Construction of multi-gene eukaryote expression vector and sub-cellular location of its products

目的 构建一种多基因表达载体,实现同一载体单一启动子的调控下表达多个基因以及这些基因在同一细胞不同细胞器中的定位.方法 利用存在于某些病毒核酸序列中的不同2A肽,合成1段包括2个2A肽和不同限制性内切酶位点的多肽序列,形成单一的开放读码框,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)Myc/His(B)相应的多克隆位点中,然后将带有膜定位的红色荧光蛋白(ERFP)、核定位的绿色荧光蛋白(EGFP)和胞浆定位的黄色荧光蛋白(EYFP)顺序插入2A肽之间的位点中,构建多基因真核表达载体pcDNA3.1 RGY.用脂质体转染小鼠成纤维NIH3T3细胞和人肾胚293细胞,利用流式细胞仪、荧光显微镜和共聚焦显微镜检测各种荧光蛋白的表达和亚细胞定位.结果 转染24 h后用流式细胞仪检测,可同时检测到EGFP和ERFP的表达,且两种荧光蛋白的表达率十分接近;荧光显微镜下同时观察到绿色和红色荧光;共聚焦显微镜观察到在单—细胞上同时显示3种荧光,ERFP定位在细胞膜上,EGFP在细胞核中,而EYFP在细胞质中.结论 通过串联方式将多个2A肽和基因置于同一个开放读码框中可实现在同一启动子的调控下表达多个基因.此外,在每个基因序列中加入不同的信号肽序列可将相应基因同时靶向不同的细胞器,实现同一细胞中不同的亚细胞定位.     

带c-Myc标签的Mdfic基因真核表达载体构建及其在成肌细胞中的表达

目的 构建新型转录因子Mdfic和c-Myc标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1-Mdfic-Myc,实现其在成肌细胞C2C12中的表达.方法 PCR方法扩增Mdfic的开放阅读框,酶切后的PCR扩增产物和退火后的人工合成的c-Myc标签共同克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒.重组质粒经过PCR、双酶切和测序鉴定后,脂质体法转染C2C12细胞.RT-PCR和Western blotting方法检测转染后细胞中Mdfic-Myc的表达.结果 成功构建了peDNA-Mdfic-Myc真核表达质粒;RT-PCR和Western blotting结果表明,Mdfic-Myc融合蛋白在成肌细胞C2C12中获得高效表达.结论 pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒的成功构建及其在成肌细胞中的表达为进一步体外研究Mdfic蛋白单独的功能及其与其他分子间功能性相互作用奠定了基础.     

LETM1基因真核表达载体的构建

[目的]构建线粒体LETM1基因真核表达载体．[方法]从肾癌细胞株293T细胞中提取mRNA及合成cDNA,设计并合成线粒体LETM1基因引物,用PCR方法扩增LETM1基因,连接到真核表达载体pCMV-3Tag-6上,构建重组质粒pCMV-3Tag—LETM1,经酶切和测定序列进行鉴定．[结果]构建了重组质粒pCMV-3Tag—LETM1．[结论]成功地构建了线粒体LETM1真核表达载体．     

SPRR1A基因真核荧光表达载体的构建

目的:构建可在真核细胞中表达SPRR1A(small proline-rich repeat protein1A)的荧光表达载体。方法:应用PCR技术扩增出编码SPRR1A的全长基因,将SPRR1A DNA克隆到pEGFP-N1质粒,通过抗性基因筛选阳性克隆,经酶切和测序鉴定。结果:酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与GenBank提供的序列(L05187)一致。结论:成功构建了SPRR1A真核荧光表达载体。     

三叶因子2基因真核表达载体的构建

目的：构建TFF2-pcDNA3．1真核表达载体．方法：应用体外基因拼装方法合成TFF2,然后TA克隆于pGM—T easy载体中．阳性克隆经测序鉴定．再经双酶切消化后,插入真核表达载体pcDNA3．1上,经酶切鉴定与测序证实．结果：合成的TFF2经TA克隆后,筛选得到的阳性克隆,经测序鉴定,与设计的TFF、2基因序列完全一致．经酶切连接并成功插入pcDNA3．1上．结论：成功构建了TFF2基因的真核表达载体,为以后的胃溃疡研究奠定了基础．     

