心肌细胞中的钙火花

细胞离子钙是最普遍、最重要的第二信使之一,参与包括肌肉收缩、突触传递、激素分泌、基因转录以及细胞分裂、受精、代谢和凝血等多种生理过程.对心肌细胞来说,离子钙将电活动与收缩联系起来,即介导细胞的兴奋-收缩耦联.1993年我们首次在激光共聚焦显微镜下发现心肌细胞胞内钙释放的基本单位--钙火花.历经十几年的研究,人们对钙火花和胞内钙信号的本质及兴奋-收缩耦联的微观机理的认识日趋深刻.特别是,新发展起来的非紧密封接膜片钳和激光共聚焦显微镜成像合成技术可以激活单个L型钙通道,通过钙致钙释放机制,诱发钙火花.此文简要介绍心肌细胞中自发和诱发钙火花的研究及其意义,并对有关研究领域的前景作一展望.     

Loose-patch方法及其诱发的钙火花

目的:采用Loose-patch方法在心室肌单细胞上诱发出钙火花并探讨其主要特征,并与以往有关的研究结果作比较分析.方法:Loose-patch方法,即非紧密封接的细胞贴附式低阻抗膜片钳制技术和共聚焦显微镜钙成像技术相结合的方法.结果:Loose-patch方法可以较高的概率(72.2%)成功地诱发钙火花;其诱发的平均钙火花的幅度为(1.07±0.06)(单位为△F/F0,其中F0为静息时的钙荧光强度);空间范围为(1.44±0.03) μm;n=124.结论:Loose-patch方法可在保证膜上的L型钙通道与胞内相邻近的Ryanodine受体之间正常的信息耦联关系的前提下,定点诱发钙火花,并通过共聚焦显微镜钙成像技术实现实时准确记录.这对于明确钙火花的特征,准确理解兴奋-收缩耦联的微观机制有重要意义.     

自发钙火花与诱发钙火花的形态特征比较

[目的]钙火花是胞内基本的钙释放事件,既可以在静息的状态下随机产生,也可以被通过L-型钙通道内流的少量钙离子诱发产生.对钙火花特征和产生机理的研究极大地深化了我们对兴奋-收缩耦联过程的理解.本研究的目的旨在比较同一条件下自发钙火花和由loose-patch方法诱发的可以准确测量的钙火花之间在形态特征上的异同,以加深我们对钙火花的认识.[方法]激光共聚焦显微镜线扫描成像技术可记录到加载有荧光染料fluo-4的成年大鼠心肌细胞中随机产生的自发钙火花;而非紧密封接膜片钳技术与激光共聚焦显微镜线扫描成像相结合的方法(1oose-patch方法)可准确记录诱发钙火花.[结果]总体上,在相同条件下共聚焦显微镜线扫描方式记录到的自发钙火花与诱发钙火花的基本特征相似;但诱发钙火花的幅度高于自发钙火花的幅度(1.00±0.05)vs(0.80±0.06),P＜0.05),而空间扩散范围则小于自发钙火花的空间范围(1.35±0.05)μmvs(1.94±0.08)μm,P＜0.05).[结论]自发钙火花和诱发钙火花因其记录方法不同而在形态特征上有不同表现,这对于正确分析钙火花数据和准确理解胞内钙信号的实质有重要意义.     

甲状旁腺素对心肌细胞钙离子移动的影响

目的:研究甲状旁腺素(PTH)对心肌细胞钙离子移动的影响及其机制。方法:培养的新生大鼠心肌细胞以荧光指示剂Fluo-3/AM负载,通过激光共聚焦显微镜(LSCM)动态观察不同浓度PTH_(1-34)对培养心肌细胞钙移动的作用,以及细胞外钙和钙拮抗剂的影响。结果:在细胞外Ca~(2+)为2.50mmol/L时,PTH_(1-34)在0.00、0.01、0.10和1.00μmol/L浓度下的刺激可使心肌细胞静息钙荧光强度(FI)分别从48.78±6.70、47.78±6.14、45.58±6.11、51.10±9.33,增高至48.82±6.31(P>0.05)、54.63±3.60(P<0.05)、63.82±9.21(P<0.01)、78.66±10.04(P0.05);如应用10.00μmol/L硝苯地平预处理,则FI从47.42±8.80上升到54.12±5.13(P>0.05)。结论:甲状旁腺素显著增加静息心肌细胞[Ca~(2+)]_i,并呈浓度依赖性,电压依赖性钙通道开放引起的细胞外钙内流为其重要机制之一。     

