Spermidine/spermine N1-acetyltransferase 2 increases sensitivity of renal carcinoma Caki-1 cells to chemotherapy by inhibiting HIF-1α

目的 探讨转染精脒/精胺N1乙酰基转移酶2(spermidine/spermine N1 -acetyltransferase 2,SSAT2)在低氧条件下对肾癌Caki-1细胞增殖、凋亡和阿霉素敏感性的影响及机制.方法 经X-treme GENE HP介导将真核表达质粒pcDNA3.1 (D)/V5-His-SSAT2转入肾癌Caki-1细胞,细胞在1％氧浓度下培养,Western blot法检测SSAT2蛋白和低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha,HIF-1α)蛋白表达；流式细胞仪检测细胞的凋亡率、死亡率；MTT法检测细胞的增殖,以及不同浓度阿霉素对细胞的抑制率.结果 SSAT2成功转入肾癌Caki-1细胞,与空白细胞组及空载体组比较,转染SSAT2组HIF-1α蛋白表达明显下调(P＜0.01),细胞增殖受到明显抑制(P＜0.01),细胞凋亡率和死亡率均增加(P＜0.05).阿霉素浓度为2μg/ml时,转染组细胞抑制率可达(67.5±3.7)％,对空白细胞和空载体细胞的抑制率为(54.7±8.4)％、(56.8±7.7)％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 转染SSAT2可以通过下调HIF-1α蛋白表达,减少肾癌细胞的增殖,增加肾癌Caki-1细胞的凋亡率、坏死率和对阿霉素的敏感性,针对SSAT2的基因治疗可能成为逆转肾癌耐药的方法之一.     

心肺复苏后大鼠脑组织精脒/精胺-N1-乙酰基转移酶2与HIF-1α表达的动态变化规律

目的研究心肺复苏后大鼠脑组织中精脒/精胺-N1-乙酰基转移酶2(spermidine/spermine-N1-acetyltrans-ferase2,SSAT2)与缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)表达的动态变化规律,分析二者相关性。方法 88只成年SD大鼠随机数字表法分为正常对照组(n=8)、假手术组(n=40)和心肺复苏组(n=40)。其中假手术组和心肺复苏组再分为1、8、24、48、72 h 5个亚组,每亚组8只。采用RT-PCR、Western blot法分别检测脑组织中HIF-1αmRNA和HIF-1α、SSAT2蛋白的表达。结果 SSAT2的表达在复苏后明显降低,1 h[(0.314±0.027),P<0.01]表达最低,随后逐渐升高(P<0.01),至72 h[(0.731±0.024),P>0.05]时回升到正常对照组水平(0.736±0.02),而假手术组SSAT2的表达与正常对照组相比无显著变化(P>0.05)。HIF-1αmRNA的表达在复苏后1 h[(0.245±0.021),P<0.05]时降低,但8 h[(0.430±0.019),P<0.05]时明显增强,后24 h[(0.387±0.018),P<0.05]、48 h[(0.385±0.019),P<0.05]下降,至72 h时回落到正常对照组水平(0.343±0.022);但HIF-1α蛋白在复苏后1 h[(0.755±0.012),P<0.01]显著增高,随后逐渐下降(P<0.01),至72 h[(0.033±0.002),P<0.01]时仅轻度增高,而在正常对照组和假手术组未能检测出HIF-1α表达。SSAT2表达与HIF-1α表达在复苏后72 h内呈负性相关(r=-0.945,P<0.01),SSAT2表达与HIF-1αmRNA表达在复苏后8～48 h呈负相关(r=-0.614,P=0.01)。结论在心肺复苏后一定时间内,大鼠脑组织SSAT2表达减弱,HIF-1αmRNA及蛋白表达增加,两者呈负相关表达,提示SSAT2对HIF-1α蛋白、HIF-1αmRNA可能起负性调节作用。     

