应用噬菌体随机十二肽库筛选hFGF 7相关模拟肽

目的应用噬菌体随机十二肽库生物淘选具有刺激表皮细胞增殖作用的人成纤维细胞生长因子 7(hFGF 7)噬菌体模拟肽。方法以hFGF 7单克隆抗体为靶,进行4轮生物淘选噬菌体随机十二肽库;随机挑取单克隆噬菌体,应用ELISA方法检测单克隆噬菌体的结合力,对结合力较好的单克隆噬菌体提取噬菌体DNA,进行测序,并行序列分析。结果经过4轮生物淘选,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,ELISA检测结果显示获得的一些噬菌体模拟肽具有较好的结合力,测序获得11个与促进细胞分裂、增殖或抑制细胞增殖有关的碱基序列。结论从噬菌体随机十二肽库中可淘选到与hFGF 7相关的噬菌体模拟肽,其中部分噬菌体模拟肽可能会促进表皮细胞增殖,期望将来可应用于促进创面愈合。     

淫羊藿苷通过增强 Fas-FasL 表达活性诱导裸鼠食管癌细胞凋亡

目的：探讨淫羊藿苷（icariin ,ICA ）对裸鼠体内食管癌移植瘤生长的抑制作用,并初步探讨其机制。方法应用M T T方法和Giemsa染色法检测和观察ICA对食管癌细胞Eca‐109和 T E‐13的体外抑制作用。构建裸鼠的食管癌细胞移植性肿瘤模型,分为3组,每组6只。实验组每只裸鼠腹腔注射50 mg／kg ICA ,对照组注射相同体积的生理盐水,阳性对照组腹腔注射2 mg／kg顺铂,每2天1次,共14 d ,每3天测量肿瘤体积,实验结束后称量肿瘤质量;TUNEL染色法观察各组裸鼠肿瘤组织的组织形态变化和凋亡情况;免疫组织化学法对肿瘤组织中 Fas和 FasL蛋白的表达变化进行分析。ELISA 法检测外周血中FasL和IFN‐γ的水平。结果 ICA体外对食管癌细胞Eca‐109和T E‐13的增殖无明显的抑制作用。实验组和阳性对照组裸鼠肿瘤平均体积和质量与对照组比较,差异均有统计学意义（P＜0．05）。TUNEL染色法结果显示,实验组裸鼠的肿瘤组织发生了明显的凋亡,凋亡细胞的数量较对照组明显增加（P＜0．05）。免疫组织化学实验结果表明,与对照组相比,实验组裸鼠肿瘤组织中Fas、FasL的表达明显增加（P＜0．05）。ELISA实验结果显示,实验组裸鼠外周血中FasL和IFN‐γ的水平较对照组明显增高（P＜0．05）。结论 ICA体外对食管癌细胞无明显增殖抑制作用,但是通过Fas的表达、FasL和IFN‐γ的分泌在体内诱导食管癌细胞凋亡,从而发挥抗食管癌的作用。     

Application of laser capture microdissection in screening phage-display peptide library from osteosarcoma tissues]

OBJECTIVE: To establish a novel approach by using laser capture microdissection (LCM) for phage-display peptide library screening and direct recovery of the peptides specifically bound to the cells from fresh human tissue. METHODS: Fresh human osteosarcoma (OS) tissue specimens obtained from biopsy were incubated in phage peptide library solution, followed by shaking at 4 degrees celsius and subsequent preparation of frozen sections. Immunohistochemistry was employed to examine the infiltration of the phage in the tissues. After modification to improve the viability of the phage during the operation, LCM was used to isolate the targeted tumor cells that specifically bound the phage peptides. The phage was then recovered by transfecting the host bacteria, and the specificity of the selected phage was assessed by calculating the recovered phage transfection unit on different tissue sections. RESULTS: Enough phages that specifically bound to tumor cells were recovered from the sections. After three rounds of screening, the eluted phage showed up to 16-fold selectivity for OS tissue. CONCLUSION: Application of LCM makes it possible to screen phage display peptide library directly from fresh human tissue. Specific cell-binding peptides can be selected directly from fresh human tumor cells in their native tissue environment at the single cell level.     

