人表皮干细胞的分离与鉴定

目的分离人表皮干细胞群并鉴定其相关的分子标记蛋白的表达。方法采用传统方法和快速黏附Ⅳ型胶原的方法分离人正常角质形成细胞群和快速黏附Ⅳ型胶原的人角质形成细胞群,并采用免疫荧光法检测整合素α6,p63蛋白在2种细胞中的表达。结果成功分离了人正常角质细胞群和快速黏附Ⅳ型胶原的人角质形成细胞群;快速黏附Ⅳ型胶原的人角质形成细胞群高表达α6整合素和p63蛋白,与人正常角质细胞群差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究分离的快速黏附Ⅳ型胶原的人角质形成细胞群是富集了人表皮干细胞的细胞群。     

正常人角质形成细胞和黑素细胞体外共培养体系的建立

目的体外建立正常人表皮角质形成细胞和黑素细胞直接接触的共培养体系。方法分别培养角质形成细胞和黑素细胞,体外建立角质形成细胞和黑素细胞直接接触的共培养模型,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、紫外分光光度计检测、左旋多巴(L-Dopa)染色、免疫组织化学染色及透射电镜观察对共培养体系中的黑素细胞和角质形成细胞进行生物学鉴定。结果单独培养时,角质形成细胞呈圆形、"铺路石样"生长,黑素细胞呈两极或多级树突状生长;角质形成细胞和黑素细胞按一定比例混合培养后,2种细胞均迅速增殖,黑素细胞树突多为3～5个,与数十个角质形成细胞呈团块状生长,形成类似黑素单元的结构。共培养体系中的黑素细胞和角质形成细胞具备正常的生物学功能。结论角质形成细胞和黑素细胞直接接触的共培养体系为黑素细胞提供了更接近生理状态的体外研究模型。     

中波紫外线辐射角质形成细胞核因子κB和P53信号通路的交互作用

目的 研究中波紫外线（UVB）辐射对表皮角质形成细胞核因子κB（NF—κB）和P53信号通路的影响以及NF-κB和P53信号通路的交互作用。方法 正常人表皮角质形成细胞（NHEK）（含野生型p53）和永生化人角质形成细胞株HaCaT（含突变型p53）各分2组于37℃、5％CO2环境培养。当细胞融合达85％时进行UVB（60mJ／cm^2）辐射,其中1组于辐射前1h加入终浓度为5μmol／L具有抗NF-κB活化作用的BAY11-7082。分别提取辐射前后NHEK和HaCaT细胞蛋白和核蛋白,应用Western印迹检测NF-KB、P53和P21蛋白的表达水平,应用电泳迁移变更分析（EMSA）检测NF-κB的转录情况。结果 UVB辐射可激活NHEK和HaCaT的NF-κB、P53和P21的蛋白表达和NF-κB的转录活性。BAY11-7082对NHEK和HaCaT的NF-κB的转录活性均具有显著的抑制作用。作为NF-κB的抑制剂,BAY11-7082还显著抑制了NHEK的P53和P21的蛋白表达（P53：0．08±0．07vs0．78±0．32,P〈0．01;P21：0．65±0．22vs1．58±0．77,P〈0．05）,但不影响HaCaT的P53和P21的蛋白表达。结论 UVB辐射激活表皮角质形成细胞的NF—κB和P53信号通路存在交互作用,这种交互作用与P53功能状况相关。     

成体表皮干细胞的分离培养与鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法。方法:运用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮干细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况;检测细胞克隆形成率及克隆维持时间;免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达。以角质形成细胞作为对照。结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞组;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及K19均呈阳性表达。结论:成体表皮干细胞在体外得到成功分离与培养。     

中波紫外线的对角朊细胞合成SCF的作用

目的：研究中波紫外线对培养的角朊细胞合成干细胞因子的调节作用,阐明中波紫外线通过对角朊细胞分泌干细胞因子的调节而对黑素细胞的间接调控作用。方法：培养人角朊细胞,以中波紫外线（302nm,100mJ/cm^2）进行照射,采用原位杂交法测定干细胞因子的mRNA表达水平,采用免疫组化法测定干细胞因子在细胞内的蛋白合成水平。结果：正常皮肤表皮基底层和棘层的角朊细胞可合成SCF;UVB照射后细胞内SCFmRNA表达量增加,但未见蛋白合成的增加。结论：实验结果提示SCF可能参与UVB照射引起的皮肤色素沉着,并减少UVB引起的黑素细胞的损伤及凋亡,维持皮肤内黑素细胞的数量稳定。     