亚细胞定位PTEN基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建人野生型亚细胞定位PTEN基因真核表达载体,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。 方法：以胎盘组织RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的基因片段。PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-PTEN质粒,进行酶切鉴定和测序。以T-PTEN质粒为模板,利用PCR技术将核定位信号（NSL）加入PTEN序列。PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-NSL-PTEN质粒。真核表达载体pcDNA3.1及T-NSL-PTEN质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,转化大肠杆菌,获得重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN,进行酶切和测序鉴定。结果：重组质粒PUM-PTEN酶切在1　200　bp处见目的片段,与预期结果符合。测序结果显示基因序列与目的基因完全一致;重组质粒PUM-NSL-PTEN酶切在1　200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与设计一致,核定位信号成功加入;重组质粒pcDNA3.1-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与目的基因相同;重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN经双酶切和测序证实了其正确性EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切在1　200 bp处见目的片段,与预期结果一致。测序结果显示,核定位信号成功加入,其后是阅读框架正确的PTEN基因序列。结论：成功构建可表达亚细胞定位PTEN的真核表达载体pcDNA3.1-NSL-PTEN。     

小鼠GATA4基因真核表达载体的构建及其在P19细胞中的表达

目的:构建pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体,检测其在P19细胞中的表达.方法:由于GATA4基因的全长编码区的GC含量很高,因此本实验采用分段克隆后PCR拼接的方法获得GATA4基因的全长编码序列,连接入pMD19-T载体,经鉴定正确后亚克隆入pCDNA 3.1A,构建pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体,测序验证无误后,采用脂质体介导法转染至P19细胞,Western blot检测其在P19细胞中的表达.结果:成功扩增小鼠GATA4基因全长编码区,测序证明重组真核表达载体pCDNA3.1A-GATA4构建成功,Western blot确认目的基因在P19细胞中过表达.结论:pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体构建成功,并在P19细胞内过表达,将为研究其在心肌分化、心脏发育中的功能奠定基础.     

PRMT2真核表达载体构建及在乳腺癌MCF7细胞的亚细胞定位

目的 构建携带人蛋白质精氨酸甲基转移酶2(PRMT2)基因的真核表达载体pEGFP-N1-PRMT2,观察其转染乳腺癌MCF7细胞后融合蛋白在细胞中的亚细胞定位,为进一步研究PRMT2基因在乳腺癌中的作用奠定实验基础.方法 以本实验室保存的pGEM-T-PRMT2载体为模板进行聚合酶链反应(PCR)特异扩增PRMT2基因片段,将扩增片段经HindⅢ和Sal Ⅰ双酶切后克隆到pEGFP-N1载体,酶切与测序鉴定阳性克隆;激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在乳腺癌MCF7细胞中的定位.结果 成功构建了pEGFP-N1-PRMT2重组真核表达载体,融合蛋白主要聚集成颗粒状分布于除核仁以外的核浆中,胞质中少量弥散分布.结论 pEGFP-N1-PRMT2重组真核表达载体的构建为进一步研究PRMT2基因在乳腺癌及其内分泌治疗中的作用奠定实验基础.     

RNA干扰Neuropilins-2基因真核表达载体的构建及其鉴定

目的 构建Neuropilins-2(NRP2)基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体.方法 以NRP2为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构件重组体,根据GenBank数据库提供的NRP2基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析.重组pGenSil-NRP2载体转染LOVO细胞48 h,收获细胞,采用Western blotting检测其NRP2蛋白表达.结果 经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体构建成功.重组体pGenSil-NRP2转染LOVO细胞48 h后NRP2蛋白表达显著降低.结论 利用RNAi技术可成功构建抑制NRP2表达的小干扰RNA重组体.     

小鼠Neuronatin基因真核表达载体构建及其蛋白产物的检测

【目的】构建基因Nnat的真核表达载体pEGFP-N1/Nnat并在真核细胞中表达目的蛋白。【方法】RT-PCR法扩增Nnat基因编码区(ORF),利用基因克隆技术构建真核表达载体,酶切及测序进行鉴定;载体构建成功后转染HepG2细胞,观察融合蛋白在细胞中的定位,Western blot检测其在真核细胞中的表达。【结果】RT-PCR法扩增出Nnat基因的两种亚型,相应的双酶切能够获得插入的目的基因片断,测序分析未发现突变;荧光显微镜观察到两种融合蛋白在细胞中分布与EGFP明显不同,融合蛋白主要分布在细胞质中,细胞核中没有表达;Western blot结果可见两条明显的特异条带。【结论】小鼠Nnat基因真核表达载体构建成功,并能在真核细胞中表达出目的蛋白。     

