腺病毒介导KDR启动子的胸苷激酶基因对血管内皮细胞的靶向杀伤作用

目的: 体外实验评估腺病毒介导KDR启动子-胸苷激酶系统(HSV-tk)杀伤血管内皮细胞的作用. 方法:采用新型AdEasy系统,构建受KDR启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子调控并可表达HSV-tk基因的AdKDR-tk和AdCMV-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外分别感染表达KDR的人脐静脉血管内皮细胞株(HUVEC)和不表达KDR的人鼻咽癌细胞株CNE-2,用丙氧鸟苷(GCV)处理受染细胞,并以MTT法检测其细胞增殖情况. 结果:病毒滴度均为1×1013 pfu/L. 在感染复数(MOI)为100的条件下,GCV浓度由0增至50 mg/L时感染含AdKDR-tk的HUVEC细胞和CNE-2细胞存活率从(89.4±4.6)%和(91.5±4.4)%分别下降至(22.9±4.7)%和(71.4±2.9)%(P＜0.01),而感染AdCMV-tk的HUVEC细胞和CNE-2细胞存活率从(89.9±6.2)%和(90.8±5.7)%分别下降至(12.8±2.6 )%和(18.8±6.1)%(P＞0.05). 结论:腺病毒介导KDR启动子-胸苷激酶系统具有特异性杀伤血管内皮细胞作用.     

腺病毒介导KDR启动子的胸苷激酶基因治疗小鼠人鼻咽癌模型

目的: 研究腺病毒介导的KDR启动子-单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)系统(AdKDR- tk)结合丙氧鸟苷(GCV)对裸鼠人鼻咽癌的治疗作用. 方法: 建立人鼻咽癌裸鼠模型, 将36只成瘤鼠随机分成AdKDR-tk/GCV组、AdCMV-tk/GCV组和生理盐水/GCV组,每组12只. 采用瘤内注射分别给予重组腺病毒及生理盐水,24 h后重复注射1次. 次日起连续10 d每日ip GCV 1次,100 mg/kg. 治疗结束后处死裸鼠,检测肿瘤质量、组织形态学变化及肿瘤微血管密度. 结果: AdCMV-tk/ GCV组裸鼠鼻咽癌瘤体质量(1.81±0.84)g及肿瘤微血管密度(11.54±1.56)个/mm3、AdKDR-tk/ GCV组[分别为(1.48±0.88)g,(9.87±2.18)个/mm3]与生理盐水/GCV组[分别为(2.53±1.21)g,(17.78±2.12)个/mm3]相比差异有显著性 (P<0.05). AdCMV-tk/ GCV组与AdKDR-tk/ GCV组比较也存在显著差异(P<0.05). 结论: 癌灶内注射AdKDR-tk对裸鼠人鼻咽癌生长具有明显抑制作用,为鼻咽癌的治疗提供新的方法.     

腺病毒介导的HSV-TK/GCV系统对PVNS滑膜细胞的杀伤作用

目的〓〖HTK〗探讨腺病毒介导HSV-TK/GCV系统对色素沉着绒毛结节滑膜炎(PVNS)滑膜细胞的体外杀伤作用。〖HTW〗方法〓〖HTK〗将含LacZ基因的重组腺病毒载体Ad-LacZ转染PVNS滑膜细胞, X-gal染色法确定腺病毒对该细胞的转染效率,PCR检测转染细胞中HSV-TK基因的表达,MTT法检测TK阳性细胞对GCV的体外敏感性及旁观者效应,流式细胞仪检测HSV-TK/GCV系统作用后细胞的凋亡及坏死。〖HTW〗结果〓〖HTK〗感染复数为120时,近100％的细胞可被转染。HSV-TK/GCV系统对PVNS滑膜细胞的杀伤作用十分明显,且存在明显的旁观者效应。HSV-TK/GCV系统作用后细胞出现明显的凋亡及坏死。〖HTW〗结论〓〖HTK〗HSV-TK/GCV系统可明显杀伤PVNS中过度增殖滑膜细胞,可望用于PVNS的治疗。     

腺病毒介导胸苷激酶基因治疗肝癌的实验研究

目的：观察腺病毒介导胸苷激酶基因联合抗病毒药物对人肝癌细胞（ＨｅｐＧ２）的杀伤作用。方法：利用腺病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ＴＫ）导入体外培养的ＨｅｐＧ２中,再加入羟基无环鸟苷（ＧＣＶ）,观察其对ＨｅｐＧ２细胞的杀伤效应。结果：在感染复数（ＭＯＩ）小于１００或ＧＣＶ浓度小于４００ｕｇ／ｍｌ范围内,单独应用载体或ＧＣＶ,对培养细胞的形态与存活率均无明显影响。当两者合并应用时,ＧＣＶ在     