中波紫外线对人角质形成细胞分泌白介素-8的影响

目的　探讨中波紫外线 (UVB)对人角质形成细胞 (HKC)分泌白介素 - 8(IL - 8)的影响。方法　采用不同强度的 U VB照射体外培养的 HKC,2 4 h后用 EL ISA法检测上清液中 IL - 8的质量浓度 ;以及在相同强度UVB照射后的不同时间点检测 HKC分泌 IL - 8的水平。结果　 U VB照射可使 HKC分泌 IL - 8增加 ,该效应在 10～4 0 m J/ cm2 时呈强度依赖性 ,UVB强度为 2 0～ 70 m J/ cm2 时各组 IL - 8质量浓度与对照组 (0 m J/ cm2 )比较差异有显著性 (P<0 .0 1)。 HKC接受 30 m J/ cm2 U VB照射后 ,其 IL - 8的分泌在 1h内开始增加 ,12 h达到高峰 ;照射后 3h、6 h、12 h、2 4 h时 HKC分泌 IL - 8的水平与 0 h时比较差异有显著性 (P<0 .0 1)。结论　 U VB可使 HKC IL - 8分泌增加 ,该效应在一定范围内呈强度依赖性。     

表皮生长因子受体反义寡核苷酸对紫外线诱导的表皮角质形成细胞c-jun 活性的影响

目的探讨表皮生长因子受体（EGF-R）反义寡核苷酸转染体外培养的表皮角质形成细胞株HaCaT后,对紫外线诱导的表皮角质形成细胞转录因子c-jun活性的影响。方法用一种高灵敏度、高特异性的比色法测定不同剂量中波紫外线（UVB）辐射后以及EGF-R反义寡核苷酸转染后紫外线辐射的角质形成细胞c-jun活性的变化;RT-PCR方法测定EGF-R反义寡核苷酸转染后EGF-RmRNA的表达。结果10、20、30mJ/cm^2 UVB辐射角质形成细胞后均可显著增强c-jun活性（P〈0.05）,不同浓度的EGF-R反义寡核苷酸转染后对30mJ/cm^2 UVB诱导的EGF-RmRNA表达和c-jun活性均有显著抑制作用（P〈0.01）。结论脂质体介导的EGF-R反义寡核苷酸转染表皮角质形成细胞可以抑制UVB辐射诱导的表皮角质形成细胞c-jun活性,表明紫外线诱导角质形成细胞c-jun激活是通过EGF-R介导的。     

依曲替酸和窄谱中波紫外线对正常人角质形成细胞维甲酸受体γmRNA表达的协同影响

目的 研究依曲替酸和窄谱中波紫外线(NB-UVB)对培养的正常人角质形成细胞(KC)增殖和维甲酸受体γ(RARγ)mRNA表达的影响.方法 用10-6mol/L依曲替酸和/或100mJ/cm2NB-UVB处理正常人KC后,继续培养12h,用RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR法分别检测KC增殖和RARγmRNA表达的改变.结果 10-6mol/L依曲替酸或100mJ/cm2NB-UVB处理后12 h,KC的增殖均受抑制,抑制率分别为8.7%和14.4%,二者联合作用时,对KC的增殖抑制作用最强,抑制率为19.7%.正常人KC可表达一定量的RARγmRNA,10-6mol/L依曲替酸处理后,RARγmRNA的表达增高至正常对照组的2.3倍,100 mJ/cm2NB-UVB照射对RARγmRNA的表达无明显影响,为正常对照组的0.9倍,二者联合作用时,对RARγmRNA的表达诱导作用最强,为正常对照组的2.8倍.结论 依曲替酸和NB-UVB可协同诱导RARγmRNA表达,并可能参与介导二者对KC增殖的抑制作用.     

