西地那非促进体外培养大鼠骨髓间充质干细胞的成骨性分化

目的研究西地那非对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(Rat bone marrow stromal stem cells,rBMSCs)增殖与成骨性分化的影响。方法取大鼠股骨及胫骨全骨髓,贴壁筛选法培养rBMSCs,每3天换液1次,9d后传代培养。采用终浓度分别为1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mol·L-1的西地那非进行药物干预,MTT法检测细胞增殖率,同时检测成骨性诱导培养后9d的碱性磷酸酶(ALP)活性,筛选出最佳浓度。以最佳药物浓度干预rBMSCs的成骨性分化,比较西地那非组和不加药的对照组之间的钙化结节数量及阳性克隆数(colonies stained positive for alkaline phosphatase,CFU-FALP);提取Total RNA,Real-Time PCR检测Runx-2与Osterix mRNA的表达情况;Western blot法检测Ⅰ型胶原蛋白的分泌量。结果西地那非剂量依赖性抑制细胞的增殖,但可强烈促进成骨性分化,最佳药物浓度为1×10-5mol·L-1。该浓度下的西地那非可明显增加钙化结节和CFU-FALP数量,促进与成骨相关的转录因子Runx-2与Osterix mRNA的表达,同时也可增强Ⅰ型胶原蛋白的分泌。结论浓度为1×10-5mol·L-1的西地那非可明显促进rBMSCs的成骨性分化,提示西地那非在具备其他药理作用的同时,也有较强的抗骨质疏松活性,具备开发为抗骨质疏松药物的潜力。     

蛇床子素对体外培养骨髓基质干细胞增殖与成骨性分化的影响

目的研究蛇床子素对体外培养大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)增殖与成骨性分化的影响。方法取大鼠股骨及胫骨全骨髓,利用全骨髓培养法培养单核层细胞,培养于含10%FBS的DMEM-F12培养液中,3d后首次换液,9d后传代培养。培养基中蛇床子素终浓度分别为1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mol·L-1。增殖分析采用MTT法,于成骨性诱导培养d4、8、12、16测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量,d15进行钙化结节组织化学染色及计数。成骨性诱导后不同时间点提取Total RNA,RTReal-Time PCR法检测bFGF、IGF-1、Osterix与Runx-2的基因表达情况。结果蛇床子素剂量依赖性抑制BMSCs增殖,但能明显促进其向成骨性分化,表现为提高BMSCs的ALP活性、促进骨钙素分泌、钙盐沉积量、增加钙化结节数量、提高bFGF、IGF-1、Osterix和Runx-2的mRNA表达水平。结论终浓度为1×10-5mol·L-1蛇床子素能明显促进BMSCs的成骨性分化,证明蛇床子素是中药蛇床子抗骨质疏松的有效成分。     

8-异戊烯基柑橘素和柑橘素对体外培养大鼠股骨组织代谢活性的影响

目的：比较研究8一异戊烯基柑橘素和柑橘素对体外培养大鼠股骨组织代谢活性的影响。方法：体外分离培养大鼠股骨组织,然后随机分为4组,其中3组分别给予雌二醇（终浓度为1×10^-8mol·L^-1）、8-异戊烯基柑橘素（终浓度为1×10^-8mol·L^-1）和柑橘素（终浓度为1×10^-5mol·L^-1）,另外1组加生理盐水作为对照。分别在培养的第3、6、9、12、15和18d测定大鼠股骨组织中碱性磷酸酶活性和钙含量,并采用RT—PCR检测骨保护素、I-型胶原、Runx-2和骨形态发生蛋白基因的mRNA表达水平。结果：8-异戊烯基柑橘素、柑橘素和雌二醇均可提高股骨组织中碱性磷酸酶的活性,增加钙含量,并上调opg、bmp-2、collagen-1,和runx-2mRNA的表达水平;8-异戊烯基柑橘素活性强于柑橘素。结论：8-异戊烯基柑橘素和柑橘素均能改善体外培养大鼠股骨组织的代谢活性。     