血管内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原在肾内的表达

对１４例肾透明细胞癌及炎症区、正常肾组织的血管内皮细胞进行了第Ⅷ因子相关抗原的免疫组化研究。结果表明：血管数明显增多、Ⅷ因子染色最强的是炎症区的血管，而不是肿瘤间质血管。因此，以其做为诊断恶性肿瘤的辅助条件是不可靠的。     

Keratinocyte growth factor (KGF) phage model peptides can promote epidermal cell proliferation without tumorigenic effect

Background KGF significantly influences epithelial wound healing. The aim of this study was to isolate KGF phage model peptides from a phage display 7-mer peptide library to evaluate their effect on promoting epidermal cell proliferation. Methods A phage display 7-mer peptide library was screened using monoclonal anti-human KGF antibody as the target. ELISA was performed to select monoclonal phages with good binding activity. DNA sequencing was done to find the similarities of model peptides. MTT assay, immunofluorescence assay and quantitative real-time PCR analysis were employed to evaluate the effect of the phage model peptides on epidermal cells. Results 56.9% (33/58) of the isolated monoclonal phages exhibited high binding activity by ELISA. Ten of fifteen obtained phage model peptides were similar to KGF or EGF. MTT assay data showed that four (No.1-4) of the ten phage model peptides could promote epidermal cell proliferation. The expression of keratinocyte growth factor receptor (KGFR) mRNA in the KGF control group and the two phage model peptide groups (No.1 and No.2) increased. Expression of c-Fos mRNA and c-Jun mRNA in the KGF control group increased, but did not increase in the four phage model peptide groups (No.1-4). Conclusions Four phage model peptides isolated from the phage display 7-mer peptide library can safely promote epidermal cell proliferation without tumorigenic effect.     

人骨肉瘤细胞特异性结合肽的筛选及验证

目的获得人骨肉瘤细胞MG63特异性结合肽,为骨肉瘤靶向治疗奠定基础。方法应用噬菌体展示技术,以人骨肉瘤细胞作为靶细胞,293T细胞为差减细胞,筛选获得MG-63细胞特异性结合肽。酶联免疫法进行靶向性验证。应用荧光染色技术初步探讨短肽细胞受体位置。制作人骨肉瘤模型,尾静脉注射目标噬菌体,免疫组化检测其靶向性。结果经过四轮一步有机相离心分离方法,获得了与骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,并测序获得其中出现次数最多的序列SLTNLSK,靶向验证结果显示该短肽有较强的特异性。结论应用噬菌体展示技术,获得了与人骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,序列为SLTNLSK,并验证了其靶向性。可以作为骨肉瘤靶向治疗的导向性化合物。     

短肽库中血管内皮细胞生长因子受体Flt-1拮抗剂筛选条件的改进

目的:改进噬菌体肽库的筛选条件,提高筛选阳性率及阳性克隆重复性.使血管内皮细胞生长因子受体Flt-1拮抗剂的筛选更为有效.方法:通过对血管内皮细胞生长因子受体Flt-1的原核表达产物的变性复性处理,获得相对纯化的可溶性Flt-1受体.将该可溶性受体固相化,对噬菌体表达12肽库进行4 ～ 5轮Bio-panning后,挑取单个噬菌斑制备高滴度噬菌体上清.用ELISA法初步鉴定各噬菌体克隆与sFlt-1的特异性结合并测定阳性克隆的DN A 顺序.在Bio-panning过程中增加非特异性蛋白的预吸附,并减少输入噬菌体数量, 再次筛选短肽库.结果:经过第一次筛选,获得了一系列具有一定重复性与同源性的噬菌体克隆. 改进筛选条件后,筛选阳性率由2%提高到8.3%,阳性克隆的重复性也得到显著提高.该高重复阳性克隆的氨基酸顺序与前一次筛选获得的阳性克隆有较高同源性.结论:Bio-panning 条件的改进提高了筛选效率,为不纯蛋白筛选短肽库积累了经验,并为血管内皮细胞生长因子受体拮抗剂的研制奠定了基础.     