重组腺病毒ADV-TK 基因的构建及其对肝癌细胞的杀伤作用

目的 探讨含胸苷激酶(TK)自杀基因的重组腺病毒(ADV-TK)对肝癌细胞的杀伤作用.方法 采用细胞内同源重组法构建出携带TK基因的ADV-TK,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定,将ADV-TK感染人肝癌细胞株SMMC-7721,MTT法检测受感染的SMMC-7721细胞被不同浓度GCV作用后的细胞存活率情况.结果 构建的重组腺病毒中带有TK基因,用相同滴度的重组腺病毒和不同浓度的GCV作用于肝癌细胞株SMMC-7721后.MTT法检测到细胞的存活率随着GCV浓度的增加而不断降低.结论 本实验构建的携带TK基因的复制缺陷型腺病毒对肝癌细胞具有明显的杀伤作用.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因表达对人肝癌细胞的生长抑制

使用转导有单纯疱疹Ｉ型病毒胸苷激酶（ＨＳＶ１－ＴＫ）基因的人肝癌ＳＭＭＣ７７２１细胞株建立了裸鼠移植瘤模型，并进行了在体和体外试验性无不环鸟苷（ＡＣＶ）治疗。结果发现基因转导后的肝癌细胞表现出对ＡＣＶ的敏感性，肝癌细胞生长抑制与ＡＣＶ的剂量有关；用药组裸鼠除平均瘤重明显低于对照组外，不凶细胞核分型指数降低，伴有细胞变性和坏死。结果表明：ＨＳＶ１－ＴＫ基因经逆转录病毒转导后，用ＡＣＶ诱导表达明显抑制     

腺病毒介导siRNA抑制人胃腺癌细胞VEGF表达

目的:构建重组腺病毒Ad-siRNA-VEGF并观察其抑制人胃腺癌细胞(MGC-803)血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表达的效果。方法:①选择针对人VEGFmRNA的特异性siRNA靶序列,设计、合成其相应的双链DNA,插入pSUPER质粒,得到psiRNA-VEGF;NotⅠ和XhoⅠ双酶切psiRNA-VEGF得siRNA-VEGF表达片段;插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack,构建pAdTrack-siR-NA-VEGF,后者与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组后,酶切鉴定、293细胞包装、扩增,得到重组腺病毒Ad-siRNA-VEGF;②Ad-siRNA-VEGF转染MGC-803细胞96h后,RealTimePCR检测细胞VEGFmRNA水平、ELISA测定细胞培养液上清VEGF蛋白浓度。结果:成功构建重组腺病毒Ad-siRNA-VEGF,293细胞包装1d后观察到绿色荧光蛋白表达,氯化铯梯度离心纯化获得约3.6×108efu/ml滴度的重组腺病毒;Ad-siRNA-VEGF转染MGC-803细胞96h后,其VEGFmRNA水平下降了67.1%,培养液上清VEGF蛋白浓度下降了72.5%(P<0.01)。结论:腺病毒介导的RNAi技术可显著抑制人胃腺癌细胞的VEGF表达,这为抗血管生成治疗肿瘤的进一步研究开辟了新的方向。     

肝动脉灌注AdVEGF-tk治疗大鼠肝癌

目的:研究经肝动脉灌注腺病毒介导的血管内皮生长因子(VEGF)启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)系统(AdVEGF-tk)对大鼠肝癌模型的治疗作用.方法:以二乙基亚硝胺(DEN)诱导建立Wistar大鼠肝癌模型,将32只成瘤鼠随机分成AdVEGF-tk/GCV 组、Ad/GCV 组、AdCMV-tk/GCV 组和生理盐水/GCV组,每组8只.诱癌后第120天时经肝动脉分别给予重组腺病毒或生理盐水,次日起连续10 d每天腹腔内给予丙氧鸟苷(GCV)1次,剂量为50 mg*kg-1*d-1.停止注射后第10天剖腹测量肿瘤大小,比较各组间肿瘤评分变化及大鼠存活情况.结果:DEN处理第120天后,所有大鼠均有典型肿瘤形成,病理证实为肝细胞癌.经肝动脉灌注腺病毒载体或生理盐水后,AdCMV-tk/GCV组在腹腔内注射GCV开始后第5天陆续死亡,灌注后第20天时该组大鼠只剩下2只;其他3组大鼠均完全存活.肿瘤评分表明,AdVEGF-tk/GCV组处理前后肿瘤评分没有明显差异[(2.25±0.89) vs (2.25±0.76)],而Ad/GCV组[(2.00±0.93) vs (3.89±0.83)]和生理盐水/GCV组[(2.13±0.83) vs (3.75±0.89)]在处理后明显增高(P<0.01).到灌注后第90天时,AdVEGF-tk/GCV组大鼠的生存时间明显延长.结论:肝动脉灌注AdVEGF-tk/GCV可明显减缓肿瘤生长速度并延长荷瘤大鼠的生存时间,且不良反应小.     

