年龄相关听力损失BALB／c小鼠耳蜗形态学观察

目的 探讨年龄相关听力损失小鼠耳蜗毛细胞形态学变化,建立年龄相关听力损失动物模型.方法 分别取3、6、12、18月龄BALB/c小鼠测定其听性脑干反应(ABR)阈值,应用耳蜗铺片和扫描电镜技术,观察不同月龄鼠耳蜗毛细胞计数和形态的变化.结果 3、6、12月龄鼠8 kHz ABR反应阈分别为(24.8±5.1)、(51.5±6.7)和(92.5±7.5)dB SPL.18月龄组120 dB SPL刺激声无诱发反应.耳蜗铺片毛细胞计数自6月龄组外毛细胞出现显著缺失,随月龄增加而加重,由底回逐渐向顶回发展,至12月龄时耳蜗底回和中回外毛细胞几乎完全丧失,内毛细胞显著缺失.扫描电镜显示6月龄组小鼠耳蜗毛细胞静纤毛可见不同程度的缺失、转位、散乱、倒伏、融合、变短现象,随月龄增加而逐渐加重.结论 BALB/c小鼠听力损失、耳蜗毛细胞缺失和纤毛损害随年龄增加而逐渐加重,可作为年龄相关听力损失研究的合适动物模型     

中药健耳Ⅱ号胶囊对抗C57BL/6J小鼠老年性耳蜗损害的实验研究

目的 观察中药健耳Ⅱ号胶囊是否对C57小鼠老年性耳蜗损害具有保护作用。方法 选择刚出生的C57BL／6J小鼠40只，随机平均分为对照组、中药组各20只，其中对照组小鼠为常规饲料喂养，分别在出生后2．4和7个月终止实验；中药组小鼠常规饲料喂养至出生后2个月时开始饮用健耳Ⅱ号胶囊溶液以代替日常饮水，至7月龄时终止实验。取出小鼠耳蜗分别制成耳蜗铺片和耳蜗切片，在光学显微镜下定量观察并比较两组小鼠耳蜗毛细胞的密度和疆孔内的神经纤维数量以及螺旋神经节密度。结果 对照组C57BL／6J小鼠随着月龄的递增出现耳蜗毛细胞损伤加重的趋势，且这种随着年龄增长而发生的耳蜗损害遵循着从底回逐渐向顶回发展的规律，外毛细胞的损害比同区域的内毛细胞严重。7月龄对照组动物的耳蜗毛细胞损害范围比较广泛，底回螺旋神经节细胞数量明显减少，存活神经元细胞亦呈现异常的形态学改变，同时疆孔内的神经纤维数量也有所减少。但在中药组小鼠，无论是耳蜗毛细胞的数量还是疆孔内的神经纤维数量，以及蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞密度均比对照组动物的损害轻。经统计学分析，两组动物耳蜗底回的螺旋神经节细胞密度和底回疆孔内的神经纤维数量差异均有统计学意义（P〈0．001，P〈0．05）。结论 ①C57BL／6J小鼠在出生后4个月即开始发生耳蜗进行性损害，可作为研究老年性聋的理想动物模型；②鉴于在老年性耳蜗损害的早期可见毛细胞和螺旋神经节均有损害，提示老年性耳蜗损害可能是同时发生在听觉神经元；③中药健耳Ⅱ号胶囊不但可以延缓C57BL／6J小鼠随着年龄增长而发生的耳蜗毛细胞损坏，而且对于听觉神经元和听神经纤维也具有一定的保护作用。     

