 protein was related to the histological grade(P<0.05), but it was not related to the FIGO stage, depth of invasion and the lymph node metastasis of endometrial adenocarcinomas (P>0.05). The expression of Ezh2 protein was negatively correlated to that of Runx3 (rs=-0.262, P<0.05). Conclusions Abnormal expression of Ezh2, Runx3 and caspase-3 proteins is associated with the development and progression of endometrioid adenocarcinoma. Combined analysis of Ezh2, Runx3 and caspase-3 may offer prognostic information for patients with endometrial cancer.     

pFlag-dlx3载体的构建及在iMDP3中的表达

目的构建真核表达载体p Flag-dlx3,并将其转染成牙本质样细胞株i MDP3,检测外源dlx3基因在i MDP3细胞内的表达。方法提取新生小鼠牙髓总RNA,RT-PCR扩增Dlx3目的基因片段,并将该片段克隆至PCR-TopoⅡ载体中;经鉴定正确后目的基因与表达载体p Flag-CMV连接;Lipofectamin 2000介导重组质粒p Flag-dlx3转染i MDP3;Western-blot鉴定外源性dlx3在细胞内的表达。结果重组p Flag-dlx3质粒经酶切、测序鉴定正确;i MDP3细胞内检测到外源dlx3蛋白的表达;转染p Flag-dlx3组dlx3蛋白的表达量显著高于正常组。结论成功构建真核表达载体p Flag-dlx3,且外源dlx3基因可在i MDP3细胞内过表达。