低氧状态下血管内皮细胞HIF-1α表达及与细胞凋亡的关系

目的探讨低氧对人脐静脉内皮细胞ECV304凋亡及低氧诱导因子-1α表达的影响及意义。方法人脐静脉内皮ECV304细胞分为低氧处理组和对照组,处理后MTT法检测细胞增殖抑制率;流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡;应用荧光实时定量PCR(QPCR)和Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3和HIF-1α的mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较,低氧处理能明显抑制细胞的增殖,且抑制作用随着低氧处理时间的延长而增强(P<0.05);低氧处理细胞后凋亡率明显增加,且呈时间依赖性(P<0.05);QPCR和Western blot结果显示,低氧处理组细胞Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.05),Bcl-2则明显下降(P<0.05),Bcl-2/Bax比值显著降低,且呈时间依赖性(P<0.05)。低氧呈时间依赖性上调HIF-1α的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。结论低氧能促进人脐静脉内皮细胞ECV304细胞凋亡,其机制可能与HIF-1α表达上调及Bcl-2的表达降低、Caspase-3和Bax的表达升高有关。     

HIF-1α基因沉默后对SW480人结肠癌细胞生物学特性的影响

目的 探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）基因沉默对SW480人结肠癌细胞增殖、凋亡的影响。方法 利用脂质体法转染介导的siRNA干扰技术转染人结肠癌细胞SW480,设立干扰组：转染HIF-1α干扰序列;阴性对照组：转染无关序列;空载体组：为空白质粒;空白对照组：未转染。用Real-time PCR及Western blot、MTT比色法、流式细胞仪(FCM) 检测各组HIF-1α mRNA及蛋白的表达、SW480细胞增殖及凋亡。结果 干扰组在各时间点对HIF-1α mRNA表达的沉默效率均在80％以上,高于其他3组(P均＜0.05);与其余3组相比,干扰组HIF-1α蛋白相对表达量降低(P<0.05),增殖曲线表明其增殖受抑;凋亡率显著升高(P<0.01)。结论 HIF-1α基因沉默可促进人结肠癌细胞SW480凋亡,抑制肿瘤细胞生长。     

姜黄素对肾癌786-O细胞增殖及凋亡的实验研究

目的观察姜黄素对肾癌786-O细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP蛋白)表达水平以及细胞凋亡的影响,研究姜黄素对肾癌细胞的生长抑制作用并探讨其分子机制,进一步揭示姜黄素对肾癌的治疗作用。方法不同浓度姜黄素作用人肾癌786-O细胞24、48、72 h后,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测姜黄素对人肾癌786-O细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测姜黄素诱导细胞的凋亡率;免疫细胞化学检测姜黄素对786-O细胞HIF-1α和XIAP表达的影响。结果姜黄素对人肾癌786-O细胞有明显的抑制作用,可引起细胞凋亡,并且存在剂量和时间依赖;不同浓度姜黄素作用细胞48 h后,HIF-1α和XIAP蛋白表达量下降。结论姜黄素通过下调HIF-1α和XIAP的表达抑制人肾癌786-O细胞的增殖,诱导人肾癌786-O细胞的凋亡。     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α对胃癌细胞生物学行为的影响

目的:观察RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对胃癌细胞增殖﹑凋亡﹑侵袭性的影响并探讨其可能的分子机制。方法:将HIF-1α短发夹RNA(shRNA)重组质粒pGCsi-shHIF-1α稳定转染人胃癌细胞SGC-7901;采用RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α mRNA、蛋白表达水平,Western blot法检测葡萄糖转运蛋白1(Glut-1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)及趋化因子受体CXCR4蛋白表达;MTT法、流式细胞仪、transwell试验分别检测转染细胞的增殖、凋亡及侵袭迁移能力。结果:稳定转染pGCsi-shHIF-1α后,SGC-7901细胞HIF-1α表达在mRNA及蛋白水平均受到明显抑制,Glut-1﹑MMP-2﹑CXCR4蛋白表达较对照组降低;细胞增殖能力较对照组明显降低,细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);细胞体外侵袭迁移能力受到明显抑制(P<0.01)。结论:pGCsi-shHIF-1α能有效沉默胃癌细胞SGC-7901 HIF-1α基因表达,抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭并诱导其凋亡,提示HIF-1α可能通过上调Glut-1﹑MMP-2和C...     