Keratinocyte growth factor phage model peptides can promote epidermal cell proliferation without tumorigenic effect

Background Keratinocyte growth factor （KGF） significantly influences epithelial wound healing. The aim of this study was to isolate KGF phage model peptides from a phage display 7-mer peptide library to evaluate their effect on promoting epidermal cell proliferation. Methods A phage display 7-mer peptide library was screened using monoclonal anti-human KGF antibody as the target. Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was performed to select monoclonal phages with good binding activity. DNA sequencing was done to find the similarities of model peptides. Three-（4,5-dimethylthiazol-2-yl） -2,5-diphenyl tetrazolium bromide （MTT） assay, immunofluorescence assay and quantitative real-time PCR analysis were employed to evaluate the effect of the phage model peptides on epidermal cells. Results Thirty-three out of fifty-eight （56.9%） of the isolated monoclonal phages exhibited high binding activity by ELISA. Ten of fifteen obtained phage model peptides were similar to KGF or epidermal growth factor （EGF）. MTT assay data showed that four （No. 1-4） of the ten phage model peptides could promote epidermal cell proliferation. The expression of keratinocyte growth factor receptor （KGFR） mRNA in the KGF control group and the two phage model peptide groups （No. 1 and No. 2） increased. Expression of c-Fos mRNA and c-Jun mRNA in the KGF control group increased, but did not increase in the four phage model peptide groups （No.1-4）. Conclusion Four phage model peptides isolated from the phage display 7-mer peptide library can safely promote epidermal cell proliferation without tumorigenic effect.     

人源性食管癌移植瘤模型的建立、评价及其应用的初步研究

目的用,晦床新鲜肿瘤组织移植于免疫缺陷小鼠以建立人源性食管癌移植瘤模型并初步评估其应用性。方法将36例食管癌手术切除组织分别移植于SCID小鼠皮下,待移植瘤长成后对其进行裸鼠间连续传代。当每例模型的移植瘤体积生长至500-1000mm3时,收集肿瘤组织作4种处理,一部分继续用于鼠间传代,一部分组织冻存于液氮中用于将来肿瘤组织复苏模型重建,一部分组织作速冻处理用于DNA／RNA提取,一部分组织固定于福尔马林溶液中作石蜡包埋和HE染色用于病理学研究。选用其中4例模型ESX00l、Esx002、ESX003和ESX004进行体外药敏实验和体内药效实验以评价4例人源性食管癌移植瘤对常用抗肿瘤药物的敏感性。结果36例食管癌手术切除组织接种和传代,成功23例,成功率为63．89％。异种移植瘤生长稳定并能连续传代,各代移植瘤组织形态学特征与患者肿瘤组织一致。23例液氮保存的人源食管癌移植瘤组织复苏后移植于SCID小鼠皮下,21例成功生长肿瘤,复苏成功率为91．30％。体外药敏实验表明4例人食管癌模型对临床上常用的抗肿瘤药物索拉非尼（Sorafenib）、5-氟尿嘧啶（5．Fu）、阿霉素（Doxorubicin）、特罗凯（Tarceva）、和伊立替康（Irinotecan）敏感;对多西紫杉醇（Docetaxel）敏感性存在病例差异,其中ESX003和ESX004对多西紫杉醇无反应。体内药效实验表明Irinotecan在100mg／kg剂量下对4例人食管癌裸鼠移植瘤模型有较强的抑制作用,相对肿瘤增殖率分别为22．02％、39．63％、21．69％和39．70％。结论成功建立了人源性食管癌小鼠移植瘤模型,移植瘤保留了,临床食管癌的病理特征。冻存的肿瘤组织,经复苏后仍可建立小鼠移植瘤模型,提示本研究建立的人源性食管癌移植瘤模型具有可持续应用性。4例人源性食管癌移植瘤模型的体外药敏实验和体内药效实验均表明人源性食管癌移植瘤模型具有很好的应用价值,可用于抗肿瘤药物的筛选及转化医学研究。     