银屑病患者外周血单个核细胞对自身角质形成细胞的促生长作用

目的：了解银屑病患外周血单个核细胞（PBMCs)对自体表皮角质形成细胞（KCs）增生的作用。方法：分离3例银屑病患的PBMCs,经30Gy钴照射后与来自同一患的KCs进行混合培养,观察KCs增生代谢方面的变化。结果：经过混合培养,来自银屑病患皮损和皮损周围未受累皮肤的KCs在自体的PBMCs作用下均发生快速增生反应。结论：表皮KCs与浸润炎性细胞的相互作用可能诱发KCs的过度增生,在银屑病发病机制中发挥重要作用。     

人表皮角质形成细胞Toll样受体表达

目的 研究人表皮角质形成细胞Toll样受体表达谱.方法 培养人永生化角质形成细胞系HaCaT细胞和正常人表皮角质形成细胞(NHEK),采用分散酶分离表皮.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测10种Toll样受体mRNA表达,流式细胞仪检测HaCaT细胞和NHEK表面Toll样受体2和4蛋白的表达.结果 HaCaT细胞、NHEK以及分离的表皮均有全部10种Toll样受体mRNA表达,其表达强弱各不相同.流式细胞仪检测显示HaCaT细胞和NHEK表面有Toll样受体4蛋白的表达,而Toll样受体2无明显表达.结论 人表皮角质形成细胞中有Toll样受体1～10 mRNA的组成性表达.     

UVB对HaCaT细胞凋亡的影响

①目的　探讨紫外线B(UVB)对HaCaT细胞凋亡的影响及其作用机制。②方法　取培养的HaCaT细胞 ,用 30mJ/cm2 的UVB照射后继续培养 18h ,以流式细胞术检测细胞的凋亡率、线粒体膜电位和细胞内游离Ca2 +水平 ,用透射电镜观察细胞的超微结构。③结果　UVB照射增加了HaCaT细胞的凋亡率 (t =5 .2 36 ,P <0 .0 1) ,降低了线粒体膜电位 (t=6 .897,P <0 .0 1) ,升高了细胞内游离Ca2 + 水平 (t =6 .0 4 6 ,P <0 .0 1)。细胞的超微结构因UVB照射而遭到严重破坏 ,胞浆内的细胞器大量减少 ,线粒体严重空泡化 ,髓样小体形成 ,核内染色质成块并边聚。④结论　线粒体膜电位的下降和胞内游离Ca2 + 的升高可能参与了UVB诱发HaCaT细胞凋亡的过程     

SSA/Ro antigen expressed on membrane of UVB-induced apoptotic keratinocytes is pathogenic but not detectable in supernatant of cell culture

ＯｂｊｅｃｔｉｖｅｓＴｏｂｅｔｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｅｆｅｃｔｏｆｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｌｉｇｈｔｏｎｔｈｅｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｌｕｐｕｓｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ（ＬＥ）,ｔｏｅｌｕ...     

IL-1α and ATP mRNA expression after ultraviolet irradiation in human keratinocyte original-SCC 12F cells

Background Generally speaking, undifferentiated keratinocytes may synthesize a larger amount of IL-α and its production is decreased as cells complete differentiation gradually. Ultraviolet B (UVB)light can signigicantly stimulate the production and release of some cytokines. In this study we investigated the influence of UVB irradiation on IL-1α and adenosine triphosphoric (ATP) mRNA expressions in the human keratinocyte (KC) of original squamous cell carcinoma line (SCC 12F cells).Methods The cultured SCC 12F cells were irradiated with 30 mJ/cm^2 of UVB. Northern blot was employed to analyze the expression of IL-1α and ATP mRNA.Results There was a constitutive expression of IL-1α mRNA in SCC 12F cells. The expression increased in culturing time in regular KC medium and reached the highest expression at 120 hours.The expression level of IL-1α was up-regulated with two peaks at 6 hours and 72 hours, respectively after UVB irradiation. In comparison with IL-1α mRNA expression, ATP mRNA was down-regulated,with similar biphasic peaks, compared with the sham irradiated group.Conclusions SCC12F cells may express IL-1α mRNA constitutively. After UVB irradiation, the mRNA expression of IL-1α and ATP will show opposite effect because of inflammation/immunity and energy consumption mechanisms.     