dn HIF-1对宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的研究抑制性缺氧诱导因子-1α(dn HIF-1α)对人宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响,探讨HIF-1α在SiHa细胞的血管生成、缺氧保护、凋亡、增殖过程中的作用。方法将表达dn HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染入SiHa细胞,采用免疫细胞化学法和Western Blotting检测dn HIF-1α转染SiHa细胞后其HIF-1α与血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的变化;CoCl2化学缺氧法处理细胞,MTT法测定细胞增殖情况,原位缺口末端标记法检测细胞凋亡情况,同时与pcDNA3.1组和未转染组进行比较。结果重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染SiHa细胞后,其HIF-1α蛋白表达水平与其它两组相比差异无统计学意义,而VEGF蛋白表达水平有较明显的降低(P<0.05)。转染dn HIF-1α的细胞,常氧培养和CoCl2诱导的化学缺氧条件下其增殖能力均低于其他两组(P<0.05),CoCl2处理后细胞凋亡增加,与其他两组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论dn HIF-1α抑制SiHa细胞的增殖并促进CoCl2化学缺氧引起的细胞凋亡,同时能降低VEGF蛋白的表达。提示dn HIF-1α可望在宫颈癌治疗中发挥作用。     

慢病毒介导HIF-1α沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/L CoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用Western Blot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。Western Blot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③Western Blot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。     

三突变型低氧诱导因子-1α对人微血管内皮细胞增殖及VEGF蛋白表达的影响

目的观察重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对人微血管内皮细胞(hMVECs)增殖及VEGF蛋白表达的影响。方法三突变型HIF-1α腺病毒载体(Ad-HIF-1α564/402/803)、野生型HIF-1α腺病毒载体(Ad-HIF-1αnature)、Ad-LacZ及空载腺病毒载体(Ad-Null)分别在HEK293A细胞大量扩增,氯化铯梯度离心纯化,终点稀释法测定病毒滴度;双荧光素酶报告系统检测三突变型HIF-1α与野生型HIF-1α的转录活性;各重组腺病毒载体以最佳转染复数转染体外培养的hMVECs,Western blotting测定HIF-1α和VEGF蛋白表达;MTS检测Ad-HIF-1α564/402/803对细胞增殖的影响。结果三突变型HIF-1α转录活性显著高于野生型HIF-1α(P<0.001);Ad-HIF-1α564/402/803组HIF-1α和VEGF蛋白表达量高于Ad-HIF-1αnature及其他组;VEGF蛋白表达水平与HIF-1α呈剂量依赖关系。Ad-HIF-1α564/402/803组第3、5天吸光度值均显著高于Ad-HIF-1αnature及其他组(P<0.01)。结论三突变型HIF-1α在体外常氧条件下稳定高效表达,可诱导hMVECs VEGF蛋白表达上调,促进hMVECs增殖。     

腺病毒介导过表达ANT1基因诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡

目的利用腺病毒载体转染体外培养的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs),研究过表达腺嘌呤核苷酸转位酶1(adenine nucleotide translocase 1,ANT1)对大鼠VSMCs凋亡的影响。方法用携带ANT1的腺病毒载体(Ad-ANT1)或空载体腺病毒载体(Ad-GFP)感染VSMCs,采用激光共聚焦观察Hoechst33258染色后细胞凋亡情况,流式细胞术检测Annexin V标记细胞凋亡率。Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达。结果激光共聚焦观察转染Ad-ANT1后48 h细胞出现凋亡,且凋亡率[(13.40±1.14)%]与转染空载体对照组[(1.80±0.84)%]相比较差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞术检测转染Ad-ANT1后48 h细胞凋亡率[(10.66±1.75)%]明显高于转染空载体组细胞[(3.13±0.37)%](P<0.05)。Western blot结果显示转染Ad-ANT1后Bax蛋白表达明显高于转染空载体组,Bcl-2蛋白表达2组比较无明显差异。结论腺病毒介导过表达ANT1可诱导大鼠VSMC的凋亡,其机制可能通过上调Bax实现。     