与胃癌腹膜高转移细胞表面受体特异性结合的多肽片段的研究

目的利用噬菌体随机肽库筛选与胃癌腹膜高转移细胞特异性结合的多肽,为肿瘤细胞的靶向性治疗筛选药物和载体。方法利用噬菌体随机十二肽库对人胃癌细胞系GC9811和其腹膜高转移亚系GC9811P进行3轮差异筛选、富集,获得与胃癌腹膜高转移细胞亲和的噬菌体克隆。酶联免疫吸附实验(ELISA)测定其与GC9811P和GC9811细胞的亲和力,提取阳性噬菌体DNA并进行DNA序列测定,获得与胃癌腹膜高转移细胞亲和的多肽序列并予合成。利用荧光染色和流式细胞仪鉴定噬菌体克隆和合成肽与胃癌腹膜高转移细胞的体内外的结合特异性。结果筛选及ELISA结果显示得到与GC9811P细胞特异性结合并内化入癌细胞的噬菌体克隆,测序结果示45%的被检噬菌体展示相同的多肽序列SMSIASPYIALE,推测SMSI是胃癌腹膜高转移细胞特异性结合肽的基序。合成的多肽与细胞共孵育48h或多肽药物浓度达5μmol/L时,显示出明显的结合能力。平均荧光强度分别为17.19±0.42和16.89±0.31(每组实验为3个样本均值),与对照组无关肽PC的平均荧光强度(4.33±0.53)比较,差异有统计学意义(P<0.01)。合成的多肽与细胞共孵育72h或多肽药物浓度达10μmol/L时细胞的平均荧光强度为23.58±0.71和24.95±0.15(每组实验为3个样本均值),与对照组无关肽PC的平均荧光强度(4.16±0.24)比较,差异有统计学意义(P<0.01)。裸鼠体内试验说明合成的多肽可与GC9811P细胞成瘤的组织结合而不与GC9811及其他细胞成瘤的组织结合。结论筛选噬菌体随机肽库获得能与胃癌腹膜高转移细胞特异性结合的多肽序列SMSIASPYIALE;合成的多肽与胃癌腹膜高转移细胞有特异亲和力,为进一步临床胃癌早期腹膜转移诊断和治疗提供高度特异性和敏感性的理想标志物和靶向载体。     

靶向CXCR4的siRNA对人食管鳞癌EC9706细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的 探讨CXCR4 siRNA对人食管鳞癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 建立人食管鳞癌细胞株EC9706裸鼠移植瘤动物模型,瘤旁注射化学合成CXCR4 siRNA,同时以瘤旁注射阴性对照siRNA和PBS为对照.监测肿瘤生长变化,测量瘤质量.HE染色观察肿瘤病理学变化,RT-PCR、免疫组化方法检测CXCR4 mRNA和蛋白变化.结果 裸鼠体内实验结果显示,与对照组比较,CXCR4 siRNA组肿瘤生长受到明显抑制,瘤质量下降;HE染色显示对照组肿瘤体积大、异形明显;RT-PCR、免疫组化结果表明CXCR4 siRNA处理组CXCR4 mRNA和蛋白表达下调.结论 CXCR4 siRNA能抑制人食管鳞癌EC9706细胞株裸鼠皮下移植瘤的形成,且能在体内有效下调CXCR4 mRNA和蛋白的表达.     

Transforming growth factor-β1 phage model peptides isolated from a phage display 7-mer peptide library can inhibit the activity of keloid fibroblasts

