EGCG对鼻咽癌细胞株CNE-2及相关基因表达的影响

目的:研究EGCG对鼻咽癌细胞系CNE-2的增殖与凋亡作用,探讨其对细胞增殖与凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响。方法:应用MTT实验、流式细胞仪检测细胞的增殖与周期;Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡;RT-PCR检测Bcl-2、Bax、Caspase-3表达。结果:EGCG明显抑制CNE-2细胞的增殖,诱导其凋亡,该作用具有剂量-效应关系。EGCG抑制CNE-2细胞Bcl-2表达,诱导CNE-2细胞Bax、Caspase-3表达。结论:EGCG在体外具有抗鼻咽癌细胞的作用,此作用可能是通过调节细胞增殖与凋亡基因的表达实现的。     

蛇床子素对人鼻咽癌细胞CNE2细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨蛇床子素对人鼻咽癌CNE2细胞增殖及凋亡的影响，寻找鼻咽癌综合治疗的新思路。方法  以蛇床子素不同梯度浓度处理CNE2细胞，采用MTT法检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡，RT-PCR和Western blot分别测定Bax、Bcl-2mRNA和蛋白的表达水平。结果　蛇床子素处理CNE2细胞24、48、72 h对细胞增殖均有不同程度抑制作用，且呈时间、剂量依赖性（P <0.05）。蛇床子素干预CNE2细胞48 h后，流式细胞术结果表明细胞凋亡率显著升高（P <0.01），RT-PCR与Western blot检测提示Bax mRNA、蛋白表达显著增加，而Bcl-2 mRNA及蛋白明显下调（P <0.01），均呈浓度依赖性。结论　蛇床子素对CNE2细胞具有抑制增殖和促进凋亡的生物学效应。     

苦参碱对人鼻咽癌CNE2细胞的生长抑制作用及凋亡相关基因Caspase表达的研究

目的：观察苦参碱对人鼻咽癌CNE2细胞的生长抑制及对凋亡相关基因Caspase-3 mRNA及Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白表达的影响,探讨苦参碱抑制人鼻咽癌细胞增殖和诱导其凋亡的机制。方法：采用MTT法检测不同浓度（0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00g/L）苦参碱对CNE2细胞增殖的影响;采用荧光PCR法检测不同浓度（0、0.75、1.00、1.50g/L）苦参碱处理48h后Caspase-3mRNA的变化;Western Blot检测Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白的变化情况。结果：苦参碱对CNE2细胞具有明显的抑制作用,呈浓度依赖性;能上调CNE2细胞Caspase-3mRNA和Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的表达,且呈浓度依赖性。结论：苦参碱能抑制CNE2细胞的生长,呈浓度依赖性。其作用与上调CNE2细胞Caspase-3mRNA和Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的表达,启动Caspase级联反应密切相关。     

Ad．RGD—ING4对人鼻咽癌细胞CNE抑癌增效及其机制的研究

目的：研究带RGD的腺病毒介导的ING4对人鼻咽癌细胞CNE生长、凋亡及细胞周期的影响并探讨其可能调节机制。方法：以Ad．RGD-ING4及腺病毒空载体感染CNE细胞,RT—PCR法检测ING4基因的表达水平,Westernblot法检测目的蛋白的表达。用MTT试验检测ING4对CNE细胞生长情况的影响,用AnnexinV—PE／7一AAD双染色测定ING4对CNE细胞凋亡的影响,用PI单染色检测ING4对CNE细胞细胞周期的影响。RT—PCR检测p21、Bcl-2、Bax基因的表达水平的差异,Westernblot法检测Survivin蛋白、Cleaved—caspase3蛋白表达的差异。结果：CNE细胞感染Ad．RGD-ING472h后,ING4在CNE细胞中过表达,CNE细胞的生长受到明显抑制,细胞凋亡率明显升高,G2／M期出现明显阻滞。RT-PCR结果显示,感染Ad．RGD-ING4的CNE细胞中Bcl-2表达下降,p21、Bax表达升高,差异具有统计学意义（均P〈0．01）。Westernblot结果显示Survivin蛋白表达下降,Cleaved—caspase3蛋白表达升高。结论：Ad．RGD-ING4可以对鼻咽癌细胞株CNE的起到抑癌增效作用,这一作用可能是通过下调Bcl-2、Survivin表达及上调p21、Bax、caspase3实现的。     

