壳聚糖纳米粒作为基因治疗载体的研究进展

20 0 3年底 ,首个基因治疗药物—重组人P5 3腺病毒注射液[1～ 3 ] 在我国批准临床应用 ,标志着基因治疗进入了新时代。在基因治疗三要素 :目的基因、表达载体、递送载体中 ,递送载体的构建和改进 ,一直是基因治疗研究的重点。基因递送载体有病毒载体和非病毒载体。前者作为一种     

腺病毒载体，最有潜力的心血管疾病治疗载体？

心血管疾病在当今社会仍有很高的死亡率,基因治疗的可行性在不断探索。腺病毒载体可高效实现心血管内基因转移,但其组织特异性和免疫原性限制了其应用。近年来腺病毒载体不断发展,涌现的第三代腺病毒载体成为极有潜力的理想基因治疗转导载体。本文综述腺病毒载体的性质、优点及发展过程,在心血管疾病中的具体应用,总结目前应用中的障碍和改进策略。     

腺病毒及其研究进展

本文从腺病毒的分类、结构和受体等方面对腺病毒进行了介绍,同时对腺病毒的感染和致病性做了综述,并进一步介绍了抗腺病毒治疗研究进展和腺病毒载体的应用.对腺病毒多方面进行较全面的了解,有助于促进抗腺病毒药物的研发和加强腺病毒载体在基因治疗中得到更好的应用.     

第三代腺病毒载体的改良与应用

腺病毒载体是一种非常有效的转基因载体,具有高效率、低致病性、高滴度及不整合入宿主细胞染色体等优点,广泛应用于基因治疗.第一、二代腺病毒载体仍有许多不足之处,在其基础上发展了第三代腺病毒载体.第三代腺病毒载体与前者相比,具有低免疫原性及高容量等优点,在基因治疗中表现出独特优势.然而,由于辅助病毒污染的存在及病毒产量有待提高,第三代腺病毒载体的临床应用仍面临一定困难.     

腺病毒载体在肿瘤靶向性治疗中应用的研究进展

肿瘤已经成为威胁人类健康和生命的重大疾病之一，有效地治疗肿瘤是当前医学研究的迫切任务。基因治疗在肿瘤治疗中的应用正在快速发展。肿瘤基因治疗常用的病毒载体有腺病毒载体、逆转录病毒载体及腺病毒相关病毒载体。腺病毒在体内能有效地感染肿瘤细胞，已经在肿瘤的基因治疗研究与实践中显示出了较好的应用前景，本文对其研究进展综述如下。[第一段]     

重组腺病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用

腺病毒载体转导目的基因具有效率高、滴度高、在体内不与宿主细胞染色体整合等优点,使腺病毒载体在肿瘤的基因治疗研究与实践方面得以广泛运用。本文就三代腺病毒载体的构建与改进,腺病毒载体介导的肿瘤基因治疗策略及其应用进展进行了简要地综述,并讨论了在肿瘤基因治疗中仍需解决的安全问题和面临的挑战。     

腺病毒载体的新进展和在生物镇痛中的应用

慢性疼痛的治疗在药物研究方面尚未取得明显突破。多年的实验证实,转基因细胞移植镇痛具有广阔的发展前景及潜在的巨大优势。载体是这项生物技术的核心,其发展与完善直接促进了生物镇痛的研究进展。近几年,作为载体重要分支之一的病毒载体技术更新较快,尤其是腺病毒载体的研究,有了重大突破,被广泛应用于基因治疗领域,取得较大成果。本文在总结腺病毒载体研究所取得的进展的基础上,对腺病毒载体应用于靶向性转基因细胞镇痛的近况做一综述。     

肿瘤基因治疗的病毒载体研究进展

肿瘤基因治疗是通过载体将遗传物质转移入宿主细胞,使肿瘤细胞凋亡,包括原发瘤和转移瘤。目前,应用于肿瘤基因治疗的载体分为病毒载体和非病毒载体,病毒载体的转移效率高,其中腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、反转录病毒载体和疱疹病毒载体等已广泛应用于基础研究和临床试验。     

腺病毒载体的研究进展

近年来,随着基因治疗和重组疫苗研究的深入,作为其基础的载体的研究有了突飞猛进的发展.腺病毒载体是目前基因治疗中应用最广泛的一种病毒载体[1],本文就腺病毒载体的研究进展作一综述.     

新型腺病毒载体的制备及其特性研究

目的：本研究在普通腺病毒载体（Adv）纤毛头节区插入了具有整合素特异性的RGD肽,制备了一种新型RGD-Adv,以克服Adv基因转导的柯萨奇腺病毒受体依赖性.方法：用体外连接法构建RGD-Adv,并考察其基因转效率、稳定性及体外、体内毒性.结果：RGD-Adv可有效地实现向受试细胞转导基因,其转导能力随病毒量的增加而加强.结论：具有av亲和性的RGD-Adv是一种安全高效的新型腺病毒载体,将在基因治疗及实验研究中发挥重要作用.     