维拉帕米对海洛因诱发的乳鼠心肌细胞钙活动异常的作用

【目的】 研究海洛因对乳鼠心肌细胞钙活动的影响以及维拉帕米对海洛因作用下的乳鼠心肌细胞钙活动的影响作用.【方法】 使用体外培养5 d的SD乳鼠心肌细胞,标记细胞内游离钙,应用激光共聚焦显微镜下检测细胞内荧光强度变化可指示细胞内游离Ca²⁺浓度([Ca²⁺]i)变化;并应用碘化丙啶进行活性细胞检测.【结果】 0.01 mol/L海洛因可增加培养心肌细胞平均细胞内钙浓度和钙瞬变的幅度,对自发性收缩节律无明显影响;20 μmol/L维拉帕米可明显抑制海洛因诱导的钙超载,并可降低收缩节律,减少细胞死亡.【结论】 海洛因可导致心肌细胞钙超载和钙活动异常,导致细胞死亡,维拉帕米可抑制细胞内钙活动,保护心肌细胞.     

刺五加与心肌细胞缺血再灌注损伤

随着心脏外科的发展，心肌损伤成为影响手术效果的关键，心肌缺血再灌注损伤是体外循环心脏手术的主要病理生理变化。产生再灌注损伤的原因十分复杂．且各种原因之间又相互影响，目前认为其发生主要与细胞内钙超载、氧自由基损伤有关，以刺五加为代表的中草药有效成分提取物为心肌保护提供了广阔前景。     

成年SD大鼠心肌细胞分离及其胞内钙离子动态变化测定

目的:建立稳定的成年SD大鼠心肌单细胞分离方法,并对心肌细胞内Ca2 动态变化进行测定。方法:用改进的Langendorff装置,行大鼠主动脉插管逆向灌流(温度、pH、水质恒定),用混合液(0.6 mg/mL胶原酶Ⅱ 0.06 mg/mL蛋白酶 1mg/mL牛血清白蛋白)消化心脏,经3次不同浓度含钙台式液复钙后得到钙稳态心肌细胞;室温静置1～2 h后于激光共聚焦显微镜下测定Ca2 的动态变化。结果:得到70%～90%长杆状活细胞,钙稳态心肌细胞可占40%～60%;fluo-4 AM负载染色后可记录到典型的诱发钙瞬变。结论:胶原酶和蛋白酶混合液主动脉逆向灌流方法可以得到具有正常生理功能的钙稳态心肌细胞,可用于心肌细胞内钙信号研究。     

糖基化终极产物对乳鼠心肌细胞胞内游离钙瞬间变化的影响

目的探讨糖基化终极产物(AGEs)刺激对体外培养乳鼠心肌细胞内游离钙的影响.方法应用荧光钙离子指示剂 Fluo-3/AM将体外培养3～5 d的乳鼠心肌细胞染色,激光共聚焦显微镜(LSCM)观察不同浓度AGEs(50、100、200μg/ml)对心肌细胞瞬时刺激后细胞内游离钙离子浓度的影响.结果与对照组相比,AGEs刺激可以迅速引起心肌细胞胞内游离钙浓度的升高,其恢复时程显著延长并呈剂量依赖性.结论AGEs可能通过改变心肌细胞内游离钙离子浓度对心肌细胞造成损伤.     

肌浆网内钙容量减少对心肌细胞钙释放的影响

目的:较系统地研究肌浆网(SR)内钙容量的减少对心肌细胞钙释放的影响.方法:采用肌浆网膜的钙泵抑制剂thapsigargin(TG)耗减SR内钙容量,以喷咖啡因的方法估测SR内钙容量,以局部场刺激的方法诱发全细胞的钙释放.胞内钙信号的变化均采用激光共聚焦显微镜的方法记录.结果:SR钙泵抑制剂TG以剂量依赖和非线性的时间依赖方式引致心肌细胞SR内钙容量的耗减,而钙容量的耗减可相应地引起全细胞水平的钙释放减少.但二者的变化不完全平行,SR内钙容量的少量减少即可引起胞内钙释放的显著减少,而当SR内钙耗减到一定程度后(虽然此时SR内Ca2 仍远高于胞质内钙),场刺激已很难或无法引致钙释放.结论:心肌细胞SR内钙容量对胞内钙释放具有重要的非线性调节作用.     