亚砷酸联合LY294002对人鼻咽癌CNE细胞的抑制作用

目的　探讨亚砷酸（As2O3）联合PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对人鼻咽癌细胞株CNE（简称CNE细胞）的抑制作用。方法　应用MTT法检测CNE细 胞对As2O3和LY294002的敏感性,Western blot方法检测p-PTEN、p-AktSer473、p-AktThr308、p-PDK1等信号分子的表达水平。结果　As2O3与LY294002均可显著抑制CNE细胞的生长,而且该作用呈现明显的剂量依赖性和时间依赖性。As2O3与LY294002的联合应用对CNE细胞生长的抑制作用具有协同效应。LY294002（10 μmol/L）处理4 h即可使CNE细胞内p-AktSer473、p-AktThr308、p-PDK1蛋白表达下调,p-PTEN蛋白表达上调。As2O3（4 μmol/L）单独作用12 h后,CNE细胞内蛋白p-AktSer473表达下调,p-AktThr308、p-PDK1、p-PTEN蛋白变化不明显。LY294002（10 μmol/L）与As2O3（4 μmol/L）联合处理12 h,CNE细胞内p-AktSer473、p-AktThr308、p-PDK1等信号分子的下调水平与p-PTEN蛋白的上调强度显著强于LY294002或As2O3的单独作用。结论　As2O3联合LY294002对CNE细胞具有协同杀伤作用。     

EGCG对鼻咽癌细胞增殖抑制和凋亡诱导时NF-κB和caspase-3的表达变化

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）作用于鼻咽癌CNE-2细胞后,对转录因子NF-κB和凋亡效应酶caspase-3表达的影响,以及这两个基因的表达与鼻咽癌细胞凋亡和增殖的关联性。方法体外培养鼻咽癌细胞CNE-2,MTT法检测细胞增殖的抑制作用;Hoechst染色检测细胞凋亡;流式细胞仪分析细胞周期的改变。RT-PCR检测NF-κB和caspase-3的表达。结果EGCG能明显的抑制鼻咽癌细胞增殖,诱导其凋亡,并表现为浓度依赖性：流式分析显示,EGCG干预鼻咽癌细胞CNE-2在48小时后,细胞被阻滞于G1期。80mg/L EGCG处理鼻咽癌细胞24小时和48小时后,均能下调NF-κB表达,上调caspase-3表达。结论EGCG可能通过抑制NF-κB和诱导caspase-3的表达来发挥其抗鼻咽癌细胞的生物学作用。     

线粒体参与荛花酚诱导人鼻咽癌CNE细胞凋亡机制

目的探讨荛花酚诱导人鼻咽癌CNE细胞(简称CNE细胞)凋亡的效应,初步探索其与线粒体相互作用的机制。方法以不同浓度的荛花酚作用于CNE细胞,MTT检测分析荛花酚对细胞增殖的影响,Annexin V/PI双标后流式细胞仪检测凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白(caspase-3、caspase-9、PARP、细胞色素C、Bax、Bcl-2)的表达。JC-1染色检测线粒体膜电位,DCFH-DA染色检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成。结果荛花酚以时间和剂量依赖性方式抑制CNE细胞的增殖,荛花酚处理诱导CNE细胞发生明显凋亡,Bax/Bcl-2比值增加,细胞色素C从线粒体释放到胞浆,caspase-3和caspase-9活化,PARP发生剪切。荛花酚还可诱导CNE细胞线粒体膜电位下降,线粒体膜通透转运孔(PTP)开放,ROS含量升高。结论荛花酚可显著诱导CNE细胞的凋亡,机理与影响线粒体功能密切相关。     