Background Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) is known to have a role in keloid formation through the activation of fibroblasts and the acceleration of collagen deposition. The objective of this current study was to isolate TGF-β1 phage model peptides from a phage display 7-mer peptide library to evaluate their therapeutic effect on inhibiting the activity of keloid fibroblasts.Methods A phage display 7-mer peptide library was screened using monoclonal anti-human TGF-β1 as the target to obtain specific phages containing ectogenous model peptides similar to TGF-β1. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to select monoclonal phages with good binding activity, which underwent DNA sequencing. MTT assay and apoptosis assessment were used to evaluate the biological effects of the phage model peptides on keloid fibroblasts. Immunofluorescence assay was employed to show the binding affinity of the model peptides on phages causing keloid fibroblasts. Quantitative real-time PCR analysis was carried out to detect the expressions of nuclear factor κB (NF-κB) mRNA, connective tissue growth factor (CTGF) mRNA and TGF-β receptor Ⅱ (TβRII) mRNA in keloid fibroblasts.Results Specific phages with good results of ELISA were beneficiated. Four phage model peptides were obtained. The data of MTT showed that TGF-β1 and one phage model peptide (No. 4) could promote keloid fibroblasts proliferation,however, three phage model peptides (No. 1-3) could inhibit keloid fibroblasts proliferation. The results of apoptosis assessment showed that the three phage model peptides could slightly induce the apoptosis in keloid fibroblasts. The data of immunofluorescence assay revealed that the model peptides on phages rather than phages could bind to keloid fibroblasts. The findings of quantitative real-time PCR analysis suggested that the expressions of NF-κB mRNA and CTGF mRNA in the three phage model peptide groups decreased, while the expression of TβRII mRNA slightly increased.Conclusions Three phage model peptides isolated from a phage display 7-mer peptide library can inhibit keloid fibroblasts proliferation and induce the apoptosis in keloid fibroblasts. They can inhibit the activity of keloid fibroblasts by blocking TGF-β1 binding to its receptor and then regulating the expressions of NF-κB, CTGF and TβRII.     

人胃癌血管特异性结合多肽的体内筛选及其三维结构模拟的初步分析

目的: 利用噬菌体随机环七肽库在小鼠肾包膜下荷人胃癌模型体内筛选能够与人胃癌血管内皮细胞结合的特异性分子,对其多肽进行计算机空间结构模拟分析. 方法:制备免疫抑制小鼠肾包膜下人胃癌移植瘤模型,用随机环七肽库在其体内进行4轮筛选,对随机获得的14个克隆进行测序. 通过细胞ELISA检测所得到的特异性小肽在脐静脉内皮细胞(HUVEC),SGC7901,LoVo,Eca-109及Hep-G2细胞系上的结合能力. 并通过计算机分子模拟多肽CGNSNPKSC的空间结构. 结果:成功获得14个噬菌体克隆,并呈现出2种氨基酸序列,其中多肽CGNSNPKSC,相比于对照细胞SGC7901, LoVo, Eca-109, Hep-G2,其同HUVEC结合能力明显增强. 利用计算机技术成功地模拟并分析了该多肽的空间结构. 结论:多肽CGNSNPKSC同血管内皮细胞结合能力较强;空间结构稳定,是一个高亲水多肽,更容易形成折曲的抗原表位,很有可能是一个极具肿瘤血管靶向治疗前景的多肽.     

噬菌体肽库在筛选及鉴定高转移性肝癌特异性结合肽中的应用及其意义

目的:探讨噬菌体环七肽库在筛选与肝癌高转移细胞株HCCLM3特异高效结合的短肽中的应用,为进一步探索肝癌转移的分子机制和寻找肝癌转移标志物奠定基础。方法:以人肝癌高转移细胞株HCCLM3为靶细胞、人肝癌低转移细胞株SMMC7721为吸附细胞对噬菌体环七肽库进行4轮差减筛选,采用ELISA方法进一步筛选出与HCCLM3细胞高度亲和的阳性克隆(即实验组A450nm值高于对照组3倍以上),并利用免疫细胞化学方法鉴定噬菌体阳性克隆的特异性并测序。结果:经过4轮陶筛后,噬菌体在筛选靶细胞上出现明显富集,且逐轮提高(P<0.05);利用ELISA法对筛选后随机挑取的20个噬菌体克隆进行初步鉴定,得到6个能与肝癌细胞HCCLM3亲和度较高的阳性克隆(C4、C6、C7、C10、C11和C17);通过免疫细胞化学染色鉴定阳性克隆靶向肝癌细胞HCCLM3的特异性,与对照组比较,C7噬菌体对高转移潜能肿瘤细胞具有较高特异性(P<0.05);测序显示6个阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论:利用噬菌体环七肽库筛选得到与人肝癌高转移细胞株HCCLM3具有较高亲和力的多肽。     