dn HIF-1α对宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的 研究抑制性缺氧诱导因子-1α(dn HIF-1α)对人宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响,探讨HIF-1α在SiHa细胞的血管生成、缺氧保护、凋亡、增殖过程中的作用.方法 将表达dn HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染入SiHa细胞,采用免疫细胞化学法和Western Blotting检测dn HIF-1α转染SiHa细胞后其HIF-1α与血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的变化;CoCl2化学缺氧法处理细胞,MTT法测定细胞增殖情况,原位缺口末端标记法检测细胞凋亡情况.同时与pcDNA3.1组和未转染组进行比较.结果 重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染SiHa细胞后,其HIF-1α蛋白表达水平与其它两组相比差异无统计学意义,而VEGF蛋白表达水平有较明显的降低(P<0.05).转染dn HIF-1α的细胞,常氧培养和CoCl2诱导的化学缺氧条件下其增殖能力均低于其他两组(P<0.05),CoCl2处理后细胞凋亡增加,与其他两组相比,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 dn HIF-1α抑制SiHa细胞的增殖并促进CoCl2化学缺氧引起的细胞凋亡,同时能降低VEGF蛋白的表达.提示dn HIF-1α可望在宫颈癌治疗中发挥作用.     

HIF-1α基因转染人胃腺癌SGC7901细胞对裸鼠移植瘤的影响及机制

目的 探讨低氧诱导因子(HIF)-1α基因转染人胃腺癌SGC7901对裸鼠移植瘤血管生成及EphA2表达的影响及其可能机制.方法 采用HIF-1α基因重组质粒pGCsi-shHIF-1α,转染胃腺癌SGC7901细胞并接种裸鼠(SGC7901/shRNA,实验组),建立裸鼠皮下人胃腺癌移植瘤模型,动态观测裸鼠肿瘤体积和质量;设SGC7901(未转染组)、转染空质粒的SGC7901(SGC7901/Neo,空载体组)为对照.观察移植瘤生长情况,8周后,获取移植瘤模型瘤组织,称取湿重,免疫组化SP法检测移植瘤组织的微血管密度,Western blot检测上皮细胞激酶A2(EphA2)表达.结果 与未转染组比较,空载体组瘤体积、质量改变不明显,HIF-1α转染的实验组的瘤体积、质量明显降低;HIF-1α转染的实验组诱导血管增生、形成血管生成拟态和EphA2蛋白表达较未转染组组、空载体组明显降低(P<0.05,P<0.01).结论 HIF-1α基因转染可明显抑制裸鼠人胃腺癌移植瘤的生长,该作用可能与其抑制肿瘤血管新生、形成血管拟态及EphA2蛋白表达有关.     

低氧微环境下siRNA靶向沉默HIF 2α基因对前列腺癌PC 3细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察体外低氧条件下缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)在人前列腺癌细胞PC-3中的表达情况,并研究siRNA沉默HIF-2α基因对前列腺癌PC-3细胞生长及凋亡的影响.方法 在体外培养的PC-3细胞中加入化学诱导剂CoCl2建立低氧模型,采用逆转录PCR(RT-PCR)和Western印迹法检测CoCl2诱导HIF-2αmRNA和蛋白表达的时-效和量-效关系.合成HIF-2αsiRNA片段并转染前列腺癌PC-3细胞,采用RT-PCR及Western印迹法检测HIF-2αsiRNA对HIF-2α基因表达的影响,采用MTT法检测转染HIF-2αsiRNA后对PC-3细胞生长的抑制情况,采用流式细胞仪检测RNA干扰对PC-3细胞凋亡的影响.结果 (1)低氧可诱导PC-3细胞的HIF-2αmRNA表达,与常氧组比较,低氧12,24及48 h组的HIF-2αmRNA和蛋白表达量逐渐升高(P<0.05).100μmol/L的CoCl2作用48 h可作为最佳前列腺癌细胞PC-3低氧模型.(2)低氧+HIF-2αsiRNA干扰组的HIF-2αmRNA和蛋白表达水平明显低于低氧+阴性对照组和低氧组(P<0.05),而低氧+阴性对照组与低氧组的HIF-2αmRNA和蛋白表达水平无显著性差异(P>0.05).低氧+HIF-2αsiRNA干扰组细胞增殖受抑制、细胞凋亡增加(P<0.05),而常氧组、低氧组、低氧+阴性对照组细胞增殖活力和凋亡差别均无统计学意义(P>0.05).     