基因药物呼吸道给药载体的发展

基因药物的呼吸道给药是基因治疗的主要途径之一.基因药物呼吸道给药系统由基因药物、基因载体和吸入装置组成.基因载体具有保护基因药物以及协助基因药物发挥作用等功能,分为病毒载体和非病毒载体两类.病毒载体由于不良反应较重,使用不广泛.阳离子脂质是最早用于基因药物呼吸道给药的非病毒载体,后被阳离子聚合物取代.聚乙烯亚胺是目前研究最多的阳离子聚合物载体,有良好的介导基因药物给药能力.新一代阳离子聚合物载体聚酯胺具有广阔的应用前景.     

Updates on current advances in gene therapy

Gene therapy is the attempt to treat diseases by means of genetic manipulation. Numerous challenges remain to be overcome before it becomes available as a safe and effective treatment option. Retroviruses and adenoviruses are among the most commonly used viral vectors in trials. The retrovirus introduces the gene it carries into the target cell genome while the adenovirus introduces the gene into the target cell nucleus without incorporating it into the target cell genome. Other viral vectors such as adeno-associated viruses, pseudotyped viruses and herpes simplex viruses, are also gaining popularity. Proposed non-viral methods for gene transfer include physical methods and the employment of chemical vectors (lipoplexes, polyplexes and inorganic nanoparticles). Recent studies have investigated potential applications of gene therapy in correcting genetic diseases, treating malignant disorders and for treatment of other diseases. Trials on gene therapy for SCID and Leber's congenital amaurosis have achieved considerable success, but the widely publicized adverse reaction in X-linked SCID patient receiving gene therapy raised concerns for safety profile of gene therapy. For that, several methods of improving safety and efficacy of gene therapy have been proposed. At present, the three main gene therapy strategies for treatment of cancer are application to oncolytic viruses, suicide-gene therapy and gene-based immunotherapy. Gendicine, the first approved anticancer drugs based on the use of gene therapy principle, is based on the use of oncolytic viruses. More evidence for wider clinical applications of gene therapy are expected as more gene therapy studies progress from the preclinical phase to clinical trial.     

基因药物呼吸道给药载体的发展

基因药物的呼吸道给药是基因治疗的主要途径之一。基因药物呼吸道给药系统由基因药物、基因载体和吸入装置组成。基因载体具有保护基因药物以及协助基因药物发挥作用等功能,分为病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体由于不良反应较重,使用不广泛。阳离子脂质是最早用于基因药物呼吸道给药的非病毒载体,后被阳离子聚合物取代。聚乙烯亚胺是目前研究最多的阳离子聚合物载体,有良好的介导基因药物给药能力。新一代阳离子聚合物载体聚酯胺具有广阔的应用前景。     

腺病毒介导酪氨酸羟化酶基因体外治疗大鼠泌乳素瘤

目的 探讨腺病毒介导酪氨酸羟化酶(TH)基因治疗大鼠垂体泌乳素(PRL)瘤的可能性。方法 应用细攻内同源重组法构建携带大鼠TH基因并含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的复制缺陷型腺病毒载体Ad—GFP—TH和末携带任何外源基因的复制缺陷型空载体腺病毒Ad—GFP,并以大鼠泌乳素瘤细胞株MMQ为靶细胞,探讨腺病毒介导TH基因治疗对MMQ细胞生长和PRL分泌的影响。结果 成功构建重组腺病毒Ad—GFP—TH及Ad—GFP;转染重组腺病毒Ad—GFP—TH后,MMQ细胞的生长和PRL分泌均受到明显的抑制。结论 基因治疗可能成为垂体泌乳素瘤,尤其是侵袭性垂体泌乳素瘤的有效治疗方法之一。     

广东省艾滋病免费抗病毒治疗维持状况调查

目的：调查广东省艾滋病免费抗病毒治疗的维持状况,探讨影响病人治疗维持时间的因素。方法：利用国家统一的成人DataFax抗病毒治疗信息数据库,收集全省1307名接受抗病毒治疗病人的资料,采用COX比例风险模型,对影响抗病毒治疗的维持时间之因素进行分析。结果：2004年10月至2008年5月全省共免费治疗1307名病人,其中66．7％病人在出现艾滋病相关症状后才被检测出HIV阳性;52．3％开始治疗时已经进入临床Ⅲ期;29．9％进入了临床Ⅳ期。88．2％的人开始治疗时CD4^＋T细胞低于200个／μL;结束治疗病人中,88．9％维持治疗时间小于1年,维持治疗时间最长的达到3年,影响病人维持治疗时间的主要因素是漏服次数、更换方案次数、治疗开始时CD4^＋T细胞水平、静脉吸毒感染。结论：应采取措施尽量延长病人治疗时间,加强对患者特别是静脉吸毒者的服药依从性教育,及时监测病人的服药情况,必要时及时调整方案。     