单次不同放射线剂量和时间对Balb/c小鼠耳蜗显微和超微结构的影响

目的：观察单次不同放射剂量及时间对Balb／c小鼠耳蜗显微和超微结构的影响,探讨放射线所致感音神经性聋机制的形态学依据。方法：将16只健康Balb／c小鼠随机分成4组（对照组和3个实验组,每组4只）,实验组分别给予8、12、16Gy剂量的放射线照射,在照射后第3、7天处死小鼠,取耳蜗标本后行石蜡包埋、组织切片及苏木精-伊红染色,每组取耳蜗标本行扫描电镜观察。结果：扫描电镜观察发现,对照组内毛细胞及外毛细胞排列整齐,无倒伏、紊乱及缺失;各放射组内毛细胞出现轻微倒伏及排列紊乱,外毛细胞偶有缺失。苏木精-伊红染色结果示各放射组耳蜗内毛细胞、外毛细胞、血管纹细胞及支持细胞在照射后第3、7天与对照组比较未出现明显病理形态学异常。结论：在一次给予≤16Gy放射剂量照射后早期小鼠耳蜗形态仅有轻微改变。     

B细胞淋巴瘤-2蛋白在年龄相关性聋小鼠耳蜗中的表达

目的　了解B 细胞淋巴瘤- 2（B c e l l lymphoma-2,Bcl-2）在不同年龄段年龄相关性小鼠内耳中的表达量及部位的差异,为后续研究Bcl-2信号通路做准备。方法　采用听性脑干反应（ABR）行听力水平测试,耳蜗基底膜铺片行毛细胞形态,数量观察,实时荧光定量、免疫荧光组织化学法和蛋白质印迹分析进行不同年龄段（“年轻”组、“老年”组）C57BL/6小鼠耳蜗Bcl-2在mRNA和蛋白表达水平检测。结果　ABR两组比较,老年组小鼠平均阈值均高于年轻组,各频率差异均有统计学意义。耳蜗基底膜铺片两组比较,老年组耳蜗底转毛细胞排列紊乱且部分缺失,螺旋神经节细胞稀疏,排列凌乱。实时荧光定量结果提示Bcl-2在mRNA水平“老年”鼠耳蜗表达降低。免疫荧光组织化学法和蛋白质印迹分析提示Bcl-2在蛋白水平“老年”鼠耳蜗表达降低,且Bcl-2表达位于胞浆,内毛细胞表达高于外毛细胞。结论　Bcl-2在“老年”鼠耳蜗表达降低,且Bcl-2表达降低与耳蜗毛细胞缺失、听力下降可能具有相关性。     

腱糖蛋白-W在不同发育阶段C57BL/6小鼠耳蜗中的表达

目的研究Tnn基因编码的腱糖蛋白-W(tenascin-W,TN-W)在出生后不同发育阶段小鼠耳蜗内的表达,初步探讨tenascin-W在听觉系统中的功能。方法以出生后(postnatal day,P)1、3、14、28天(P1、P3、P14、P28)各6只及出生后7天(P7)9只C57BL/6小鼠作为研究对象,通过免疫荧光标记观察tenascin-W在耳蜗中的表达及定位,运用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测各发育阶段小鼠耳蜗中Tnn mRNA相对表达水平,Western blot法检测tenascin-W在小鼠耳蜗中的表达。结果免疫荧光标记显示tenascin-W在P1、P3、P7、P14、P28小鼠耳蜗中均有表达。在P1、P3、P7小鼠耳蜗螺旋神经节、Corti器中均有表达,在P14、P28小鼠仅在螺旋神经节高表达,在Corti器中不表达,在各发育阶段小鼠耳蜗血管纹均有表达;共染显示其与Ⅲ型β-tubulin共定位在螺旋神经节神经元胞体的胞浆中。RT-qPCR显示Tnn mRNA在P7小鼠耳蜗相对表达量最高,Western blot法检测到tenascin-W在P7小鼠耳蜗中有表达。结论Tenascin-W在小鼠耳蜗各发育阶段均有表达,在P7表达量最高,且主要定位于螺旋神经节神经元,提示该蛋白可能影响耳蜗螺旋神经元发育及功能,对小鼠正常听觉的维持发挥重要作用。     