心肌细胞二维培养的纯化和鉴定

目的探讨新生大鼠心肌细胞二维培养过程中心肌细胞的纯化及心肌细胞与成纤维细胞的鉴别,为改进心肌细胞二维培养及心肌细胞三维培养提供依据。方法用不同差速贴壁次数、含Brdu培养心肌细胞,免疫荧光标记后用激光共聚焦显微镜分别对24h的细胞进行分析鉴定。结果不同培养方法对心肌细胞的纯化有影响。结论差速贴壁次数的不同得到的心肌细胞纯度不一样,加入适当浓度的Brdu可抑制成纤维细胞的生长,获得纯度更高的心肌细胞。     

膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜同步实时控制系统的建立及其在心肌细胞膜钙离子通道研究中的应用

膜片钳技术和激光扫描共聚焦显微镜技术是膜上钙离子通道的功能－形态研究中两种最常用的技术。膜片钳技术能获得膜上钙离子通道的离子电流,但不能够对离子的移动进行实时定位,不能定量分析离子浓度。激光扫描共聚焦显微镜技术可以对钙离子的移动进行实时定位,但不能对单个离子通道的离子移动信号（如单通道电流）进行分析。本文的研究通过在激光扫描共聚焦显微镜上加装膜片钳装置,采用计算机自动控制技术建立膜片钳与激光扫描共聚焦显微镜的同步实时控制系统,并应用于膜上钙离子通道的研究,实现了在利用膜片钳进行全细胞记录观测和测定膜上钙离子通道电流及其开闭时程的同时,利用激光扫描共聚焦显微镜的实时线扫、面扫描技术同步获得了钙火花的显微结构形态图像,测定钙离子的位点变化。该方法可以同时记录钙离子电流信号和胞浆内Ca2＋浓度的变化信息,解决了显微形态与功能同步实时分析的问题,有助于进一步了解膜上钙离子通道的内部机制。     

神经肽Y诱导大鼠心肌细胞肥大的钙信号机制

目的 探讨钙依赖的信号途径在神经肽Y（NPY）诱导心肌肥大中的作用。方法 NPY刺激乳鼠心肌细胞，加入钙调神经磷酸酶（CaN）抑制剂环胞素A（CsA）进行干预（5μg／mL），观察心肌细胞蛋白合成速率（^3H-Leu掺入量）、早期肥大反应基因（c-jun mRNA）表达以及胞浆和核内[Ca^2＋]i的变化。结果 经100nmol／L NPY刺激24h后，心肌细胞^3H-Leu掺入量、c-jun mRNA表达以及胞浆和核内[Ca^2＋]i均明显高于不加药对照组（P〈0．05，P〈0．01）；而CsA干预后的心肌细胞^3H-Leu掺入量和c-jun mRNA表达与对照组比较则无显著差别。结论 Ca^2＋／CaM依赖的CaN信号途径在NPY诱导心肌细胞肥大中起重要作用；NPY刺激细胞内[Ca^2＋]i增加，可能是活化CaN信号途径的始动环节。     

尾加压素Ⅱ对培养乳鼠心肌细胞内钙离子的影响及其机制

目的 观察尾加压素Ⅱ（UⅡ）对体外培养乳鼠心肌细胞内钙离子浓度的影响。方法把体外培养的SD乳鼠心肌细胞以Fluo3／AM荧光指示剂负载,分为4组：正常对照组;单纯UⅡ干预组;尼卡地平提前阻断＋UⅡ干预组;IP3受体拮抗剂XestsponginC＋UⅡ干预组。应用激光共聚焦显微镜技术检测心肌细胞钙离子浓度变化。结果正常对照组心肌细胞内钙离子荧光强度较低（31．65±2．37）;单纯UⅡ干预组钙离子荧光强度增加明显（87．13±5．72）;尼卡地平提前阻断＋UⅡ干预组以及IP3受体拮抗剂XestsponginC＋UⅡ干预组钙离子也有增加,分别为（59．43±4．76）、（54．79±5．18）。结论UⅡ可引起心肌细胞内钙离子浓度增高,其主要的机制可能与细胞外钙离子内流和肌浆网钙离子释放增加有关。     

糖基化终极产物对乳鼠心肌细胞胞内游离钙瞬间变化的影响

目的 探讨糖基化终极产物(AGEs)刺激对体外培养乳鼠心肌细胞内游离钙的影响。方法 应用荧光钙离子指示剂Fluo-3/AM将体外培养3~5 d的乳鼠心肌细胞染色,激光共聚焦显微镜(LSCM)观察不同浓度AGEs(50、100、200 μg/ml)对心肌细胞瞬时刺激后细胞内游离钙离子浓度的影响。结果 与对照组相比,AGEs刺激可以迅速引起心肌细胞胞内游离钙浓度的升高,其恢复时程显著延长并呈剂量依赖性。结论 AGEs可能通过改变心肌细胞内游离钙离子浓度对心肌细胞造成损伤。     

钙火花在重症失血性休克血管反应性中的作用

目的 研究钙火花在重症失血性休克血管反应性中的作用.方法应用激光共聚焦显微镜成像技术和细胞内记录正常和失血性休克2小时后大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌细胞(arterial smooth muscle cell,ASMC)的钙火花和膜电位的变化.结果休克组的钙火花荧光值比正常组的显著增高并且膜电位显著降低.结论失血性休克2小时.钙火花和BKCa活动增强与ASMC细胞膜超极化密切相关.     