HIF-1α516对人肝癌HepG2细胞侵袭转移能力的影响

目的观察HIF-1α516对人肝癌HepG2细胞侵袭转移能力的影响。方法人肝癌HepG2细胞分为空白组(同步培养,不做任何处理)、对照组(转染siRNA)和siRNA干扰组(转染HIF-1α516 siRNA)。siRNA和HIF-1α516 siRNA通过脂质体转染HepG2,转染18h后Western blot检测HepG2细胞中HIF-1β核蛋白和全细胞蛋白的表达、ELISA法检测细胞培养上清中MMP-2、MMP-9的含量,Transwell小室观察HepG2的转移侵袭能力。结果 HIF-1α516 siRNA能显著降低HepG2细胞HIF-1α516mRNA的表达(降低70.0%)(P<0.01);增强HepG2细胞的侵袭转移能力(增强71.10%)(P<0.01)。HIF-1α516siRNA对全细胞HIF-1β蛋白的表达无影响,但能促进HIF-1β蛋白的核转移(增强64.1%)(P<0.01)。HIF-1α516 siRNA能明显升高HepG2细胞培养上清中MMP-2、MMP-9蛋白表达,分别升高37.72%、55.46%(P<0.01)。结论 HIF-1α516能抑制HepG2的转移侵袭,其机制可能与抑制HIF-1β的核转移有关。     

在模拟低氧环境下心肌细胞HIF-1与CT-1的相互作用

目的:研究低氧环境下大鼠心肌细胞系H9C2细胞中HIF-1与CT-1的相互作用。方法:氯化钴(CoCl2)模拟低氧环境。采用CCK-8试剂盒检测心肌细胞存活率。化学合成siRNA片段,并通过li-pofectamine 2 000转染大鼠心肌细胞系H9C2。采用Real-time PCR和Western-blot技术分别检测HIF-1α和CT-1的mRNA和蛋白质水平。结果:低氧处理48h后,干扰组(转染针对HIF-1α的siR-NA的H9C2)中CT-1mRNA和蛋白水平较对照组(转染无义干扰片段的H9C2)明显减少(P<0.05)。低氧3d和4d后,加入CT-1组的心肌细胞存活率较对照组高(P<0.05),HIF-1mRNA表达水平与对照组无显著差异(P>0.05),HIF-1蛋白水平增加。结论:在培养心肌细胞中模拟低氧环境,HIF-1表达减少伴随着CT-1表达减少,加入CT-1后,HIF-1蛋白表达也增加,HIF-1与CT-1相互作用。     

多西他赛对乳腺癌细胞中Cav-1表达及细胞增殖的影响

目的 研究多西他赛对乳腺癌细胞中Cav-1(Cav-1)表达及细胞增殖的影响.方法 通过Real-time PCR和Western-blot检测不同浓度多西他赛作用下乳腺癌细胞MCF-7中Cav-1的表达情况;野生型MCF-7细胞株为对照组,通过基因转染技术建立Cav-1 过表达的MCF-7细胞株(转染组)及空载体的MCF-7细胞株(空载体组),利用CCK-8比色法分析多西他赛对各组细胞增殖的影响.通过Western-blot分别检测多西他赛作用下各组细胞中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达情况以及PI3K/AKT 信号转导通路的活化情况.结果 在5~40 μg/mL浓度范围内,随着多西他赛作用浓度的增大,MCF-7细胞中Cav-1的蛋白表达量逐渐增加.不同浓度多西他赛对MCF-7细胞的增殖均有明显的抑制作用;在同一浓度多西他赛作用下,转染Cav-1组细胞的增殖抑制率明显高于对照组和空载体组(P<0.01).与对照组和空载体组相比,20 μg/mL多西他赛作用后转染组细胞中Bax的表达升高(P<0.01),而Bcl-2的表达降低(P<0.01),并且磷酸化AKT (p-AKT)蛋白的表达水平下降(P<0.01),而对照组和空载体组之间Bax、Bcl-2以及p-AKT蛋白的表达则无明显差异(P>0.05).结论 多西他赛可以通过促进Cav-1的表达影响PI3K/AKT 信号转导通路,进而调节凋亡相关蛋白的表达抑制MCF-7 细胞的增殖.     