晚期糖基化终产物受体在小鼠耳蜗中表达的初步探讨

目的通过研究晚期糖基化终产物受体(RAGE)在小鼠耳蜗中的表达,初步探讨RAGE与老年性聋关系。方法将C57BL/6J小鼠分为2月龄、10月龄组,分别行ABR阈值检测,组织学切片观察耳蜗形态结构,免疫组化和realtime PCR检测RAGE在耳蜗中的定位和定量表达,半定量RT-PCR检测其配体S100B在耳蜗中的表达情况。结果 :(1)10月龄小鼠较2月龄ABR阈值明显提高;(2)RAGE主要在两组小鼠耳蜗的螺旋神经节细胞,内外毛细胞和血管纹中表达,10月龄C57BL/6J小鼠耳蜗中RAGE平均光密度值比2月龄小鼠大,两组间差异有统计学意义;(3)2月龄组耳蜗中RAGE相对表达量为1±0.15,10月龄组小鼠耳蜗中RAGE相对表达量为2.0816±0.117,两组间差异有统计学意义;(4)配体S100B在10月龄小鼠耳蜗中表达增高。结论 RAGE在C57BL/6J小鼠耳蜗中有表达且随年龄增大表达增强,可能与配体S100B相互作用导致听力下降,提示RAGE可能与老年性聋的发病机制有关。     

出生后不同发育阶段小鼠耳蜗Connexin30的表达

目的 研究缝隙连接蛋白30(Connexin30,Cx30)在出生后不同发育阶段小鼠耳蜗的表达分布,探讨其在听觉系统中的功能.方法 选取出生后(postnatal day,P)1、5、7、10、14、21及30天即P1、P5、P7、P10、P14、P21和P30,共7个天龄段的小鼠,每组6只,通过免疫荧光染色和激光共聚...     

PDCD5和caspase3在不同年龄段C57BL/6J小鼠耳蜗中的表达

目的 检测程序化细胞死亡分子5（programmed cell death 5,PDCD5）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase 3）在不同年龄段C57BL/6J小鼠耳蜗中的表达,初步探讨其在年龄相关性听力下降发生、发展中的作用。方法 选择3、6、9及12月龄段C57BL/6J小鼠各15只,即按月龄分为四组。检测各组小鼠双侧短声( click)及短纯音(6、8 kHz)听性脑干反应(ABR)阈值。采用免疫组化和蛋白质印迹杂交(Westem blotting)检测各月龄段小鼠耳蜗PDCD5和Caspase3蛋白的表达,实时荧光定量PCR( real-time PCR)检测各月龄段小鼠耳蜗PDCD5和caspase 3基因mRNA的表达。结果 随着年龄的增长,C57BL/6J小鼠各频率ABR阈值逐渐提高,耳蜗PDCD5和Caspase3蛋白的表达亦逐渐增强。3月龄和6月龄小鼠耳蜗毛细胞和血管纹细胞仅出现少量PDCD5和Caspase3蛋白表达,9月龄时表达有明显增加,至12月龄时表达最强,各月龄组间比较,差异具有统计学意义(P值均＜0.05)。Real-time PCR检测显示PDCD5和caspase3基因mRNA随着年龄的增长表达逐渐增强,与其蛋白变化趋势相一致。结论 C57 BL/6J小鼠耳蜗PDCD5和caspase3随着年龄的增长表达增强,与耳蜗的老化密切相关,可能是老年性聋发病机制中的一个重要因素。     

钾-氯协同转运蛋白2在耳蜗发育中的表达

目的探讨钾-氯协同转运蛋白2（potassium-chloride cotransporter-2,KCC2）在耳蜗发育中表达的变化特征及可能的生理学意义。方法取出生后0、3、7、14、21、28、35、60天同窝16只SD大鼠耳蜗组织,每次4只,免疫组化SABC法观察KCC2在不同发育阶段的表达,图像分析系统对螺旋神经节细胞（spiral ganglion neurons,SGNs）阳性表达产物进行差异性灰度分析。结果KCC2在各发育阶段都有表达,以SGNs最明显,毛细胞、支持细胞、外侧壁上也有弱阳性表达。在SGNs的表达结果如下：0、3、7天3个组间无明显差异（P〉0.05）;14、21、28天3组间表达逐渐下降（P〈0.05）;28天后各组间无明显差异（P〉0.05）。结论①KCC2在耳蜗各发育阶段均有表达;②不同发育阶段,KCC2在SGNs中的表达具有差异,可能对螺旋神经节的正常发育有重要意义;③KCC2在SGNs以外的弱阳性表达,表明其对维持内、外淋巴液中离子平衡具有一定的作用。     