骨形态发生蛋白-13促进小鼠骨髓干细胞的软骨分化

目的:研究骨形态发生蛋白-13对小鼠骨髓基质干细胞向软骨分化过程的作用。方法:体外培养小鼠骨髓基质干细胞(MSCs),贴壁细胞传代,取第3代细胞,用骨形态发生蛋白-13溶液干预培养1,4,7,14 d取样检测。倒置相差显微镜观察细胞形态;RT-PCR,western-blot和免疫细胞化学法检测不同时期Ⅱ型胶原,SOX9,阿尔辛蓝(Alcian)染色蛋白多糖。结果:Ⅱ型胶原和SOX9之mRNA和蛋白的表达在第4天开始出现并不断升高;Alcian染色结果显示骨形态发生蛋白-13诱导细胞分泌蛋白多糖基质,可见细胞小结区域呈明显的异染性。结论:骨形态发生蛋白-13可以定向诱导小鼠骨髓干细胞的软骨分化。     

木香烃内酯对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成骨性分化的影响

目的 研究木香烃内酯对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨性分化的影响.方法 取SPF级SD大鼠股骨及胫骨全骨髓,利用全骨髓贴壁培养法进行BMSCs原代细胞培养.将培养后的细胞分为木香烃内酯组(用10-5～10-8 mol/L木香烃内酯干预)和对照组(用等体积二甲基亚砜木香烃内酯载体溶液干预).干预9 d后检...     

小檗碱对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨小檗碱对体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法应用MTT法检测不同浓度小檗碱对骨髓间充质干细胞增殖情况的影响,以对硝基苯磷酸盐法检测碱性磷酸酶活性,等离子体直读光谱仪检测钙沉积,放射免疫法检测骨钙素含量,茜素红法染色观察钙化结节形成。结果小檗碱在1×10-9～1×10-5mol.L-1浓度范围对骨髓间充质干细胞增殖无明显影响。小檗碱浓度为1×10-7和1×10-6mol.L-1培养3～7d能明显提高骨髓间充质干细胞内碱性磷酸酶活性。小檗碱在1×10-7～1×10-5mol.L-1浓度范围培养22d能明显促进骨髓间充质干细胞骨钙素合成和分泌。小檗碱在浓度为1×10-6和1×10-5mol.L-1培养28d时钙盐沉积量和钙化结节形成增加。结论小檗碱可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化,增强骨钙化。这可能为其防治骨质疏松的机制之一。     

胰高血糖素样肽-1及其类似物EX-4促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化

目的:观察胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其受体激动剂exendin-4(EX-4)对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与成骨分化的影响。方法:取大鼠股骨和胫骨全骨髓,采用贴壁法分离BMSCs并传代至第三代,培养2d后分成4组:BMSC组、诱导成骨组(osteoblast induced medium,OIM组)和诱导加药组,诱导加药组细分为GLP-1(10-9~10-7 mol/L)或EX-4(10-9~10-7 mol/L)的不同浓度组,MTT法检测细胞增殖能力;测定碱性磷酸酶(ALP)活性;通过ALP染色及茜素红染色观察药物诱导BMSCs向成骨细胞分化、矿化的效果;采用RT-PCR方法检测ALP和Runx2成骨相关基因的表达情况。结果:与诱导对照组相比,GLP-1及EX-4各浓度处理组呈剂量依赖性显著促进细胞增殖(P<0.05);ALP染色与茜素红染色结果显示,对照组无显色或显色不明显,而GLP-1及EX-4组均有阳性显色。GLP-1及EX-4可以显著提高ALP活性,并提高Runx2、ALP的表达水平。结论:GLP-1及EX-4不仅能够直接促进BMSCs增殖,并促进其向成骨细胞分化,GLP-1及EX-4可能在骨重建中发挥重要的作用。     