The expression of P63 protein in some keratinocyte original tissues and cells

Objective： To examine the expression patterns of p63 in tissues of particular keratinocyte original hyperproliferate diseases and variety cell types for determining if P63 is the marker of proliferative potential keratinocytes. Methods： P63 protein was detected and analyzed by immunoreactivity method and Western blot in biopsy specimens of keratinocyte original disorders including squamous cell carcinomas SCC, basal cell carcinomas BCC, Bowen＇ s disease and other tissues or cells, such as psoriasis vulgaris, normal skin tissues, primary cultured keratinocytes, immortal HaCaT cells, and epidermoid carcinoma cells A431. Results： P63 protein was expressed in the nuclei of basal and suprabasal layer of the epidermis, germinative cells of sebaceous glands in normal epidermal. P63 was strongly and diffusely detected in the majority of tumor cells in BCC and poorly-differentiated SCC. In Bowen＇ s disease, p63 expresses are remarkable in all cell layers. In the psoriasis plaque epidermal, p63 expressed mainly in basal cells and part of spinous cells. P63 expressed more strongly in primary cultured keratinocytes than in A431 cells or HaCaT cells. Conclusion： P63 is a nuclei marker of undifferentiated keratinocytes with the proliferative potential and may disrupt the terminal differentiation. The overexpression of p63 reflects immaturity of the tumor cells. The immunohistochemical staining of p63 may be useful for investigating the origin and differentiation of tumor cells.[第一段]     

中波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞衰老及机制研究

目的 探讨中波紫外线（UVB）对人皮肤成纤维细胞的诱导衰老作用及可能机制.方法 使用组织块法分离培养原代人皮肤成纤维细胞,通过观察不同剂量UVB照射后的细胞形态学改变以及β-半乳糖苷酶（p-gal）细胞衰老染色情况,确定后续实验诱导皮肤成纤维细胞衰老的UVB单次照射剂量.于经确定剂量UVB照射后的不同时点（12、24、48、72 h）收集细胞及其细胞培养上清液,Western blotting检测诱导衰老的皮肤成纤维细胞衰老相关蛋白P16表达;ELISA法检测诱导衰老细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及基质金属蛋白酶1、3（MMP1、MMP3）表达.结果 经40 mJ/cm2 UVB单次照射的人皮肤成纤维细胞呈现典型的衰老细胞形态学改变,β-gal细胞衰老染色阳性细胞百分比为（88.75±5.32）%,确定诱导衰老UVB单次照射剂量为40 mJ/cm2.Western blotting显示,诱导衰老皮肤成纤维细胞P16蛋白表达随UVB照射时间的延长而明显升高;ELISA法检测发现诱导衰老细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达随UVB照射时间的延长而明显减少,MMP1和MMP3表达则随UVB照射时间的延长而显著增加.结论 UVB照射能诱导人皮肤成纤维细胞发生衰老,其机制可能与细胞胶原合成减少而降解增加有关.     

Investigation on etretin effects on expression of Fas／FasL ligand and apoptosis in cultured human keratinocytes

Objective: To further illuminate a possibme mechanism of Fas/FasL in the treatment of psoriasis, the expression of it and apoptosis of KC were investigated. Methods: With cell culmre,immunocytochemistly, the expression of Fas/FasL protein after the treatment with etretin was observed in cultured human normal keratinocytes. Then, the state of apoptosis in cultured keratinocyte after stimulation with etretin was detected with FACS(Fluorescence Activited Cell Sortor). Results:(1) There was no expression of Fas/FasL protein in the cultured normal human KC. (2)After the treatment with etretin, the strongest expression of FasL protein appeared after 16h, so did Fas after 4Oh. (3) The higher the concentration of etretin, the stronger the expression of Fas/FasL protien. Under the same condition, the expression of Fas is stronger than that of FasL. (4) Keratinocytes‘ apoptosis occurred after stimulation with etretin. Conclusion: Fas/FasL system wasn‘ t involved in apoptosis in cultured normol human keratinocytes. But during limited period, the apoptosis of KC could be induced by etretin, thus it can antagonize benign proliferate of keratinocytes. Our data showed up-regulation of the expression of Fas/FasL and apoptosis in cultured human keratinocytes stimulated by etretin, and its function may be involved in the therapeutic machanism of psoriasis.     