快速老化痴呆小鼠听功能及耳蜗螺旋神经节细胞MeCP2增龄性变化

目的探讨快速老化痴呆小鼠听觉功能、耳蜗螺旋神经节细胞（spiral ganglion cell,SGC）甲基化CpG结合蛋白2（methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2）表达的增龄性变化。方法检测5、7月龄快速老化小鼠亚系8（senescence accelerated dementia mouse/prone,SAMP8）和同龄抗快速老化小鼠亚系1（senescenceaccelerated mouse/resistance 1,SAMR 1）8 kHz短纯音听觉脑干反应阈值以及SGC的MeCP2免疫组化染色等方面的增龄性变化。结果①第5、7月龄SAMP8小鼠双耳听觉脑干反应阈值较同龄SAMR1小鼠明显提高（5月龄左侧t=5.84,P〈0.05,右侧t=3.31,P〈0.05;7月龄左侧t=5.11,P〈0.05,右侧t=5.11,P〈0.05）;②MeCP2蛋白在不同月龄快速老化小鼠耳蜗组织中均有表达,第5、7月龄SAMP8小鼠SGC中的MeCP2蛋白较同龄SAMR1小鼠明显降低（5月龄t=2.80,P〈0.05;7月龄t=4.64,P〈0.05）。结论 SGC中MeCP2蛋白的表达水平随着快速老化小鼠听觉功能增龄性减退而降低,说明MeCP2蛋白可能与听觉形成有关。     

完整与分段取材法解剖小鼠耳蜗基底膜的比较

目的对完整与分段取材法解剖小鼠耳蜗基底膜进行比较。方法2019年2—3月,将6只10周龄C57BL/6小鼠以随机数字表法分成2组,分别应用完整取材法及分段取材法进行基底膜取材。应用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽荧光染色方法标记耳蜗毛细胞并进行计数,观察基底膜的完整性以及荧光染色效果。SPSS 19.0软件进行统计学分析。结果两种方法均能完整或分段将基底膜完全剥离,完整取材法耗时明显短于分段取材法,差异有统计学意义[(16.33±1.86)min比(23.66±3.88)min,t=-4.173,P=0.002]。鬼笔环肽荧光染色显示两组基底膜毛细胞均保存完整,完整取材法及分段取材法取得的基底膜全长比较差异无统计学意义[(5.92±0.22)mm比(5.72±0.16)mm,t=1.822,P=0.099]。结论应用两种取材方法均可较快分离基底膜并保持其结构的完整性。操作者可根据技术熟练程度及实验目的选择不同的方法。     