bFGF荧光真核表达载体构建及表达

目的 构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的荧光真核表达载体，以便进一步转染成骨细胞，研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法 应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C3，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况。结果 ①酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性。②荧光显微镜下观察GFP的表达情况，观察到部分经转染的细胞发出绿色荧光；免疫组化检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结论 成功地构建了bFGF荧光真核表达载体pEGFP-C3-bFGF，并在3T3细胞中表达了bFGF。     

pIRES2-AcGFP1-sTRAIL真核表达载体的构建及鉴定

目的利用基因工程技术合成sTRAIL（水溶性TRAIL）基因,并以AcGFP为报告基因,构建针对sTRAIL基因的pIRES2-AcGFP1-sTRAIL重组质粒。方法从人胎盘组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增sTRAIL,并加入XhoI和BamHI酶切位点,通过双酶切将其连接于表达载体pIRES2-AcGFP1,通过PCR、酶切及测序鉴定重组质粒构建的正确性,最后用pIRES2-AcGFP1-sTRAIL重组质粒转染Hela细胞利用倒置荧光显微镜直接观察表达情况。结果酶切、PCR及测序结果证实pIRES2-AcGFP1-sTRAIL构建序列正确。结论利用基因工程技术成功构建真核表达载体pIRES2-AcGFP1-sTRAIL,为后续抗肿瘤研究奠定了基础。     

凋亡抑制基因survivin表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的:克隆细胞凋亡抑制蛋白Survivin(SVV)的编码序列,构建含SVV基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌发病中的作用奠定基础. 方法:根据已发表的SVV基因的核苷酸序列设计并合成一对引物,以HL-60细胞系抽提的RNA为模板进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.0中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.0-SVV和DNA序列测定进行鉴定. 用脂质体法将pcDNA3.0-SVV导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组化法和RT-PCR鉴定其表达. 结果:RT-PCR扩增出长445 bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.0后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致. pcDNA3.0-SVV在HepG2细胞中有稳定表达. 结论:成功克隆了SVV的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.0-SVV,有助于对SVV基因在肝癌发生中的致瘤机制做进一步研究.     

沙眼衣原体热休克蛋白10基因真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

目的从临床标本中获得沙眼衣原体（Ct）热休克蛋白（cHSP）10基因，构建真核表达重组质粒。利用脂质体体外转染Hela细胞，为研究cHSPl0生物学功能和Ct核酸疫苗的研制做准备。方法用PCR技术从40例金标法阳性的临床标本中扩增cHSP10基因片断，重组入pMD18-T克隆载体。将pMD18-T／cHSP10外源基因片断经酶切鉴定后。克隆入pcDNA3．1（＋）中，经过序列分析和酶切鉴定后，运用脂质体将该重组体转染Hela细胞。ELISA方法观察目的基因的表达。结果PCR扩增得到cHSP基因全长。大小为306bp，序列测定与GmxBank（M58027）发布的序列一致；构建得到cHSP10基因真核表达载体；该真核表达载体在Hela细胞表达cHSP10。结论成功构建cHSP10基因真核表达载体，该重组质粒能在Hela细胞中表达cHSP10，为进一步研究cHSP10生物学功能和Ct核酸疫苗的研制提供了实验基础。     

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。     

人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。     

携带FLAG标签的人BTG2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达 

目的：构建人B细胞易位基因2（BTG2）真核表达载体,并在HeLa细胞中表达携带FLAG标签的BTG2蛋白,为阐明BTG2基因的功能提供实验工具。方法：利用PCR法获得全长BTG2片段,将扩增得到的片段插入真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点;然后按照FLAG序列设计并合成寡核苷酸片段,插入pcDNA3.1(+)-BTG2载体,构建pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2载体;将以上重组质粒转染HeLa细胞,将细胞分为转染pcDNA3.1(+)空载体组、转染pcDNA3.1(+)-BTG2组和转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组,采用抗FLAG抗体的Western blotting法,检测FLAG-BTG2融合蛋白在HeLa细胞中的表达水平。结果：将全长BTG2片段链接于pcDNA3.1(+)质粒,经限制性核酸内切酶BamH Ⅰ酶切分析及DNA测序证实载体序列准确;该载体转染HeLa细胞后用抗FLAG 抗体进行Western blotting法检测,在空载体组和pcDNA3.1(+)-BTG2组HeLa细胞中检测不到FLAG融合蛋白的表达,而在转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组中检测到FLAG-BTG2融合蛋白的表达。结论：成功构建了pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2真核表达载体,并能在HeLa细胞中有效表达携带FLAG标签的BTG2蛋白。