神经肽Y诱导大鼠心肌细胞肥大的钙信号机制

目的探讨钙依赖的信号途径在神经肽Y (NPY)诱导心肌肥大中的作用.方法NPY刺激乳鼠心肌细胞,加入钙调神经磷酸酶(CaN)抑制剂环胞素A(CsA)进行干预(5 μg/mL),观察心肌细胞蛋白合成速率(3H-Leu掺入量)、早期肥大反应基因(c-jun mRNA)表达以及胞浆和核内[Ca2+]i的变化.结果经100 nmol/L NPY刺激24 h后,心肌细胞3H-Leu掺入量、c-jun mRNA表达以及胞浆和核内[Ca2+]i均明显高于不加药对照组(P<0.05,P<0.01);而CsA干预后的心肌细胞3H-Leu掺入量和c-jun mRNA表达与对照组比较则无显著差别.结论Ca2+/CaM依赖的CaN信号途径在NPY诱导心肌细胞肥大中起重要作用;NPY刺激细胞内[Ca2+]i增加,可能是活化CaN信号途径的始动环节.     

L-型钙通道激动剂对心肌细胞局部诱发钙释放的影响

目的：研究L-型钙通道激动剂（FPL64176）对心肌细胞局部诱发钙信号的影响特点。方法：采用非紧密封接膜片钳技术与激光扫描共聚焦显微镜钙成像技术相结合的方法,局部触发细胞内钙释放。此技术可自由控制膜去极化水平,使FPL64176只在局部发挥作用。结果：正常情况下,局部兴奋-收缩耦联概率（δSC）和平均诱发钙瞬变与膜去极化水平的关系均呈“钟形”电压-依赖特性。FPL64176作用下,δSC和局部平均诱发钙瞬变均有不同程度的增强（P〈0.05）;低膜电位水平下的孤立钙火花幅度也明显增大（P〈0.05）。结论：“钟形”电压-依赖特性说明,本质上此兴奋-收缩耦联的机制是钙诱导钙释放,而不是由于去极化本身所致。FPL64176不影响局部细胞内钙释放的“钟形”电压-依赖特性。     

高脂饮食诱导肥胖大鼠心肌细胞内钙调节机制的研究

目的 建立高脂饮食诱导肥胖易感(OP)大鼠,研究肥胖大鼠心肌细胞内钙调节的机制.方法 高脂饲料喂饲健康雄性SD大鼠10周后,筛选出肥胖易感(OP)大鼠动物模型.实验结束后,处死动物,测量体脂肪含量,并收集血清,以检测血脂水平.采用酶法分离心肌细胞,Fluo-3/AM负载后采用激光共聚焦扫描显微镜观察心肌[Ca2+]i对KCI除极及咖啡因诱导的反性.结果 OP大鼠肾周脂肪、睾周脂肪、网膜脂肪、体脂肪含量均显著高于基础组大鼠,甘油三酯水平和总胆固醇显著高于基础对照组.肥胖模型组心室肌[Ca2+]i的升高幅度、速度以及不同时间点的恢复程度均显著低于基础组(P<0.05).结论 肥胖心肌细胞[Ca2+]i在KCI除极后升高速度、幅度及恢复程度都发生改变,可能是肥胖心律失常发生机制之一.     

昼夜节律对心力衰竭兔心肌细胞钙火花发生率及时空特性的影响

目的观察不同昼夜节律下心力衰竭兔心肌细胞自发性钙火花发生率、时空特性及对交感刺激的反应。方法家兔心衰模型采用主动脉返流加主动脉缩窄的方法制作,依据相隔12 h的昼夜节律将心衰动物分为静息组及活动组,并分别按时间点分离心肌细胞（每组24个细胞）,使用激光共聚焦扫描技术制作细胞悬浊液并进行观察,测量钙火花发生率、幅值、半高宽、半高时程、上升时间和半衰减时间的变化。结果静息组心肌细胞自发性钙火花发生率及钙火花幅值、半高宽、半高时程、上升时间和半衰减时间明显低于活动组（P〈0.05）;给予ISO灌流后,静息组心肌细胞钙火花发生率及时空特性参数明显高于活动组（P〈0.05）。结论昼夜节律可影响衰竭心肌细胞局部钙释放及交感反应性,其可能是夜间或静息状态下高发室性心律失常的机制之一。