hTERT启动子驱动的HSV-TK基因重组腺病毒载体的构建和制备

目的构建人端粒酶逆转录酶启动子驱动的HSV-TK基因重组腺病毒的真核表达载体,为进一步研究其在体内外实验提供依据。方法PDC312-TP质粒和PSUCMV-TK质粒经EcoR I,Sal I酶切连接构建PDC312-TP-TK,将质粒PDC312-TP-TK与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbhge3通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞,经同源重组产生重组腺病毒PSG-TP-TK,PSG-TP-TK在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度。结果质粒PDC312-TP-TK经酶切鉴定正确,扩增得到的PSG-TP-TK经PCR扩增证实为hTERT启动子驱动的HSV-TK重组腺病毒,腺病毒滴度为1.9×1010pfu/ml。结论该实验为重组腺病毒PSG-TP-TK用于肿瘤的基因治疗打下了基础。     

Expression of Vascular Endothelial Growth Factor in Hepatocellular Carcinoma and Its Relationship to Tumor Growth and Metastasis

Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)isanewlydiscoveredgrowthfactorwhichmayinducetumorangiogenesisll].Inthepresentstudy,immunohistochemistryandNorthernblotwereusedtoinvestigatetheVEGFexpressioninhepatocellularcarcilloma(HCC)withtheattempttounderstanditsrelationshiptothemetastasls.IMATERIALSANDMETHODS1.1TissueSamplesThespecimensinvestigatedwereobtainedfromZII)atientswithHCCoperatedattheaffiliatedhospitalsofouruniversity.Nineofthepatientsshowedclinicallymetastasiswithportalveintu…     

血管内皮生长因子及其受体在肝癌细胞株中的表达及意义

目的　探讨血管内皮生长因子 (VEGF)及其受体在肝癌细胞系中的表达及意义 .方法　采用免疫组织化学及免疫荧光方法检测了两株肝癌细胞株及一株正常肝细胞株中VEGF及其受体的表达 ,并用 Western blot法对 VEGF表达半定量 .结果　 VEGF在肝癌细胞株 SMMC 772 1及 HHCC中以及正常肝细胞株 QZG中均有表达 ,灰度值分别为 2 18±4,2 15± 4和 2 2 8± 6 ,SMMC 772 1及 HHCC中 VEGF表达强于 QZG,两者之间有显著统计学差异 (P<0 .0 5 ) ;VEGF受体KDR在 HHCC中呈弱阳性表达 ,在 772 1及 QZG中无表达 ,受体 flt- 1在三株细胞中均无表达 .结论　 VEGF及其受体在肝癌细胞中的表达与肝细胞癌的发生发展有关     

肝细胞生长因子及受体促进人大肠癌细胞血管内皮生长因子表达

目的:观察不同浓度肝细胞生长因子对体外培养的大肠癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法:体外培养人大肠癌细胞,分别加入不同浓度的人重组肝细胞生长因子和或其受体抑制剂Herbimycin A(HA),用Western blot、RT-PCR、ELISA等方法检测肝细胞生长因子对其受体磷酸化表达及大肠癌细胞VEGF表达的影响.结果:肝细胞生长因子在10～100 ng/ml浓度范围内较对照组相比显著促进大肠癌细胞VEGF mRNA(增加了4～5倍)、蛋白质表达(增加了3～10倍);Western blot检测肝细胞生长因子引起其受体磷酸化,并与其诱导的VEGF表达相关.结论:体外培养条件下,肝细胞生长因子呈剂量依赖性促进大肠癌细胞VEGF表达,其表达与其受体磷酸化水平相关;其受体磷酸化抑制剂可以抑制大肠癌细胞VEGF表达.     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外靶向性转染心肌细胞