腺病毒介导外源基因转染大鼠胰岛移植物的实验研究

目的探讨携带外源基因的腺病毒在体外有效感染大鼠胰岛及外源基因在胰岛中的表达。方法用携带人血红素氧合酶-1基因(hHO-1)及绿色荧光蛋白基因(GFP)的腺病毒在体外以不同MOI感染大鼠胰岛,荧光显微镜观察GFP的表达及Western检测hHO-1蛋白来确定转染结果,并观察外源基因表达持续的时间。结果腺病毒载体在体外能将外源基因有效转入到大鼠胰岛细胞,转染的基因能稳定表达。结论腺病毒载体在体外可以有效感染大鼠胰岛,为基因修饰胰岛移植物以提高胰岛移植效果奠定了实验基础。     

含CYP2E1基因的重组腺病毒载体转染人骨髓间充质干细胞联合达卡巴嗪的抗肿瘤效应

目的 构建含人细胞色素P-450 CYP2E1(CYP2E1)基因的缺陷型重组腺病毒载体,检测其协同化疗药物的抗肿瘤效应,为基因介导酶前药治疗提供新的思路.方法 克隆人肝CYP2E1全长cDNA,制备高滴度的重组腺病毒颗粒(1.2×1012 pfu/ml).分离、培养、传代纯化及鉴定人骨髓间充质干细胞(BMSC).用Transwell小室检测BMSC向肿瘤细胞的趋化迁移.将重组腺病毒分别转染BMSC和人黑色素瘤细胞A375细胞.荧光显微镜和RT-PCR、Western印迹法分别检测转基因细胞中外源增强绿色荧光蛋白(EGFP)、CYP2E1的表达.倒置显微镜、四甲基偶氮唑盐(MTT)和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)双染色法检测CYP2E1协同酶前药达卡巴嗪(DTIC)的抗肿瘤效应(实验分A375-CYP2E1组、BMSC-CYP2E1组和BMSC-CYP2E1+A375组,并以各自空载体组作为对照;细胞接种后分别加入不同浓度DTIC).结果 成功构建重组腺病毒载体pAd5CMV-NpA-CYP2E1和pAd5CMV-NpA-EGFP.成功分离BMSC,并证明BMSC可通过聚碳酸酯膜分别向下室内的K562和A375细胞迁移.荧光显微镜检测到转基因靶细胞EGFP表达,RT-PCR和Western印迹法均检测到目的基因在转基因细胞中高表达.倒置显微镜下见加入DTIC后BMSCCYP2E1+A375组的死亡细胞明显多于对照组.MTT法示DTIC呈浓度依赖性抑制转CYP2E1基因的细胞生长,其中BMSC-CYP2E1+A375组药物半数抑制量(IC50)值为(0.17±0.13)mmol/L,其对照组为(0.65±0.20)mmol/L,二者差异有统计学意义(P＜0.01),可选0.05 mmol/L DTIC浓度作人BMSC的相对安全浓度.Annexin V/PI法示0.05 mmol/L DTIC处理细胞48 h后BMSC-CYP2E1+A375组细胞凋亡率明显高于其对照组(26.8±2.0比8.7±1.3,P＜0.01).结论 BMSC体外具有向肿瘤细胞趋化迁移的特性.重组腺病毒载体介导的CYP2E1转染BMSC具有协同化疗前药的抗肿瘤效应.     

sCD40LIg重组腺病毒载体的构建鉴定和体外表达

目的构建含有分泌型人胞外区CD40L融合蛋白(sCD40LIg)基因的重组腺病毒载体,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础.方法分别以质粒pAdCTLA4Ig和pGEM-T-easy-sCD40L为模板,通过PCR扩增获得人源IgGFc和sCD40L基因全部序列.分别回收用连接酶连接,以连接产物为模板PCR,获得sCD40LIg基因全部序列,插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV的启动子下游BglⅡ及XhoⅠ位点之间,获得重组质粒pAdTrack-sCD40LIg.将正确重组体pAdTrack-sCD40LIg转化含腺病毒骨架质粒的pAdEasy-1-BJ5183细菌行同源重组.提取重组成功质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因,Western blot分析蛋白表达等方法鉴定重组的腺病毒.结果成功构建了含有sCD40LIg基因的重组腺病毒并在体外表达.结论该重组腺病毒的构建为下一步研究其在哺乳动物细胞内表达及在移植排斥的基因治疗中的作用提供了一定的基础.