Beagle犬牙周韧带成纤维细胞和骨髓基质细胞体外成骨再生潜能的比较

目的 比较Beagle犬牙周韧带成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts cells, PDLFs)和骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)体外成骨潜能,为筛选合适的种子细胞促进牙周组织再生提供实验依据。方法 体外通过茜素红染色、Realtime-PCR比较两种细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)及骨保护素(osteoprotegerin, OPG)的表达。结果 茜素红染色显示PDLFs成骨能力高于BMSCs; Realtime-PCR显示,PDLFs的OPG表达量高于BMSCs,差别有统计学意义(P<0.05);PDLFs的ALP表达量虽低于BMSCs,但两者之间差别无统计学意义(P>0.05)。结论 PDLFs体外成骨潜能不低于BMSCs。     

美洲大蠊提取物对大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化诱导作用

目的 测定4种美洲大蠊提取物对大鼠骨髓间充质干细胞(bMSCs)的成骨分化诱导作用。方法 用4种提取物分别对bMSCs进行诱导培养。14 d后,用qPCR测定I型胶原α1和碱性磷酸酶的基因转录水平,比色法测定碱性磷酸酶的活性,免疫细胞化学法检测骨钙素、骨桥蛋白的水平。21 d后,用茜素红染色观察钙化结节的形成情况。结果 与对照组比较,4种美洲大蠊提取物各处理组检测出的成骨分化指标均有不同程度升高,某些浓度下差异显著。其中,XD02的诱导效果最好,且细胞毒性最小。结论 4种美洲大蠊提取物均具诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。美洲大蠊提取物有望成为干预骨质疏松的营养添加剂或药物。     

碱性成纤维细胞生长因子对非贴壁骨髓基质前体细胞增殖及分化作用的研究

目的　探讨碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对非贴壁骨髓前体细胞的增殖及分化作用。方法　分离骨髓前体细胞体外培养 ,用碱性磷酸酶化学染色及图像分析仪测定细胞克隆数 ;采用免疫组化 (ABC法 )检测PCNA、Ⅰ型胶原、钙及骨钙素。研究bFGF对非贴壁前体细胞的促增殖及分化作用。结果　骨髓细胞中许多基质前体细胞以非贴壁前体细胞 (NASP)形式存在 ,bFGF不仅能促进其增殖 ,而且能诱导其向成骨细胞分化。结论　bFGF主要作用于非贴壁生长的基质前体细胞 :能增加骨细胞的数量 ,促进骨样组织形成 ,为临床用bFGF治疗骨折、骨不连提供理论依据。     

大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化的体外诱导动态观察

目的 动态观察体外定向诱导大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)分化为神经细胞的时程变化。方法 采用Percoll-Paque液(1．073g／ml)分离BMSCs体外扩增培养后，加入丁羟茴醚 二甲基亚砜诱导其分化为神经细胞，分别于1、2、3、4h后光镜下观察形态变化及通过免疫组化和免疫荧光染色测定特异性神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数。结果 BMSCs在加入诱导剂后1h出现胞体收缩，突起伸出，有不同程度NSE、NF、GFAP表达，3h后汰高峰。结论 丁羟茼醚 二甲基亚砜在一定时间内是一种较好的体外诱导剂。     

淫羊藿苷对体外在无地塞米松培养基中诱导培养大鼠骨髓基质细胞成骨性分化的影响

目的：探讨在无地塞米松（dexamethasone）时淫羊藿苷（icariin,ICA）对体外培养大鼠骨髓基质细胞成骨性分化的影响,并试图寻找一种新的或更强的促体外培养骨髓基质细胞成骨性分化的诱导剂。方法用1×10－5 mol·L －1淫羊藿苷或1×10－8 mol·L －1的地塞米松对大鼠骨髓基质细胞分别进行药物干预,细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测细胞增殖,碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,茜素红染色检测钙化结节数量,实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨保护素（osteoprotegerin,OPG）、核因子-κB 受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand, RANKL）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）的信使 RNA（mRNA）表达情况。结果1×10－5 mol·L －1淫羊藿苷在无地塞米松的培养基中能显著提高大鼠骨髓基质细胞 ALP 活性;明显增加大鼠骨髓基质细胞钙化结节数目;显著上调BMP、OPG mRNA 水平以及 OPG／RANKL mRNA 比值。结论淫羊藿苷可能是一种潜在的促体外培养大鼠骨髓基质细胞成骨性分化的新诱导剂。     