目的:构建以鼠心肌轻链蛋白基因(mlc-2v)为启动子、携带人血管内皮生长因子hVEGF165基因的重组腺病毒载体,检测该重组腺病毒载体对心肌细胞转染的靶向性.方法:酶切腺病毒载体PDC315自身启动子CMV,构建腺病毒载体PDC317,分别接入hVEGF165、mlc-2v基因,构建腺病毒载体PDC-mlc-hVEGF165.鉴定正确后,将PDC-mlc-hVEGF165与Lipofectamine共转染至293细胞,经同源重组获得以mlc-2v为启动子、携带hVEGF165基因的重组腺病毒Ad-mlc-hVEGF165,同步构建无靶向性的重组腺病毒Ad-hVEGF165.扩增并测定滴度后,Ad-hVEGF165、Ad-mlc-hVEGF165分别转染体外培养的心肌细胞、骨骼肌细胞及平滑肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测Ad-mlc-hVEGF165转染心肌细胞的靶向性.结果:构建的病毒正确,病毒滴度为2.8×109 pfu/ml.转染3 d后,Ad-hVEGF165组在各培养细胞的上清液及细胞内均检测到VEGF的表达,而Ad-mlc-hVEGF165组仅在心肌细胞中有VEGF的表达,且Ad-mlc-hVEGF165组心肌细胞分泌的VEGF要少于Ad-hVEGF165组.结论:成功构建了以mlc-2v为启动子、携带人VEGF基因的重组腺病毒Ad-mlc-hVEGF165;该重组载体能体外靶向性转染心肌细胞并使之表达VEGF.     

Construction and identification of recombinant adenovirus-mediated gene transfer system for rat vascular endothelial growth factor

Objective To construct the recombinant adenovirus vector carrying rat vascular endothelial growth factor(VEGF), as preparation for genetic transfection that follows. Methods Rat VEGF was obtained by using RT-PCR amplification and then cloned into the shutter plasmid pDC316. Subsequently, this newly constructed plasmid pDC316-VEGF, after identification by nuclease digestion analysis and sequencing analysis, was transfected into human embryonic kidney cells HEK293 by Lipofectamine 2000 mediation, together with adenovirus-packaging plasmid pBHGE3. Based on the homologous recombination of the two plasmids within HEK293 cells, the recombinant adenovirus vector carrying VEGF and VDC316-VEGF was created. VDC316-VEGF was subsequently identified using PCR, purified using repeated plaque passages, proliferated using freezing and melting within HEK293 cells, and titrated using 50% Tissue Culture Infective Dose(TCID50) assay. ResultsThe newly constructed recombinant adenovirus was confirmed to carry rat VEGF based on PCR results, and its titration value determined based on TCID50 assay was 3×109 pfu/ml. ConclusionThe recombinant adenovirus carrying rat VEGF was successfully constructed. The newly constructed adenovirus can produce a sufficiently high titration value within HEK293 cells, providing a reliable tool for genetic transfection in further gene therapy researches.     

缺氧诱导因子-1和血管内皮生长因子在肝癌组织中的表达及临床意义

目的探讨肝癌组织中HIF-1α和VEGF表达的相互关系及临床意义。方法应用免疫组化SABC法检测36例肝癌及15例癌旁组织中HIF-1α、VEGF的表达，分析比较其与肝癌组织病理学的关系。结果肝癌组中的HIF一1α及VEGF的表达较癌旁组增强（P〈0．01），且肝癌组中无包膜及已转移者H1F-1α、VEGF的表达水平相应较有包膜及未发生转移者高（P〈0．05）；同时肝癌组织中HIF-α、VEGF两者的表达呈正相关（r=0．62，P〈0．05）。结论肝癌组织中HIF-1α和VEGF表达可反映肝癌的生物学行为，可作为预测肝癌浸润转移的一项重要指标。     

血清ICAM-1与VEGF的测定在肝癌外科治疗中的意义

目的:探讨细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及血管内皮细胞生长因子(VEGF)在肝细胞癌(HCC)患者血清中的表达水平,研究上述血清学指标在估计HCC病情进展与预后判断的价值。方法:利用酶联免疫吸附方法定量检测65例HCC术前、术后血清ICAM-1、VEGF及AFP水平并与正常人进行对比。结果:与术前比较,HCC患者术后3周血清I-CAM-1及AFP都显著下降(P<0.05),而血清VEGF无显著改变(P>0.05)。结论:血清ICAM-1及VEGF水平的升高与HCC病情的发展、预后判断及疗效观察关系密切。