四种蹄蝠ABR听力图特点与耳蜗形态及体型的相关性

目的研究我国现存蝙蝠的耳蜗形态和客观听力图与体型参数的相关性,为现存蝙蝠的听觉器官形态和功能进化状态提供数据资料,给蝙蝠听觉器官与发声频率的匹配关系提供依据,建立和完善客观评估蝙蝠听力图的理论和方法,通过本研究拟为蝙蝠的进化理论、生态适应对策和回声定位生理机制提供依据。方法应用美国TDT系统Ⅲ（Tucker-Davis Technologies TDT SystemⅢ）对大蹄蝠、黄大蹄蝠、中蹄蝠和小蹄蝠四种蹄蝠的听性脑干反应（auditory brainstem response,ABR）听力图进行测量和对比分析,测量四种蹄蝠的体型参数和耳蜗形态参数,采用统计学方法分析体型参数前臂长与耳蜗基底宽、耳蜗高和基部头盖骨宽,以及体型与蹄蝠叫声主频率的相关关系。结果本研究结果证明,蝙蝠体型与其叫声主频率呈负相关关系,体型与蝙蝠的社会交流叫声频率亦呈负相关关系。ABR听力图与行为听力图基本相似,蹄蝠听力图具有两到三个听阈敏感区,与蝙蝠的社会交流叫声频率和回声定位声纳频率相对应,而蝙蝠的社会交流叫声频率的ABR听力图在不同种蝙蝠间具有间断跳跃的趋势。从耳蜗基底宽与基部头盖骨宽的关系看,小翼手亚目较大翼手亚目的耳蜗形态要大得多,基本呈现负相关趋势。发现在同科蝙蝠间耳蜗形态与体型呈正向相关关系,比较四种蝙蝠的听力图形状,大蹄蝠均较体型小的蹄蝠听阈值要低及听觉频率范围要宽广。结论本研究结果说明目前体型大的蝙蝠拥有较大的耳蜗形态,与其发声器官相匹配的是耳蜗既要接收高频叫声的回声定位声纳信号,又要进行较低频率叫声的社会信息交流,支持蝙蝠叫声频率与听觉器官及听觉功能协同进化的结论。     

噪声性聋小鼠耳蜗螺旋神经节生长相关蛋白-43变化

目的通过噪声引起4周龄昆明小鼠出现暂时性阈移（tmporary threshold shift,TTS）和永久性阈移（permanent threshold shift,PTS）,观察听觉通路耳蜗螺旋神经节神经元（spiral ganglion of cochlea,CG）中生长相关蛋白（growth associated protein 43,GAP-43）变化,探讨听觉损伤后内耳突触修复的可能机制。方法采用32只昆明小鼠制作噪声性聋动物模型,进行听觉脑干诱发反应听力检测,用免疫组化法对耳蜗听觉通路中GAP-43在神经损伤刺激的表达进行检测。结果噪声性聋引起PTS后CG的GAP-43表达在损伤后第7天出现增加,第14天仍增加明显,而TTS组无明显变化。结论噪声性聋听觉通路神经性损伤作用后7天,GAP-43出现增高说明内耳开始出现突触修复。     

卡那霉素联合呋塞米快速诱导小鼠耳蜗损伤

目的 探讨卡那霉索和呋塞米联合应用对小鼠耳蜗的毒性作用,建立一种可靠的小鼠感音神经性聋模型.方法 选用3～4周龄的CBA/J小鼠为实验对象,按1 g/kg的剂量皮下注射卡那霉素,30～45 min后按0.4 g/kg的剂量腹腔注射呋塞米.在注射前、注射后12 h、24 h、48 h、7 d、2周、4周及12周分别应用听性脑干反应(ABR)检测小鼠听觉功能的改变;应用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽及碘化丙啶染色、半薄切片甲苯胺蓝染色、脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术、扫描电镜等观察小鼠毛细胞死亡的模式和程度;同时通过透射电镜观察记录耳蜗血管纹形态及厚度的变化.结果 序贯应用卡那霉素及呋塞米后12 h小鼠ABR阈值开始上升,随后的36 h内持续进行性上升,继而稳定在90 dB左右.应用激光共聚焦显微镜在药物注射后12 h观察到耳蜗底回外毛细胞开始出现死亡,24 h时底回外毛细胞基本全部消失,同时顶回外毛细胞开始出现死亡,至48 h时整个耳蜗外毛细胞绝大部分死亡;而内毛细胞的损伤至给药后7 d时才开始出现,随时间推移仍有部分内毛细胞完好无损.死亡的毛细胞均具有典型的凋亡细胞特征.扫描电镜观察发现在药物注射后受损毛细胞出现纤毛消失、表皮板塌陷,随后支持细胞增生并在该处形成瘢痕.血管纹表面边缘细胞在给药后出现部分胞体融合并且有坏死物自胞内排出,随后边缘细胞表面大部分微绒毛消失,胞体呈"石块"样改变.透射电镜结果 显示血管纹厚度在给药后进行性下降,主要为边缘细胞萎缩造成.结论 单次序贯应用卡那霉素及呋塞米能快速诱导小鼠耳蜗毛细胞大量死亡,适合应用于建立小鼠感音神经性聋模型.     