In vitro effects of benzene metabolites on mouse bone marrow stromal cells

Benzene exposure can result in bone marrow myelotoxicity. We examined the effects of benzene metabolites on bone marrow stromal cells of the hemopoietic microenvironment. Male B6C3F1 mouse bone marrow adherent stromal cells were plated at 4 X 10(6) cells per 2 ml of DMEM medium in 35-mm tissue culture dishes. The growing stromal cell cultures were exposed to log 2 doses of five benzene metabolites: hydroquinone, benzoquinone, phenol, catechol, or benzenetriol for 7 days. The dose which caused a 50% decrease in colony formation (TD50) was 2.5 X 10(-6) M for hydroquinone, 17.8 X 10(-6) M for benzoquinone, 60 X 10(-6) M for benzenetriol, 125 X 10(-6) M for catechol, and 190 X 10(-6) M for phenol. We next examined the effect of benzene metabolites on the ability of stromal cells to influence granulocyte/monocyte colony growth (G/M-CFU-C) in a coculture system. Adherent stromal cells were plated and incubated for 14 days and then exposed to a benzene metabolite. After 3 days the medium and metabolite were removed and an agar:RPMI layer containing 10(6) fresh bone marrow cells was placed over the stromal layer. After incubation for 7 days the cultures were scored for G/M colony formation. Hydroquinone and benzoquinone were most toxic, while catechol and benzenetriol inhibited colony growth only at high doses. These results indicate that injured bone marrow stromal cells may be a significant factor in benzene-induced hemotoxicity.     

烧伤小鼠血清对离体培养的骨髓基质细胞的影响

目的　研究小鼠烧伤血清对离体培养的骨髓基质细胞的影响。方法　利用流式细胞仪、HE染色等技术观察小鼠烧伤后不同时间的血清对小鼠骨髓基质细胞 (BMSC)贴壁率和基质祖细胞 (CFU F)集落形成的作用及对不同剂量的6 0 Coγ射线体外照射后的BMSC的影响。结果　小鼠烧伤后 1～ 11d的血清对基质细胞贴壁率和CFU F的形成主要表现为抑制作用 ,13～ 15d的血清主要表现为刺激作用。小鼠烧伤后 15d的血清可明显减少 5 0、70Gy照射后BMSC的凋亡和坏死。 结论　小鼠烧伤后不同时间的血清对BMSC的作用不同 ,可能与血清内细胞因子的变化有关。     

家兔克隆骨髓基质细胞的体外培养

目的 探讨家兔骨髓基质细胞在体外传代的培养.方法 取家兔股骨骨髓,分离骨髓基质细胞,于1640培养体系中培养,之后固定计数.结果 在2～6×106 个/cm2范围内,其接种细胞数与所形成的克隆集落(CFU-F)数呈良好线性关系.随着培养时间的延长,克隆集落也增多,变大.3周龄家兔的造血基质祖细胞较6周龄者为多.结论 基质祖细胞CFU-F呈非均质性的,可能存在不同亚群.     

阿伦磷酸钠对小鼠骨髓基质细胞成骨和成脂分化的影响

目的在离体条件下研究阿伦磷酸钠对小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)成骨和成脂分化的影响。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测阿伦磷酸钠对骨髓基质细胞增殖的影响,碱性磷酸酶(ALP)活性测定法检测阿伦磷酸钠对骨髓基质细胞(MSCs)成骨分化的影响,油红O染色形态学及定量测定法检测阿伦磷酸钠对骨髓基质细胞成脂分化的影响。结果1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6和1×10-5mol.L-1的阿伦磷酸钠可以促进小鼠原代骨髓基质细胞增殖,抑制骨髓基质细胞的成骨分化及成脂分化。结论阿伦磷酸钠对骨质疏松症的预防和治疗作用可能通过抑制骨髓基质细胞的成脂分化,进而减少脂肪细胞细胞因子的分泌而抑制破骨细胞的形成、激活以及骨吸收功能。