利用Sm抗原模拟表位肽构建狼疮样鼠模型

目的利用Sm抗原模拟表位肽免疫BALB/C小鼠,构建狼疮样鼠模型。方法用鼠Sm单克隆抗体对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选,将筛选的噬菌体阳性克隆行双抗体夹心ELISA检测、DNA序列测定并推导其氨基酸序列,初步确定Sm抗原模拟表位;进而用混合噬菌体阳性克隆皮下免疫BALB/C小鼠,ELISA法检测小鼠血清IgG型抗Sm抗体、抗双链DNA（dsDNA）抗体和抗核抗体（ANA）水平;直接免疫荧光检测小鼠肾脏IgG型免疫复合物的沉积以及HE染色观察小鼠肾脏组织病理损伤情况。结果免疫筛选获得的5个ELISA强阳性的噬菌体克隆的氨基酸序列IR、SQ、PP出现频率增加;实验组小鼠血清中第28天出现Sm抗体、dsDNA抗体、ANA抗体,且滴度不断升高;第33天出现蛋白尿;肾脏可以检测到IgG型免疫复合物沉积及明显的肾脏病理改变。对照组小鼠无明显自身抗体产生和肾脏病变。结论利用Sm抗原噬菌体模拟表位肽可成功构建狼疮样小鼠模型。     

噬菌体肽库在筛选及鉴定高转移性肝癌特异性结合肽中的应用及其意义

目的：探讨噬菌体环七肽库在筛选与肝癌高转移细胞株HCCLM3特异高效结合的短肽中的应用,为进一步探索肝癌转移的分子机制和寻找肝癌转移标志物奠定基础。方法：以人肝癌高转移细胞株HCCLM3为靶细胞、人肝癌低转移细胞株SMMC7721为吸附细胞对噬菌体环七肽库进行4轮差减筛选,采用ELISA方法进一步筛选出与HCCLM3细胞高度亲和的阳性克隆（即实验组A450nm值高于对照组3倍以上）,并利用免疫细胞化学方法鉴定噬菌体阳性克隆的特异性并测序。结果：经过4轮陶筛后,噬菌体在筛选靶细胞上出现明显富集,且逐轮提高（P<0.05）;利用ELISA法对筛选后随机挑取的20个噬菌体克隆进行初步鉴定,得到6个能与肝癌细胞HCCLM3亲和度较高的阳性克隆（C4、C6、C7、C10、C11和C17）;通过免疫细胞化学染色鉴定阳性克隆靶向肝癌细胞HCCLM3的特异性,与对照组比较,C7噬菌体对高转移潜能肿瘤细胞具有较高特异性（P<0.05）;测序显示6个阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论：利用噬菌体环七肽库筛选得到与人肝癌高转移细胞株HCCLM3具有较高亲和力的多肽。     

转化生长因子β1噬菌体模拟肽抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的实验研究

目的 从噬菌体随机12肽库中筛选获得转化生长因子(TGF)β1噬菌体模拟肽,评估其抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的作用.方法 以人TGF-β1单克隆抗体为靶,生物淘选噬菌体模拟肽.噻唑蓝(MTT)比色法定量测定活细胞的数量.Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测对成纤维细胞的凋亡作用.免疫荧光测定检测模拟肽与成纤维细胞的亲和力.实时定量PCR分析方法检测成纤维细胞核因子κB(NF-κB),结缔组织生长因子(CTGF)的表达水平.结果 共获得10种噬菌体模拟肽,具有与TGF-β1、TGF-β2、TGF-β受体Ⅱ(TβRⅡ)、TGF-β诱导因子、NF-κB或细胞分裂原素活化蛋白激酶(MAPK)相似的序列.MTT比色测定结果显示4种(第7～10组)噬菌体模拟肽组能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖(P＜0.05).免疫荧光测定显示是噬菌体上的模拟肽,而不是噬菌体本身,能够与瘢痕疙瘩成纤维细胞相结合;凋亡实验显示这4种噬菌体模拟肽能够轻度促使瘢痕疙瘩成纤维细胞发生轻度的晚期凋亡;实时定量PCR的结果显示这4种噬菌体模拟肽NF-κB的表达降低,表达量分别是阴性对照组的0.28、0.26、0.46、0.30倍,4种噬菌体模拟肽CTGF的表达降低,表达量分别是阴性对照组的0.26、0.60、0.34、0.17倍.结论 噬菌体模拟肽可能是通过调节NF-κB及CTGF的表达,调节瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖.     