Cyclin D1在EGCG抗鼻咽癌中表达的变化及意义

目的：探讨Cyclin D1基因在表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）抗鼻咽癌中表达的变化及意义,揭示EGCG的抗鼻咽癌作用机制。方法：体外培养低分化鼻咽癌细胞株CNE-2并以不同浓度EGCG处理,倒置显微镜下观察不同浓度EGCG作用48h后CNE-2细胞的形态变化,采用MTT比色法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞周期,半定量逆转录PCR检测细胞中Cyclin D1mRNA的表达变化。结果：EGCG处理后,CNE-2细胞的数量及密度逐渐降低,分裂象减少,贴壁差,部分细胞变圆且体积变小,漂浮及凋亡细胞不断增多;细胞增殖明显受到抑制,CNE-2细胞被阻滞在G0/G1期,呈时间和剂量依赖性（P〈0.05）;Cyclin D1mRNA表达明显下调,且EGCG作用浓度与时间依赖性（P〈0.05）。结论：EGCG抑制CNE-2细胞的增殖,可能与其呈浓度与时间依赖性下调Cyclin D1mRNA的表达相关。     

鼻咽癌干细胞增殖特征及细胞周期相关蛋白表达水平研究

目的　研究鼻咽癌干细胞的增殖特征并初步探讨其分子机制。方法　采用无血清悬浮培养法从鼻咽癌细胞CNE2和5-8F获得鼻咽癌干细胞CNE2-SC、5-8F-SC,分别采用细胞存活率分析计数器、细胞平板克隆形成试验观察鼻咽癌干细胞的增殖特性和克隆形成能力,Western blot法检测细胞周期相关蛋白表达水平。结果　鼻咽癌干细胞比其来源的鼻咽癌细胞增殖速度显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。鼻咽癌干细胞克隆形成率显著高于其来源鼻咽癌细胞（P＜0.01）,但肿瘤干细胞克隆显著小于其来源细胞。与普通鼻咽癌细胞比较,鼻咽癌干细胞的细胞周期蛋白CylinD1、CylinD3及细胞周期调控蛋白CDK2、CDK4、CDK6的表达水平显著下调（P＜0.01）。结论　鼻咽癌干细胞比其来源的鼻咽癌细胞生长增殖缓慢,可能与其细胞周期蛋白和周期蛋白依赖激酶表达水平下调有关。     

短发夹RNA抑制hTERT基因对鼻咽癌细胞端粒酶活性及PCNA和Caspase-3蛋白表达的影响

目的:研究靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹RNA(shRNA)对鼻咽癌细胞系(CNE)端粒酶活性及PCNA、Caspase-3蛋白表达的影响.方法:构建表达靶向hTERT mRNA特异的shRNA的质粒pEGFP-shTERT.将pEGFP-shTERT转染CNE细胞,TRAP PCR-ELISA法检测端粒酶活性,MTT法测定细胞增殖活性,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blotting检测蛋白表达.结果:pEGFP-shTERT成功转染入CNE细胞后, 端粒酶活性显著下降;细胞增殖活性明显受抑制;大量细胞凋亡;处理后24及48 h,PCNA蛋白下调至64.41%、58.67%(P<0.05),Caspase-3上调到1.55、1.60倍(P<0.05).结论:shRNA靶向抑制hTERT基因在鼻咽癌CNE细胞系中的表达,能显著地抑制细胞的端粒酶活性,调节PCNA和Caspase-3蛋白表达,从而抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡.端粒酶、PCNA和Caspase-3共同参与了鼻咽癌的发生、发展过程.     

EGCG对鼻咽癌细胞株裸鼠移植瘤的放疗增敏作用以及对Survivin表达的影响

目的研究凋亡抑制基因Survivin的表达与EGCG对鼻咽癌CNE 2裸鼠移植瘤放疗增敏作用的关系。方法将低分化鼻咽癌细胞CNE 2接种于4～6周龄的雌性裸鼠皮下,待移植瘤生长至4～6?mm时,随机分为4组,分别采用NS、EGCG［50?mg/(kg·w）］、放疗（15?Gy）、EGCG给药24?h后再行放疗等方法分别处理各组裸鼠,处理前后分别测量裸鼠移植瘤的短径、体积。21?d后处死裸鼠,取出肿瘤并称重,将肿瘤组织分成两份,分别用来进行病理切片TUNEL染色以及RT PCR检测Survivin mRNR的表达。结果EGCG＋放疗对裸鼠移植瘤的生长抑制最为明显,肿瘤生长抑制率为89.3%,消退率为40.0％。与对照组EGCG组、放疗组相比,EGCG＋放疗组的凋亡指数均明显增加（P＜0.05),同时,伴有Survivin mRNR的表达显著下降（P＜0.05）。结论EGCG对鼻咽癌裸鼠移植瘤可能具有放疗增敏作用,这种作用可能与凋亡抑制基因Survivin的表达下调有关。     