人胚胎干细胞分化为角质形成细胞过程中标志物的表达特点

目的：诱导人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）定向分化为角质形成细胞K-hESCs（keratinocyte derived from human embryonic stem cells）, 并分析诱导过程中K-hESCs不同标志物的表达特点。方法：运用含骨形成蛋白4、维甲酸和N2添加剂的上皮分化培养基直接诱导hESCs分化为K- hESCs,通过染色体核型分析检测K-hESCs核型,通过实时定量PCR检测K-hESCs在分化的不同时期基因的表达及其与原代人牙龈上皮细胞（human gingival epithelial cells,HGECs）、人永生化口腔上皮细胞（human immortalized oral epithelial cells,HIOECs）、人永生化皮肤角质形成细胞HaCaT的基因表达差异;利用免疫组织化学检测不同标志物在K-hESCs的蛋白表达。结果：运用上皮分化培养基成功地诱导hESCs分化为上皮样细胞K-hESCs; K-hESCs核型具有正常46条染色体,无结构异常;K-hESCs中角质形成细胞标志物基因p63的表达明显低于HaCaT细胞（P<0.05）,而与HGECs和HIOECs中的表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论：运用上皮分化培养基可成功诱导hESCs分化为具有正常核型的K-hESCs;标志物的表达特点提示诱导hESCs分化为K-hESCs的过程是从hESCs向单层上皮干细胞分化继而转向复层上皮终末分化发展的趋势,最终得到的K-hESCs类似于单层鳞状上皮干细胞向终末分化初始阶段的角质形成细胞,该阶段的细胞由上皮干细胞静止状态被激活,处于分化初始高增殖活力阶段。     

胎牛血清促进色素上皮衍生因子在皮肤角质形成细胞和成纤维细胞中的表达

目的:探讨表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中色素上皮衍生因子(PEDF) 表达的影响因素.方法:体外培养角质形成细胞和成纤维细胞,并以10%FBS(胎牛血清)刺激,通过免疫荧光和Western blot检测PEDF的表达.结果:PEDF大多位于细胞浆中,但在细胞核中也有少量表达.细胞浆中PEDF并非均质型分布,而是呈细颗粒状集聚.10%FBS促进角质形成细胞和成纤维细胞中PEDF的集聚和表达,而且这一分布形式不受组胺和佛波肉豆蔻醋酸(PMA) 的影响.结论:10% FBS促进角质形成细胞和成纤维细胞中PEDF的集聚和表达.     

Low concentrations of interferon-gamma stimulate DNA synthesis in normal human keratinocytes during the initial stages of cultivation

High concentrations of interferons can inhibit keratinocyte proliferation and induce the expression of HLA-DR antigen on keratinocytes. In the present study, the effects of low concentrations of recombinant human interferon alpha, beta and gamma were examined on DNA synthesis and the expression of HLA-DR and bullous pemphigoid (BP) antigens in normal human keratinocytes. Low concentrations of interferons induced DNA synthesis in normal human keratinocytes when epidermal cell growth factor and low Ca++ were used during the initial stages of culturing. This result indicates that physiological concentrations of interferons can induce keratinocyte activation.     

Omega-3多不饱和脂肪酸对角化细胞及成纤维细胞的作用

目的 观察Omega 3多不饱和脂肪酸对人表皮角化细胞增殖和人皮肤成纤维细胞分化的作用.方法 体外培养人表皮角化细胞和人皮肤成纤维细胞,用不同浓度Omega-3多不饱和脂肪酸(EPA)干预角化细胞,BrdU法测角化细胞增殖;不同浓度EPA干预成纤维细胞,ELISA法检测a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)及人胶原蛋白1的表达;MTT法观察EPA对成纤维细胞活性的影响.结果 EPA浓度在200 μmol/L时,对人表皮角化细胞有明显的促增殖作用,显著提高成纤维细胞培养液中a-SMA的表达,降低人胶原蛋白1的表达.结论 EPA可能通过促进角化细胞增殖、诱导成纤维细胞分化改善伤口愈合.