大肠癌噬菌体展示肽库的构建及大肠癌早期检测分子的筛选

目的构建大肠癌噬菌体展示肽库,筛选用于大肠癌早期检测的分子标志。方法选取30例第二军医大学长海医院肛肠外科手术后立刻冻存的大肠癌组织标本构建T7噬菌体展示肽库;用结合protein-A/G的琼脂糖珠分别富集大肠癌组及非肿瘤对照组血清中的抗体进行5轮亲和筛选,富集大肠癌相关肽;随机挑取5轮筛选后的2000个噬菌体克隆,用ELISA方法进一步筛选与大肠癌患者血清和对照血清反应性存在差异的大肠癌相关标志物克隆,进行基因序列测定。应用通过Chilibot文献挖掘方法预测各克隆的蛋白功能,反证筛选结果。结果 (1)所建大肠癌噬菌体展示肽库的滴度为3.0×106pfu,经PCR鉴定其重组率为60%,库容为1.8×106pfu。(2)共筛选出18个有意义的噬菌体,测序后,预测其蛋白功能,其中12个与肿瘤的发生相关。结论应用ELISA对肿瘤重组抗原的噬菌体展示肽库进行筛选的方法 ,可以用来发现差异表达的抗原。所筛选出的噬菌体克隆所表达的抗原可用于早期筛检大肠癌。     

食管癌组织中VEGF-C 表达量与淋巴管新生及 肿瘤组织生长的相关性

目的 研究食管癌组织中血管内皮生长因子C（VEGF-C）表达量与淋巴管新生、肿瘤组织生长的 相关性。方法 选取2012 年4 月-2015 年10 月在河北大学附属医院手术切除的食管癌组织作为临床标本,采 用免疫组织化学试剂盒对食管癌组织中VEGF-C、D2-40 进行染色,判读VEGF-C 的阳性表达率以及D2- 40 阳性表达的淋巴管密度（LVD）;采用荧光定量聚合酶联反应试剂盒测定Ki-67、Cyclin B1 的mRNA 含量。 结果 低未分化、TNM Ⅲ、Ⅳ、有淋巴结转移的食管癌组织中VEGF-C 阳性率、LVD 以及Ki-67、Cyclin B1 的mRNA 含量均高于中高分化、TNM Ⅰ、Ⅱ期、无淋巴结转移的食管癌组织;VEGF-C 阳性表达的食管 癌组织中LVD 以及Ki-67、Cyclin B1 的mRNA 含量均高于VEGF-C 阴性表达的食管癌组织。结论 食管癌 组织中高表达的VEGF-C 与淋巴管新生以及肿瘤组织生长密切相关。     

利用噬菌体肽库筛选可结合TNF—α的短肽序列

目的 对噬菌体环七肽库进行筛选。寻求可拮抗肿瘤坏死因子a(TNF-α）活性的小分子短肽。方法 以rhTNF-α为靶筛选噬菌体环七肽库，双夹心ELISA鉴定阳性克隆。结果 ELISA鉴定随机挑选经3轮筛选后所得23个噬菌体克隆发现，其中11个克隆显示与TNF-α有较强的结合，DNA测序发现其中两个克隆的氨基酸序列为：c-ALWHWWH-c,另9个克隆序列为：c-(T/S)WLHWWA-c。结论 噬菌体克隆展示肽能够模拟TNF-α受体或抗体的结合表位，为TNFα结合肽。