肿节风对鼻咽癌裸鼠移植瘤凋亡和端粒酶活性的影响

目的:评价肿节风提取物诱导鼻咽癌裸鼠移植瘤细胞凋亡作用和抑制端粒酶活性的能力。方法:将移植人鼻咽癌CNE1、CNE2细胞的裸鼠随机分为肿节风组、环磷酰胺组和对照组,定期检测裸鼠的体重及肿瘤体积,给药一个疗程(30d)后解剖获取肿瘤组织,称量瘤体重量,计算抑瘤率。运用透射电镜观察瘤组织细胞超微结构的改变;免疫组织化学法检测瘤组织Bcl-2和Bax的表达;流式细胞仪进行细胞周期、细胞凋亡分析;TUNEL法检测细胞凋亡;TRAP-ELISA方法观察药物处理前后组织端粒酶活性的变化。结果:动物实验表明,肿节风对CNE1、CNE2移植瘤有明显的抑瘤作用,抑瘤率分别为40.8%和46.8%(与对照组比较P<0.01);且Bcl-2蛋白表达明显低于对照组(P<0.01),而Bax蛋白表达明显高于对照组(P<0.01);电镜下肿节风组瘤组织中可见较多典型的凋亡形态学改变;TUNEL法肿节风组凋亡指数明显高于对照组(P<0.01);流式细胞技术显示肿节风组G0/G1期细胞高于对照组(P<0.01),细胞阻滞在G0/G1期,凋亡率明显高于对照组(P<0.01);端粒酶活性检测中可见肿节风组比对照组端粒酶活性降低(P<0.01)。结论:肿节风在体内具有抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的作用,其抑瘤作用机制与诱导凋亡有关,抑制端粒酶活性可能起部分作用。     

bcl-xs增加鼻咽癌细胞对喜树碱诱导凋亡敏感性的实验研究

目的 :研究 bcl- xs 基因对喜树碱 (CPT)诱导鼻咽癌 CNE- 2 Z细胞凋亡的影响。方法 :利用脂质体L ipofect Amine将含有人 bcl- xs基因的重组真核表达质粒 pc DNA3xs导入人鼻咽癌低分化上皮细胞株 CNE- 2 Z,G418筛选培养后 ,经 Western blot检测 bcl- xs的表达。以不含有 bcl- xs基因的 pc DNA3质粒转染 CNE- 2 Z作为对照细胞。喜树碱处理两种细胞一定时间后 ,通过激光流式细胞仪检测凋亡细胞百分比。结果 :Western blot检测证实获得稳定表达 bcl-xs的细胞 ,经过 0 .5μmol/L ,1.0μmol/L CPT处理 2 4小时后 ,激光流式细胞仪检测的凋亡峰值均高于对照细胞。结论 :bcl- xs能显著增加鼻咽癌 CNE- 2 Z细胞对喜树碱诱导凋亡的敏感性     

Hsa-miR-15a/16-1靶向抑制Bcl-2基因对鼻咽癌CNE-2细胞的抑制作用

目的观察Hsa-miR-15a/16-1靶向抑制B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma gene 2,Bcl-2gene）表达对鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）CNE-2细胞的生长抑制作用。方法将构建成功的重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-15a/16-1经Lipofectamine 2000转染CNE-2细胞,RT-qPCR检测miR-15a/16-1、Bcl-2 mRNA表达水平,流式细胞术和WesternBlot检测Bcl-2、caspase-3蛋白表达水平,CCK-8法分析细胞生长抑制情况,4,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色观察细胞凋亡状况。结果转染后miR-15a表达增高（F=547.525,P均〈0.001）;miR-16-1表达增高（F=99.979,P均〈0.001）;Bcl-2 mRNA表达无明显差别（F=0.220,P〉0.05）;Bcl-2蛋白表达下调,caspase-3蛋白表达增高;细胞在体外凋亡明显;细胞增殖受到抑制,作用呈明显的时效关系。结论 Hsa-miR-15a/16-1对Bcl-2基因的靶向抑制,可体外对CNE-2细胞产生增殖抑制和促进凋亡作用。