短发夹RNA干扰胃癌低氧诱导因子-1α表达及其临床意义

目的 探讨RNA T扰对胃癌细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)转录和蛋白表达的作用以及对胃癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建人HIF-1α基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体并转染胄癌细胞BGC-823;采用RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α mRNA、蛋白表达水平;MTT法检测转染后对胃癌细胞生长的抑制;TUNEL法观察细胞的凋亡情况;流式细胞术分析转染后胃癌细胞的细胞周期和凋亡率.结果 成功构建了pshRNA-HIF-1α1和pshRNA-HIF-1α2重组质粒;转染BGC-823后,与空质粒组相比,pshRNA-HIF-1α1可有效抑制BGC-823细胞HIF-let基因转录和蛋白质表达,抑制率分别可达93.4%和55.7%;MTT法显示转染后细胞生长明显受到抑制;流式细胞术结果表明转染后,其凋亡率明显高于卒质粒绀(P＜0.05),BGC-823细胞增殖活性显著降低,G0～G1期细胞比例明显增加,S期与G2.～M期细胞比例减少;TUNEL法显爪转染后细胞核固缩,核染色质聚集或断裂;体内实验显示,pshRNA-HIF-1α1的抑瘤率为41.75%.结论 体内、外初步实验证实pshRNA-HIF-1α1能有效抑制胃癌细胞BGC-823 HIF-1α基因表达,抑制胃癌细胞增殖,诱导其凋亡.     

HIF-1对人宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在缺氧条件下对宫颈癌SiHa细胞的增殖、生长和凋亡的影响,探讨HIF-1α在宫颈癌的发展过程中所起的作用。方法将表达全长HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α和空质粒pcDNA3.1转染入SiHa细胞中,分别命名为fLHIF-1α组和pcDNA3.1组,未转染细胞组命名为未转染组。应用Western Blotting和免疫细胞化学法对细胞内的HIF-1α和VEGF表达量进行检测。应用MTT方法检测不同浓度的CoCl2处理后细胞的增殖情况;采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡情况。结果免疫细胞化学和Western Blotting结果显示重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α转染成功,转染细胞内HIF-1α及VEGF表达较未转染细胞和质粒pcDNA3.1转染细胞增高(P<0.05),显示在正常或缺氧条件下,fLHIF-1α组细胞的增殖能力均高于pcDNA3.1组和未转染组(P<0.05),凋亡率小于pcDNA3.1组和未转染组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-1α在CoCl2诱导的缺氧条件下可以抑制SiHa细胞的凋亡,减少缺氧对细胞的损伤以及促进细胞的增殖,提示HIF-1α在宫颈癌的发生发展中可能起着重要作用。     

低氧微环境对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及HIF-1α表达的影响

目的观察低氧微环境对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响;探索不同时间梯度和细胞密度在低氧微环境下对HIF-1α表达的影响。方法 (1)构建脑胶质瘤细胞(T98G)生长的缺氧微环境,将细胞设为低氧组(1%氧气含量)和常氧组(21%氧气含量),在不同氧浓度下培养4～72 h后观察细胞生长情况;利用western blot印迹法检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达情况;(2)将低氧组T98G细胞设计为四组不同细胞密度,在1%O2的低氧浓度下培养24 h,通过Western blot检测四组细胞HIF-1α表达情况。结果 (1)倒置显微镜和Hoechest染色均未见低氧组和常氧组细胞发生明显的细胞凋亡,MTT法检测二组细胞均呈增殖状态。与常氧组相比,低氧组细胞HIF-1α蛋白明显高表达(P <0.001)。低氧组细胞在4、6、12、24 h (<24 h) HIF-1α蛋白表达量快速升高(P <0.05),24、48、72 h (> 24 h) HIF-1α蛋白表达量逐渐下降;(2)低氧微环境下四组不同细胞密度中,24 h后高密度组(8.5万个细胞/cm2)细胞的HIF-... 更多     

人低氧诱导因子1α真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达质粒及其在人肝癌细胞(HepG2)中的表达。方法:从HepG2细胞中提取总RNA,通过RT-PCR逆转录,获得HIF-1α的cDNA,双酶切后构建真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证碱基序列。用脂质体法将质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α转染至HepG2,以免疫荧光和Western Blot法分别对转染细胞进行HIF-1α表达分析。结果:扩增出HIF-1α全长cDNA,构建真核表达质粒,测序结果正确。经检测的质粒转染至HepG2细胞后,HIF-1α蛋白水平高于转染空载细胞。结论:成功构建人HIF-1α基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α,并证明其能在HepG2细胞内表达。