大鼠海马CA3区突触素与慢性间歇性缺氧

目的通过建立慢性间歇性缺氧大鼠模型,研究慢性间歇性缺氧对大鼠学习记忆功能的影响,探讨阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea—hypopnea syndrome,OSAHS）影响患者学习记忆功能的可能机制,为临床治疗提供理论依据。方法选取24只SD健康成年雄性大鼠,随机分为空白组（unhandled control group,UC）,慢性间歇性缺氧组（chronici ntermittent hypoxiagroup,CIH）和去除缺氧组（removal of hypoxia group,RH）,UC组正常饲养,CIH组每日间歇缺氧8小时,连续4周,建立慢性间歇性缺氧模型,RH组前4周同CIH组,后4周正常饲养,所有大鼠在实验结束后进行Morris水迷宫测试,检测其学习和记忆能力,并利用免疫组化及图像分析测定大鼠海马CA3区P38表达。结果①Morris水迷宫学习成绩（定位航行实验）：从第1天开始,CIH组的逃避潜伏期明显长于UC组和RH组（P〈0．01或P〈0．05）,RH组的逃避潜伏期明显长于UC组（P〈0．05）：②Morris水迷宫记忆成绩：CIH组的穿越平台次数较UC组显著减少（P〈0．01）,RH组的穿越平台次数较CIH组明显增多（P〈0．05）,但较UC组仍明显减少（P〈0．05）;各组在跨越目标象限时间占整个游泳的时间百分率的比较：CIH组较UC组显著减少（P〈0．01）,而RH组较CIH组明显增多（P〈0．05）,较UC组仍显著减少（P〈0．05）：③各组海马CA3区P38表达水平的比较：CIH组和RH组P38阳性产物OD值均低于对照组（P〈O．01）,RH组高于CIH组（P〈0．01）。结论①慢性间歇性缺氧可引起大鼠学习记忆功能下降,去除缺氧因素后大鼠学习记忆功能有所提高：②慢性间歇性缺氧可导致大鼠海马CA3区P38表达减少,去除缺氧因素后P38表达有所提高;③大鼠学习记忆功能下降可能与海马CA3区突触数量减少和结构变化有关;④慢性间歇性缺氧可能导致OSAHS患者空?     

脑震荡前后大鼠听力及耳蜗形态变化

目的 观察脑震荡前后Wistar大鼠畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emissions,DPOAE)、听性脑干反应(auditory brainstem responses,ABR)阈值及耳蜗形态的变化.方法 40只健康雄性Wistar大鼠随机分成4组,分别为撞击前组,撞击后30分钟组,撞击后1小时组以及撞击后1天组,各组1 0只.选用0.5、0.7、1、1.4、2、3、4、6及8 kHz共9个频率点进行DPOAE(f 2/f1=1.2,L1=65 dBSPL,L2=55dBSPL)幅值测试,同时进行ABR阈值检测.并进行耳蜗毛细胞及周围组织形态学观察.结果 撞击前测得的ABR反应阈值分别与撞击后30分钟、撞击后1小时及撞击后1天比较,反应阈值升高,差异有显著性意义(P＜0.05).DPOAE测试显示,撞击前分别与撞击后30分钟、1小时和1天比较,在2kHz时其幅值均有显著性差异(P＜0.05),即撞击后出现DPOAE幅值下降.这一结果与形态学结果相吻合.结论 撞击后DPOAE幅值在频率2 kHz时下降,ABR反应阈值和DPOAE检测幅值的改变说明脑震荡对耳蜗外毛细胞有一定的损害.